高親水性油茶籽蛋白對大豆蛋白凝膠的增強(qiáng)作用及其機(jī)制

曾琳，王召君，何志勇，秦昉，曾茂茂，陳潔

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(國家功能食品工程技術(shù)研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

大豆蛋白(soy protein isolate, SPI)具有較高營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)又具有良好的乳化性、起泡性和凝膠性等加工特性，價(jià)廉物美，在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用。然而，SPI由于分子質(zhì)量相對較大、且分子內(nèi)疏水基團(tuán)較多等固有結(jié)構(gòu)特性，使得各類性質(zhì)與動物源蛋白相比，依然有很多差距。因此，提升SPI的凝膠性等特性，始終是研究熱點(diǎn)。

目前，基于超高溫瞬時(shí)熱處理、pH偏移[1]、鈣促預(yù)凝膠[2]、輕度酶解[3]等的各種方法，均能使SPI凝膠性得到不同程度的提升。近年來，基于蛋白-蛋白相互作用提高蛋白凝膠性質(zhì)的方法引起了許多學(xué)者的重視。WONG等[4]用豌豆蛋白和乳清蛋白在鹽溶液中以2∶8的比例混合制備了熱誘導(dǎo)凝膠，混合凝膠在儲能模量和凝膠強(qiáng)度均高于純SPI或純?nèi)榍宓鞍啄z；NGUYEN等[5]發(fā)現(xiàn)在乳清蛋白中添加一定比例的酪蛋白酸鈣能誘導(dǎo)形成大聚集體并降低形成凝膠所需的最小乳清蛋白濃度。SPI與其他蛋白間相互作用也一直是研究的熱點(diǎn)。高雪麗[6]發(fā)現(xiàn)，小麥蛋白與大豆7S亞基、11S亞基相互作用，可以提升小麥-SPI面團(tuán)的持水性，有利于減緩面制品老化。ZHANG等[7]發(fā)現(xiàn)在SPI鈣誘導(dǎo)凝膠中加入乳清蛋白后能改善凝膠的機(jī)械性能，SPI與乳清蛋白的疏水相互作用導(dǎo)致凝膠彈性的增加。綜上，基于親水性不同、二硫鍵含量不同的蛋白的相互作用，可能是提升蛋白溶解性、凝膠性等性質(zhì)的有效途徑。

目前SPI與植物蛋白相互作用的研究主要集中在小麥蛋白這種溶解度較差的蛋白，SPI與親水性好的植物蛋白間相互作用的研究還未見報(bào)道。油茶籽蛋白(camellia seed protein isolate, CPI)[8]是一種分子質(zhì)量低、親水性好、溶解度高的新型植物蛋白，目前對CPI的研究主要集中在其抗氧化活性，對其功能性質(zhì)的研究較少。李慧珍[8]采用分步提取法分離出CPI，油茶籽粕蛋白分子質(zhì)量小，約為14 kDa，通過比較發(fā)現(xiàn)其溶解度、乳化性和乳化穩(wěn)定性均高于大豆分離蛋白。CPI具有與SPI不同的親疏水性和相對分子質(zhì)量，可能與SPI發(fā)生相互作用，對SPI熱誘導(dǎo)凝膠產(chǎn)生促進(jìn)效果。

因此，本文主要研究不同比例SPI-CPI混合對凝膠性質(zhì)影響，同時(shí)以純SPI、CPI作為對照，探究不同親疏水性蛋白間的相互作用及其對蛋白凝膠性質(zhì)的影響，為植物蛋白間相互作用的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆，哈爾濱市弘揚(yáng)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；油茶籽，江西贛州市上猶縣豐哥土特產(chǎn)商行；正己烷、無水乙醇、NaOH、鹽酸、硫酸、(NH4)2S2O8、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、三羥甲基氨基甲烷，牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、二硫代二硝基苯甲酸(dithionitrobenzoic acid, DNTB)、三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)、8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid, ANS)等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙烯酰胺、β-巰基乙醇、SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)蛋白，美國Bio-Rad公司；其他試劑均為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Agilent 1100高效液相色譜(配G1314A VWD檢測器)，美國安捷倫公司；F-2700熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；SpectraMax 190酶標(biāo)儀，美國分子儀器公司；Nano-ZS激光粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；Mini-Protein Tetra Cell電泳儀、Gel DocTMEZ Imager凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；GL-10MD高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀儀器有限公司；LGJ-25C冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)啟航科技有限公司；SevenEasy pH計(jì)、電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物蛋白的提取

