十種食源性致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法

張明娟，劉明明，余秋地，袁磊，王娟，秦愛(ài)，李根容

(重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，重慶，400020)

食源性疾病是指通過(guò)攝食而進(jìn)入人體的有毒有害物質(zhì)等致病因子所造成的疾病，是食品安全的主要問(wèn)題之一，世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，全球平均每年有上億腹瀉病例，食源性疾病患者數(shù)以?xún)|計(jì)，其中超70%食源性疾病由致病微生物引起[1-2]。因此，食源性致病菌仍是目前引起食源性疾病的主要原因，如何準(zhǔn)確、快速、靈敏地檢測(cè)食源性致病菌已成為控制食品安全問(wèn)題的關(guān)鍵[3]。

目前，我國(guó)開(kāi)展食品中食源性致病菌監(jiān)測(cè)工作主要涉及的檢測(cè)指標(biāo)有沙門(mén)氏菌屬、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌屬、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌O157∶H7、克羅諾桿菌屬、銅綠假單胞菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等，依據(jù)GB 4789系列和GB 8538標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)方法主要是傳統(tǒng)培養(yǎng)法，包括細(xì)菌培養(yǎng)、生理生化鑒定等過(guò)程，其檢測(cè)周期較長(zhǎng)，操作較繁瑣復(fù)雜，且檢測(cè)時(shí)易受微生物生長(zhǎng)情況影響，上述方法已不能滿(mǎn)足我國(guó)公共衛(wèi)生突發(fā)事件應(yīng)急檢測(cè)的需要[2,4]，因此，建立一種高通量、準(zhǔn)確、快速的致病菌檢測(cè)方法顯得十分重要。

多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與常規(guī)PCR相同，區(qū)別在于多重PCR技術(shù)在同一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對(duì)或以上引物，分別擴(kuò)增不同的模板，得到不同的目的片段，實(shí)現(xiàn)了一次性檢測(cè)多個(gè)基因的目的[5-7]，可以節(jié)省檢測(cè)時(shí)間和費(fèi)用成本，因此具有很好的發(fā)展前景。本研究旨在建立一種高通量、快速、準(zhǔn)確、靈敏的十重PCR檢測(cè)方法，在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢出沙門(mén)氏菌屬、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌屬、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌O157：H7、克羅諾桿菌屬、銅綠假單胞菌、糞鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，以應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)工作，解決現(xiàn)有技術(shù)操作較為繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題，為監(jiān)管部門(mén)開(kāi)展食源性致病菌監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品與菌株

預(yù)包裝的牛肉干、海苔、巧克力、面包、椰汁、雞精、奶粉、礦泉水樣品，市售。實(shí)驗(yàn)用菌株見(jiàn)表1。

1.1.2 試劑

10×PCR buffer、2×Multiplex PCR Master Mix、d NTPs、TaqDNA聚合酶、HSTaqDNA酶、Mg2+(濃度25 mmol/L)、DNA Marker(100、50 bp)、ddH2O、瓊脂糖、50×TAE、核酸染料、溶菌酶、6×甘油凝膠上樣緩沖液，生工生物工程(上海)股份有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂、腦心浸液肉湯、細(xì)菌瓊脂粉、胰蛋白胨大豆瓊脂、無(wú)菌脫纖維羊血、蛋白胨、緩沖蛋白胨水、7.5% NaCl肉湯、LB肉湯、改良EC肉湯、3% NaCl堿性蛋白胨水、營(yíng)養(yǎng)肉湯、志賀氏菌增菌液、腸道增菌液、平板計(jì)數(shù)瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；牛肉浸粉，青島海博生物技術(shù)有限公司；NaCl，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株名稱(chēng)、編號(hào)及來(lái)源Table 1 Name, number and source of experimental strains

1.2 儀器與設(shè)備

TCEN-24R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、MiniT-H3金屬浴，杭州奧盛儀器有限公司；BJC2-60L-D超純水儀，重慶華創(chuàng)水處理工程有限公司；Gel DocTMEZ凝膠成像系統(tǒng)、DowerDacTMBasic電泳儀及水平電泳槽、T100型PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；NanoDrop ONEc超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo公司；DW-86L388A超低溫冰箱，北京海爾公司；DRP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MIX-3000旋渦混合器，上海Gallop Instruments公司；ME403電子天平，瑞士Mettler-Toledo公司；AC2-6S1生物安全柜，新加坡ESCO公司；SQ810C高壓滅菌鍋，重慶雅馬拓科技有限公司；7 L MGC厭氧培養(yǎng)盒，日本三菱公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及合成