1.2.1.1 SPI的制備

大豆經(jīng)破碎得到豆粉，采用料液比為1∶3(g∶mL)的V(正己烷)∶V(無水乙醇)=9∶1混合液脫脂，抽濾得到的脫脂粉于通風(fēng)櫥中過夜風(fēng)干。根據(jù)JIANG等[9]的方法提取蛋白，將脫脂粉與去離子水按1∶10(g∶mL)的料液比混合，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，室溫下攪拌2 h后10 000×g離心20 min，取上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，靜置30 min后6 500×g離心10 min，取蛋白沉淀重新溶于去離子水中，2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，4 ℃下攪拌2 h，冷凍干燥得到大豆分離蛋白，-80 ℃保存。測得SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.53%。

1.2.1.2 CPI的制備

油茶籽仁破碎得到油茶籽粉，采用料液比為1∶3(g∶mL)的V(正己烷)∶V(無水乙醇)=9∶1混合溶液脫脂，抽濾得到的脫脂粉于通風(fēng)櫥中過夜風(fēng)干。脫脂粉與70%乙醇溶液按1∶10(g∶mL)的料液比攪拌1 h，除去茶皂素，抽濾得到的油茶籽粉于通風(fēng)櫥中過夜風(fēng)干。根據(jù)JIANG等[9]的方法，操作同SPI的制備，測其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.35%。

1.2.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的測定

1.2.2.1 氨基酸組成的測定

根據(jù)YU等[10]的方法測定SPI和CPI的總氨基酸組成，其中色氨酸用堿水解樣品測定，其余17種氨基酸用酸水解樣品測定。酸水解過程：稱取一定質(zhì)量蛋白，加8 mL 6 mol/L HCl溶液，充N23 min，120 ℃水解22 h。水解后加4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液，蒸餾水定容至25 mL。定容后樣品用雙層濾紙過濾，過濾后15 000×g離心30 min。取上清液待測。堿水解過程：稱取一定質(zhì)量蛋白，加8 mL 5 mol/L NaOH溶液，充N23 min，120 ℃水解22 h。水解后加6.7 mL 6 mol/L HCl溶液，蒸餾水定容至25 mL。定容后樣品用雙層濾紙過濾，過濾后15 000×g離心30 min。取上清液待測。

采用HPLC法測定氨基酸含量。色譜柱為Agilent Hypersil ODS柱(250 mm×4.0 mm，5 μm)，柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。流動相：V(27.6 mmol/L醋酸鈉)∶V(三乙胺)∶V(四氫呋喃)=500∶0.11∶2.5(A)和V(80.9 mmol/L醋酸鈉)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶2∶2(B)。洗脫梯度：0 min，92% A，8% B；17 min，50% A，50% B；20.1 min，0% A，100% B；24 min，100% A，0% B。脯氨酸在262 nm波長下檢測，其余氨基酸檢測波長為338 nm。

1.2.2.2 SPI與CPI復(fù)配溶液的制備

將SPI與CPI按照一定的比例混合分散于去離子水中配制成質(zhì)量濃度為120 g/L的溶液，室溫?cái)嚢? h備用。SPI與CPI的混合比例分別是10∶0、0∶10、10∶1、10∶2、10∶3和10∶4，分別記為SPI、CPI、SC10∶:1、SC10∶2、SC10∶3、SC10∶4。

1.2.2.3 流變性質(zhì)的測定

采用HAKAA MARS Ⅲ旋轉(zhuǎn)流變儀測定蛋白溶液的流變性質(zhì)。使用直徑35 mm的平板探頭，平板間距1.0 mm，吸取1 mL蛋白樣品進(jìn)行溫度掃描。溫度掃描的參數(shù)是：應(yīng)變1%(線性范圍內(nèi))，頻率1 Hz，以2 ℃/min的升溫速率從25 ℃升溫至95 ℃，保溫10 min，從2 ℃/min的降溫速率從95 ℃降溫至25 ℃，記錄彈性模量和黏性模量隨溫度和時(shí)間的變化。在樣品邊緣滴加硅油防止升溫過程中水分蒸發(fā)。

1.2.2.4 凝膠強(qiáng)度的測定

將1.2.2.2中制備的復(fù)配蛋白溶液移入10 mL燒杯中，保鮮膜封口，95 ℃水浴35 min，取出后于冰水浴冷卻，4 ℃存放過夜。采用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀測定復(fù)配凝膠的凝膠強(qiáng)度。蛋白凝膠于25 ℃平衡1 h后從燒杯中小心取出，切割為高度20 mm的圓柱體。選用P/36R探頭，測試參數(shù)為：測前速度1 mm/s，測試速度5 mm/s，測后速度5 mm/s，下壓2次，探頭2次測定的時(shí)間間隔為5 s，觸發(fā)力5.0 g，壓縮形變50%。凝膠硬度為第2次擠壓變形時(shí)凝膠產(chǎn)生應(yīng)力的最大值。

1.2.2.5 持水性的測定

根據(jù)簡華君[11]的方法測定凝膠持水性。蛋白凝膠于25 ℃平衡1 h后從燒杯中小心取出，稱量后移入50 mL離心管中，10 000×g離心15 min。用濾紙小心吸取離心后凝膠表面的水漬。持水率(%)定義為離心后凝膠質(zhì)量占離心前凝膠質(zhì)量的百分比。

1.2.2.6 微觀結(jié)構(gòu)測定

使用掃描電子顯微鏡對凝膠微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。制備好的蛋白凝膠放入足量液氮中急速冷凍干燥。對冷凍干燥樣品進(jìn)行離子濺射噴金處理，在高真空模式下觀察樣品表面形貌，電子槍加速電壓為3 kV。

1.2.2.7 溶解度的測定

將蛋白樣品稀釋成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，室溫下磁力攪拌1 h，12 000×g離心15 min。收集上清液，以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用雙縮脲法測定蛋白含量。蛋白質(zhì)的溶解度為上清液中的蛋白含量與總蛋白含量的比值。

1.2.2.8 十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

采用4%濃縮膠，12%分離膠，1 mm凝膠板，上樣量為10 μL。電泳樣品沸水浴5 min，濃縮膠電壓為40 V，分離膠電壓為80 V。用考馬斯亮藍(lán)快速染液染色30 min，去離子水脫色數(shù)次至底色褪去。

1.2.2.9 表面游離巰基及二硫鍵的測定

根據(jù)BEVERIDGE等[12]的方法適當(dāng)修改，測定表面游離巰基及二硫鍵含量。

表面游離巰基含量測定：將1.2.2.2中制備的蛋白溶液稀釋為5 mg/mL，加入0.05 mL DNTB溶液，室溫放置1 h后于波長412 nm處測定吸光度值，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：73.53,DNTB試劑的摩爾消光系數(shù)；A412，蛋白樣品的吸光度值；c，蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；D，稀釋倍數(shù)，5.05。

總自由巰基含量測定：取1 mL 1.2.2.2中制備的蛋白溶液，加入4 mL尿素-鹽酸胍溶液(包含8 mol/L尿素和5 mol/L鹽酸胍)，再加入0.05 mL DTNB溶液，室溫放置1 h后于波長412 nm處測定吸光度值，計(jì)算公式同表面游離巰基。

總巰基含量測定：取1 mL 1.2.2.2中制備的蛋白溶液，加入0.05 mL β-巰基乙醇和4 mL尿素-鹽酸胍溶液，25 ℃條件下水浴1 h。取出后加入10 mL的12%的TCA，25 ℃條件下再次水浴1 h。水浴后混合物5 000 ×g離心10 min。取沉淀分散在5 mL 12% TCA中，離心除去β-巰基乙醇，重復(fù)2～3次。最后將沉淀溶解在10 mL尿素-鹽酸胍溶液中，加入0.04 mL DNTB溶液，在波長412 nm下測定吸光度。以不加蛋白的樣品為對照，在波長412 nm下測定吸光度值，計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.2.2.10 表面疏水性的測定

以ANS作為熒光探針測定蛋白質(zhì)表面疏水性。用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L, pH 7.0)稀釋蛋白樣品，制備質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的蛋白溶液；2 mL蛋白樣品和20 μL ANS (8.0 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)混合，室溫避光保存3 min。熒光強(qiáng)度(fluorescence index，F(xiàn)I)用熒光光譜儀測量，激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，狹縫寬度為5 nm。通過線性回歸分析計(jì)算FI與蛋白濃度的初始斜率，將其作為蛋白疏水性(H0)的指標(biāo)。

1.2.2.11 粒徑的測定

將1.2.2.2中制備的蛋白溶液稀釋為1 mg/mL，采用Malvern Nano-ZS型動態(tài)光散射儀對蛋白溶液的粒徑進(jìn)行測定，測定溫度為25 ℃。