分析細(xì)菌種屬間的差異，選擇特異的保守基因做為檢測(cè)目的基因[8-21]；在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上下載目的基因的核酸序列，將目標(biāo)基因的核酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，驗(yàn)證其特異性；通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件Premier 6.0針對(duì)其目的基因的序列差異處設(shè)計(jì)引物；選擇特異性較高、長(zhǎng)度在18～30 bp、退火溫度Tm值接近、引物間二級(jí)結(jié)構(gòu)較少且十對(duì)引物所擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度差異不低于50 bp的引物組，引物組信息見(jiàn)表2。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司代為合成，引物純化方式為iPAGE，引物合成之后用ddH2O稀釋到濃度10 μmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 十對(duì)引物組、目的基因和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 2 Ten pairs of primer sets, target genes and amplification product length

1.3.3 引物特異性驗(yàn)證

以表1中標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA為模板，分別對(duì)上述10對(duì)引物進(jìn)行單重PCR特異性驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μL，正反引物(10 μmol/L)各0.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，DNA模板1.0 μL，Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL，ddH2O補(bǔ)充至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取8 μL用于瓊脂糖凝膠電泳分析(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%)，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。

1.3.4 引物靈敏性驗(yàn)證

以標(biāo)準(zhǔn)菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC 19115、糞鏈球菌ATCC 29212、產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC 13124、腸炎沙門(mén)氏菌CICC 21482、阪崎克羅諾桿菌CICC 21544、福氏志賀氏菌CICC 21534、金黃色葡萄球菌CICC 21600、副溶血性弧菌CICC 21617、大腸埃希氏菌O157∶H7 CICC 21530的基因組DNA為模板，用ddH2O進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)⑦M(jìn)行相應(yīng)的單重PCR體系擴(kuò)增，驗(yàn)證引物的靈敏度。

1.3.5 多重PCR條件優(yōu)化

以標(biāo)準(zhǔn)菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC 19115、糞鏈球菌ATCC 29212、產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC 13124、腸炎沙門(mén)氏菌CICC 21482、阪崎克羅諾桿菌CICC 21544、福氏志賀氏菌CICC 21534、金黃色葡萄球菌CICC 21600、副溶血性弧菌CICC 21617、大腸埃希氏菌O157∶H7 CICC 21530的基因組DNA為模板構(gòu)建多重PCR反應(yīng)體系。多重PCR反應(yīng)基本體系：2×Multiplex PCR Master Mix 25 μL，正反引物(10 μmol/L)各0.5 μL，HSTaqDNA酶(5 U/μL)1 μL，DNA模板均1.0 μL，補(bǔ)充ddH2O至50 μL；多重PCR反應(yīng)基本條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳分析條件：核酸染料10 μL/100 mL，電泳液1×TAE，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣量25 μL，電壓220 V，電泳時(shí)間約40 min。

1.3.5.1 退火溫度優(yōu)化

在多重PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入10對(duì)引物組和10種標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組模板DNA，分別設(shè)置退火溫度為55.0、55.7、56.9、58.8、61.1、63.0、64.3、65.0 ℃進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。

在多重PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入10對(duì)引物組，分別加入1種標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組模板DNA，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。

1.3.5.2 引物濃度優(yōu)化

采用優(yōu)化的退火溫度及固定的模板量(50 ng)，分別設(shè)置引物濃度為20、40、60、80、100 nmol/L進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。

1.3.5.3 模板量?jī)?yōu)化

采用優(yōu)化的退火溫度及引物濃度，分別設(shè)置模板量為10、25、50 ng進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。

1.3.6 多重PCR體系特異性驗(yàn)證

以標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA為模板，依據(jù)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中各類(lèi)樣品需檢測(cè)的致病菌類(lèi)型組合，分組加入10對(duì)特異性引物進(jìn)行以?xún)?yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系及條件多重PCR擴(kuò)增，分組信息見(jiàn)如表3。

表3 致病菌類(lèi)型組合分組Table 3 Grouping of pathogen type combinations

1.3.7 多重PCR體系靈敏度驗(yàn)證

分別以標(biāo)準(zhǔn)菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC 19115、糞鏈球菌ATCC 29212、產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC 13124、腸炎沙門(mén)氏菌CICC 21482、阪崎克羅諾桿菌CICC 21544、福氏志賀氏菌CICC 21534、金黃色葡萄球菌CICC 21600、副溶血性弧菌CICC 21617、大腸埃希氏菌O157∶H7 CICC 21530的基因組DNA為模板，用ddH2O進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)詢(xún)?yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系及條件進(jìn)行多重PCR，驗(yàn)證體系的靈敏度。

1.3.8 多重PCR檢測(cè)方法初步應(yīng)用

不同基質(zhì)對(duì)于細(xì)菌的培養(yǎng)以及基因組DNA提取均會(huì)產(chǎn)生不同影響，選取不同基質(zhì)、不同污染菌株的人工污染的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證該多重PCR方法檢測(cè)的靈敏度。

1.3.8.1 人工污染菌株培養(yǎng)及計(jì)數(shù)

將標(biāo)準(zhǔn)菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC 19115、糞鏈球菌ATCC 29212、產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC 13124、腸炎沙門(mén)氏菌CICC 21482、阪崎克羅諾桿菌CICC 21544、福氏志賀氏菌CICC 21534、金黃色葡萄球菌CICC 21600、副溶血性弧菌CICC 21617、大腸埃希氏菌O157：H7 CICC 21530分別培養(yǎng)24 h，挑取菌落于無(wú)菌水中制成菌懸液，在相應(yīng)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h，對(duì)菌懸液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.3.8.2 人工污染方法

用無(wú)菌水分別將10株菌稀釋至106、105、104、103CFU/mL 4個(gè)濃度，每個(gè)稀釋度分別加入1 mL到10 g基質(zhì)中，補(bǔ)充增菌液體積至90 mL，具體分組及培養(yǎng)信息見(jiàn)表4。增菌后(36 ℃，24 h)分別吸取1 mL提取基因組DNA，以?xún)?yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系及條件進(jìn)行多重PCR，驗(yàn)證靈敏度。

表4 人工污染實(shí)驗(yàn)分組Table 4 Grouping of industrial pollution experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性

通過(guò)設(shè)計(jì)的10對(duì)特異性引物對(duì)表1中菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明1株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌株、7株沙門(mén)氏菌屬菌株、7株克羅諾桿菌屬菌株、4株志賀氏菌屬菌株、1株金黃色葡萄球菌菌株、1株副溶血性弧菌菌株、1株大腸埃希氏菌O157∶H7菌株、1株銅綠假單胞菌菌株、1株糞鏈球菌菌株、5株產(chǎn)氣莢膜梭菌種均擴(kuò)增出目的條帶，而其他陰性對(duì)照菌株均未擴(kuò)增出明顯的目的條帶，詳見(jiàn)電子增強(qiáng)出版附件(http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031352)。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳驗(yàn)證后，將其送到生工生物工程(上海)股份有限公司代為測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)與目的基因進(jìn)行序列對(duì)比，相似率均達(dá)到98%以上，擴(kuò)增產(chǎn)物均與目標(biāo)基因序列高度一致。結(jié)果表明本研究所設(shè)計(jì)的10對(duì)引物具有高度特異性。

2.2 引物靈敏度

通過(guò)PCR檢測(cè)，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌屬、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門(mén)氏菌屬、克羅諾桿菌屬、大腸埃希氏菌O157∶H7菌株的靈敏度分別為5.37×10-6、5.37×10-4、6.04×10-6、8.85×10-3、9.52×10-6、8.91×10-7、7.33×10-6、7.10×10-3、7.49×10-7、7.20×10-3ng/μL，引物均具有較高靈敏度。