1.2.2.12 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)分析

使用帶有單反射衰減全反射(attenuated total reflection，ATR)附件的FTIR光譜儀對蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以空氣為參比，記錄4 000～650 cm-1的光譜，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次，使用OMNIC v.8.0和Peakfit v.4.12軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019繪圖，采用Statistix Version 9.0軟件進(jìn)行單因素ANOVA判斷(鄧肯分析)，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種蛋白的氨基酸組成分析

SPI和CPI的氨基酸組成及疏水性見表1。SPI的親疏水性氨基酸比例為1.09∶1，而CPI的親疏水性氨基酸比例1.3∶1，CPI中親水氨基酸含量占比高于SPI。SPI主要依靠疏水相互作用、二硫鍵和氫鍵等相互作用形成凝膠，其中疏水相互作用對凝膠的形成至關(guān)重要。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被加熱時(shí)，包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水氨基酸殘基暴露出來，導(dǎo)致疏水性增加，從而促進(jìn)凝膠的形成。因此，蛋白氨基酸殘基的疏水性是影響蛋白凝膠特性的重要因素。此外，凝膠還受蛋白溶解度、蛋白形狀、溫度、鹽離子和pH值等因素的影響[13]。親水氨基酸傾向于定位在蛋白質(zhì)表面，CPI的親水氨基酸含量高，意味著其可能比SPI更親水。2種蛋白混合后加熱可能會產(chǎn)生相互作用，以改善SPI熱誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)。

表1 SPI和CPI的氨基酸組成Table 1 The amino acid composition of soy protein and camelia seed protein

2.2 凝膠性質(zhì)分析

2.2.1 流變性質(zhì)分析

儲能模量(Pa)的變化可用于表征蛋白質(zhì)凝膠的流變學(xué)性質(zhì)。圖1是SPI和復(fù)配蛋白在加熱過程中儲能模量(G′)隨時(shí)間和溫度的變化圖，表2是CPI添加比例對凝膠溫度、初始彈性模量和終點(diǎn)彈性模量的影響。其中，0～35 min為升溫階段(25～95 ℃)，35～45 min為保溫階段(95 ℃)，45～80 min為降溫階段(95～25 ℃)。蛋白質(zhì)在加熱過程中彈性模量(G′)值急劇上升，表明蛋白質(zhì)受熱變性，凝膠網(wǎng)絡(luò)開始形成，該溫度被定義為成膠的凝膠起始溫度或凝膠點(diǎn)。凝膠點(diǎn)可通過彈性模量(G′)和黏性模量(G″)發(fā)生交點(diǎn)時(shí)的溫度來定義，預(yù)示著體系中的溶液逐漸向固體轉(zhuǎn)變[14]。

圖1 CPI添加比例對彈性模量的影響Fig.1 Effect of camellia seed protein addition ratio on storage modulus

表2 CPI添加比例對凝膠溫度、初始彈性模量和 終點(diǎn)彈性模量的影響Table 2 Effect of camellia seed protein addition ratio on gel temperature, initial storage modulus, and final storage modulus

由圖1可知，在整個(gè)升溫過程中CPI的儲能模量保持不變，維持在0.2 Pa左右，不具備形成熱誘導(dǎo)凝膠的能力。SPI及其復(fù)配蛋白樣品表現(xiàn)出典型的豆類植物蛋白流變曲線特征。升溫階段，溫度未到達(dá)蛋白質(zhì)凝膠點(diǎn)前，G′值基本保持不變，隨著溫度升高超過凝膠點(diǎn)后，G′值迅速上升，此時(shí)蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，蛋白變性聚集開始形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。SPI中加入CPI后，混合蛋白的凝膠溫度由原來的82.34 ℃逐步下降至73.81 ℃。隨著溶液中CPI含量的增加，復(fù)配蛋白的G′值也隨之增大，但當(dāng)CPI在體系中的比例增加至10∶4時(shí)，G′值開始下降。這可能與實(shí)驗(yàn)中總蛋白濃度固定在12%有關(guān)，當(dāng)SPI與CPI比例達(dá)到10∶4時(shí)，SPI在體系中的濃度僅為8.5%，接近其臨界凝膠濃度。另外，復(fù)合蛋白的熱凝膠性質(zhì)也受聚集體粒徑大小、含量高低、反應(yīng)活性等因素影響[15]。