2.3 多重PCR條件優(yōu)化

2.3.1 退火溫度優(yōu)化

當(dāng)退火溫度設(shè)置為55～65 ℃時(shí)，多重PCR均能擴(kuò)增出10條特異性目標(biāo)條帶，見(jiàn)圖1-a。

選擇55～65 ℃的平均值60 ℃作為退火溫度，在多重PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入10對(duì)引物組，分別加入1種標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，在僅加入糞鏈球菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌基因組DNA時(shí)出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1-b，因此，60 ℃作為退火溫度時(shí)，多重PCR體系特異性較差；將退火溫度增加至62 ℃，在多重PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入10對(duì)引物組，分別加入1種標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖1-c，10對(duì)特異性引物均只針對(duì)加入的模板擴(kuò)增出特異性條帶，無(wú)非特異擴(kuò)增，多重PCR體系特異性較好。因此，綜合選擇62 ℃作為本研究多重PCR體系的退火溫度。

a-溫度梯度PCR結(jié)果(M-100 bp Marker;1～8分別為55.0、55.7、 56.9、58.8、61.1、63.0、64.3、65.0 ℃)；b-退火溫度60 ℃; c-退火溫度62 ℃(M-100 bp Marker;1～11依次為大腸埃希氏菌 O157∶H7、糞鏈球菌、克羅諾桿菌屬、銅綠假單胞菌、 副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生 李斯特氏菌、沙門(mén)氏菌屬、志賀氏菌屬、CK)圖1 退火溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Results of annealing temperature optimization

2.3.2 引物濃度優(yōu)化

在退火溫度為62 ℃和模板量為50 ng時(shí)，不同引物濃度進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2，當(dāng)引物濃度為20 nmol/L時(shí)，無(wú)法完全擴(kuò)增出10個(gè)目的條帶，引物濃度為40 nmol/L時(shí)，可擴(kuò)增出10個(gè)條帶，但條帶較模糊，引物濃度在60～100 nmol/L時(shí)，均可擴(kuò)增出10條特異性目標(biāo)條帶，引物濃度在100 nmol/L時(shí)，10個(gè)目標(biāo)條帶均最清晰，因此，綜合選擇100 nmol/L作為本研究多重PCR體系的最佳引物濃度。

a-引物濃度20 nmol/L；b-引物濃度40 nmol/L；c-引物濃度60 nmol/L；d-引物濃度80 nmol/L；e-引物濃度100 nmol/L圖2 不同引物終濃度的多重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Multiplex PCR amplification results of different primer final concentrations注：M-100 bp Marker；泳道1、2為2個(gè)平行；泳道3為空白(下同)

2.3.3 模板量?jī)?yōu)化

在退火溫度為62 ℃引物濃度為100 nmol/L時(shí)，用不同模板量進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，當(dāng)模板量加入10 ng時(shí)，可擴(kuò)增出10個(gè)條帶，但分子量較低的條帶較模糊，當(dāng)模板量為25、50 ng均可擴(kuò)增出清晰的產(chǎn)物條帶，模板量為50 ng時(shí)，10個(gè)目標(biāo)條帶均最清晰，結(jié)果見(jiàn)圖3。因此，綜合選擇50 ng作為本研究多重PCR體系的最佳模板量。

2.4 多重PCR體系特異性驗(yàn)證

1～8組分組實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，均只擴(kuò)增了目標(biāo)菌特異性條帶，無(wú)非特異擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖4。因此，本研究建立的多重PCR檢測(cè)體系具有較好的特異性。

a-模板量10 ng；b-模板量25 ng；c-模板量50 ng圖3 不同模板量的多重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Multiplex PCR amplification results with different template amounts

a～h分別為致病菌分組1～8圖4 多重PCR體系特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Verification results of specificity of multiplex PCR systems注：M-100 bp Marker；泳道1～3為3個(gè)平行

2.5 多重PCR體系靈敏度驗(yàn)證

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門(mén)氏菌屬、克羅諾桿菌屬、志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌O157∶H7、銅綠假單胞菌菌株的靈敏度分別為5.37×10-2、5.37×10-2、8.85×10-1、8.91×10-1、7.33×10-1、7.10×10-1、7.49×10-2、6.04×10-2、7.20×10-2、9.52×10-2ng/μL，所有菌株的靈敏度均達(dá)到10-1ng/μL，該多重PCR體系具有較高的靈敏度。