2.2.2 凝膠強(qiáng)度及持水性分析

為了研究CPI的添加及添加比例對復(fù)配蛋白凝膠特性的影響，測定了凝膠強(qiáng)度和凝膠持水性。如圖2所示，與單純的SPI凝膠相比，CPI的添加比例為10∶1時(shí)，復(fù)配蛋白凝膠強(qiáng)度由213 g提高至350 g；隨著CPI添加比例的增加，凝膠強(qiáng)度先增加后降低，最高可提升至427 g(SC10∶3)。從圖2持水性結(jié)果看，CPI的加入并未使復(fù)配蛋白凝膠的持水性發(fā)生太大變化，而是在99.72%～99.89%波動，復(fù)配蛋白凝膠持水性好。一般而言，2種蛋白質(zhì)混合，當(dāng)其中的一種蛋白不能形成凝膠并保持溶解性良好的狀態(tài)下，混合物凝膠強(qiáng)度的提升原因一般認(rèn)為有3種：(1)作為填充物的某種蛋白保持可溶狀態(tài)的單相凝膠[16]；(2)2種蛋白之間的相互作用產(chǎn)生了結(jié)合，那么非凝膠組分的蛋白可能會通過非特異性相互作用吸附或者結(jié)合在連續(xù)相凝膠網(wǎng)絡(luò)上；(3)2種蛋白發(fā)生共聚合形成雜合單一的凝膠網(wǎng)絡(luò)[17]。為了研究CPI對于SPI凝膠性提升的原因，本文通過測定凝膠結(jié)構(gòu)、混合物溶解度、電泳、表面游離巰基含量、二硫鍵含量、表面疏水性、溶液粒徑分布、二級結(jié)構(gòu)變化等來探索2種蛋白相互作用機(jī)制。

圖2 CPI添加比例對凝膠強(qiáng)度及持水率的影響Fig.2 Effect of camellia seed protein addition ratio on gel strength and water holding capacity

2.2.3 凝膠結(jié)構(gòu)分析

圖3-a為SPI、CPI和復(fù)配蛋白凝膠的宏觀圖片，除CPI外，SPI與復(fù)配蛋白在12%濃度下均可形成凝固型凝膠。SPI呈黃色，CPI呈褐色，隨著體系中CPI含量的增加，復(fù)配凝膠的顏色逐漸加深。舒敏[18]提取的CPI也為褐色，主要是由于油茶籽粕中含有茶紅色素，且蛋白提取過程中多酚類物質(zhì)會發(fā)生氧化褐變。

a-凝膠宏觀圖片；b-SPI微觀結(jié)構(gòu)；c-SC10∶1微觀結(jié)構(gòu)； d-SC10∶2微觀結(jié)構(gòu)；e-SC10∶3微觀結(jié)構(gòu)；f-SC10∶4微觀結(jié)構(gòu)圖3 CPI添加比例對凝膠宏觀圖片和微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of camellia seed protein addition ratio on gel macrostructure and microstructure

圖3-b～圖3-f為SPI凝膠和復(fù)配蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)圖。SPI凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)疏松，網(wǎng)絡(luò)孔隙較大；SPI和CPI的復(fù)配凝膠形成了均一的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，體系中CPI的添加比例對凝膠微觀結(jié)構(gòu)有明顯的影響。隨著CPI比例的增加，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中網(wǎng)孔直徑減小，網(wǎng)孔數(shù)量增加。當(dāng)SPI與CPI間的比例增加到10∶4時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)孔直徑增大，這是因?yàn)镃PI不具備形成凝膠的能力，SPI為凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要成分，體系中SPI含量過低不利于致密凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。這也進(jìn)一步說明了當(dāng)SPI與CPI的比例為10∶4時(shí)復(fù)配蛋白的凝膠強(qiáng)度開始下降的原因。因此，CPI的少量添加有利于促進(jìn)復(fù)配蛋白形成致密均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高蛋白凝膠強(qiáng)度。