2.6 多重PCR檢測(cè)方法初步應(yīng)用

通過(guò)人工污染樣品評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本研究涉及的10種致病菌在增菌后檢測(cè)靈敏度均能達(dá)到10 CFU/mL以上，且擴(kuò)增條帶清晰明顯，擴(kuò)增效果好，結(jié)果見(jiàn)圖5。本研究建立的十重PCR檢測(cè)方法對(duì)食品樣品進(jìn)行前增菌處理后，可滿(mǎn)足檢驗(yàn)需要。

a～i分別為人工污染樣品組1～9圖5 人工污染樣品靈敏度評(píng)價(jià)結(jié)果Fig.5 Evaluation results of sensitivity of artificially contaminated samples注：M-100 bp Marker；泳道5～8-菌液濃度為101、 102、103、104 CFU/mL

3 結(jié)論與討論

本研究建立了一種能夠在同一PCR反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)單增細(xì)胞增生李斯特菌、沙門(mén)氏菌屬、克羅諾桿菌屬、志賀氏菌屬、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌O157∶H7、銅綠假單胞菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的多重PCR檢測(cè)方法，該方法具有快速、準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)化后多重PCR檢測(cè)體系的退火溫度為62 ℃，最佳模板量為50 ng，最佳引物濃度為100 nmol/L，在此優(yōu)化條件下，多重PCR反應(yīng)體系對(duì)10種致病菌的檢出限均可達(dá)10-1ng/μL，此外，應(yīng)用于人工污染樣品檢測(cè)，該方法經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單增菌后，10種致病菌的檢出限均可達(dá)10 CFU/mL，而一般食品受微生物污染后，大多會(huì)呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，繁殖較快，受污染的食品中微生物量極易達(dá)到或超過(guò)10 CFU/mL，且多數(shù)致病菌需要達(dá)到一定的數(shù)量才能致病，如GB 29921—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》中金黃色葡萄球菌的最大可允許超出值多為100 CFU/g，因此，該方法可滿(mǎn)足目前食品中食源性致病菌快速檢測(cè)需要。

相比于普通PCR方法，本研究建立的多重PCR檢測(cè)方法可以一次反應(yīng)檢測(cè)10種致病菌，極大地提高了檢測(cè)效率，降低了大量的人力、時(shí)間、試劑成本。相比于熒光定量PCR方法，本研究建立的方法所需儀器及試劑費(fèi)用上具有較大優(yōu)勢(shì)，不需要合成價(jià)格較貴的探針，檢驗(yàn)成本可減少2倍左右，且熒光定量PCR方法由于受熒光檢測(cè)通道的影響，一般只能同時(shí)擴(kuò)增至四重或者五重，使其在致病菌篩選中的應(yīng)用受到局限，無(wú)法滿(mǎn)足高通量檢測(cè)的需求，本研究建立的多重PCR檢測(cè)方法可避免此局限性。

本研究建立的多重PCR檢測(cè)方法只需要1次人工操作和1次PCR反應(yīng)，可將傳統(tǒng)微生物檢測(cè)中所需時(shí)間從2～7 d縮短至48 h內(nèi)，對(duì)于應(yīng)對(duì)食品安全突發(fā)事件，具有十分突出的意義，且本方法可同時(shí)快速檢測(cè)目前食品安全抽檢工作中涉及的10種食源性致病菌，與實(shí)際檢測(cè)工作聯(lián)系十分緊密，實(shí)用性較高，儀器、試劑成本較低，操作較簡(jiǎn)便，本方法在國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室較易普及推廣，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

本研究建立的多重PCR檢測(cè)方法仍需要通過(guò)增菌后才能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，這一步嚴(yán)重影響了多重PCR檢測(cè)效率，因此后期研究中需結(jié)合目標(biāo)菌的富集技術(shù)，以進(jìn)一步提高檢測(cè)效率，如磁珠富集和雙抗體富集技術(shù)等。此外，隨著多重PCR體系中引物對(duì)的增加，PCR產(chǎn)物條帶的不斷增加，為后續(xù)產(chǎn)物分離帶來(lái)了難點(diǎn)，因此多重PCR技術(shù)也可以結(jié)合除電泳技術(shù)以外的產(chǎn)物分離檢測(cè)技術(shù)，如發(fā)展比較成熟的液相、液質(zhì)技術(shù)等，以擴(kuò)大多重PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用范圍。