2.3 SPI和CPI的相互作用機(jī)制

2.3.1 溶解度分析

復(fù)合蛋白質(zhì)的溶解度是表征蛋白-蛋白之間相互作用的一個(gè)途徑。SPI、CPI和復(fù)配蛋白的溶解度見圖4。CPI的溶解度為92.73%，顯著高于SPI(87.89%)。復(fù)配后，復(fù)配比例為10∶1時(shí)，溶解度并未增加，隨著體系中油茶籽含量增加，溶解度由88.84%(SC10∶1)提升至93.40%(SC10∶4)。此外，蛋白質(zhì)的溶解度與蛋白質(zhì)表面的親疏水平衡有關(guān)，這種平衡取決于分子表面的氨基酸組成。CPI的疏水氨基酸含量低，說明蛋白質(zhì)分子表面可能有更多親水氨基酸；分子質(zhì)量小，意味著蛋白質(zhì)與水分子接觸的表面積增加，有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)與水之間的相互作用[19]。SPI與CPI發(fā)生相互作用，改變SPI表面的親疏水平衡，增強(qiáng)復(fù)配蛋白與水之間的相互作用，促使溶液中SPI不可溶聚集體形成可溶性聚集體，溶解度得到提高。張蒙琪[20]將SPI與全蛋液以3∶1的比例混合后，發(fā)現(xiàn)混合物的溶解度(64.44%)高于SPI(53.56%)和全蛋液(54.90%)，2種蛋白的相互作用促進(jìn)了溶解度的提升。溶解度的提升與混合蛋白凝膠性提升有關(guān)，溶解度的提升使體系中有更多蛋白參與凝膠結(jié)構(gòu)的形成，使凝膠網(wǎng)絡(luò)更加致密均勻。

圖4 CPI添加比例對蛋白溶解度的影響Fig.4 Effect of camellia seed protein addition ratio on protein solubility

2.3.2 電泳分析

為了探討CPI與SPI間產(chǎn)生的相互作用類型，采用還原和非還原SDS-PAGE分析了2種植物蛋白及其復(fù)配后產(chǎn)物的亞基組成變化，結(jié)果見圖5。從非還原電泳圖可知，SPI主要由α′、α、β、AB、A、B亞基組成，在>100 kDa處出現(xiàn)多條大聚集體條帶。CPI主要由3條較低分子質(zhì)量的肽段組成，分子質(zhì)量分別是48、40、14 kDa。隨著CPI的添加比例升高，復(fù)配蛋白中組成SPI的6個(gè)亞基的條帶占比減少，樣品中SPI的含量減少，同時(shí)CPI中14 kDa條帶含量顯著減少。值得注意的是，4個(gè)復(fù)配樣品電泳圖中濃縮膠和分離膠頂層條帶顏色變深，分離膠泳道最上端的2條條帶顏色也加深，這說明2種蛋白間發(fā)生強(qiáng)相互作用并在亞基之間形成了大聚集體。對比分析還原和非還原電泳，可以發(fā)現(xiàn)除了SC10∶3和SC10∶4兩個(gè)樣品分離膠頂層條帶留有少量聚集體外，其他聚集體條帶變淺甚至消失，電泳結(jié)果說明，2種蛋白形成了二硫鍵參與的復(fù)合物，這種復(fù)合物的形成可能是混合蛋白凝膠溫度的下降和凝膠強(qiáng)度提升的原因。

M-標(biāo)品蛋白，泳道1～6分別是SPI、CPI、SC10∶1、 SC10∶2、SC10∶3、SC10∶4圖5 SPI與CPI復(fù)配后的SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE pattern of soy protein and camelia seed protein mixed solution

2.3.3 表面游離巰基含量和二硫鍵含量分析

表面游離巰基含量的變化與蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和蛋白質(zhì)展開程度密切相關(guān)。SPI、CPI和復(fù)配蛋白表面游離巰基、二硫鍵含量的變化見圖6。SPI的表面游離巰基含量高于CPI，CPI的添加使體系中游離巰基含量降低；SPI的二硫鍵含量低于CPI，隨著體系中CPI含量的增加，復(fù)配蛋白的二硫鍵含量增加。氨基酸分析和電泳分析結(jié)果顯示，CPI的半胱氨酸含量遠(yuǎn)高于SPI；2種蛋白混合物中存在由二硫鍵參與形成的復(fù)合物。因此由混合物蛋白中表面游離巰基下降、二硫鍵含量上升可知，SPI與CPI生成了新的二硫鍵。劉鑫碩等[21]研究馬鈴薯蛋白與蛋清蛋白相互作用，也發(fā)現(xiàn)2種蛋白復(fù)配后存在二硫鍵相互作用。

圖6 CPI添加比例對表面游離巰基及二硫鍵含量的影響Fig.6 Effect of camellia seed protein addition ratio on surface free sulfhydryl group and disulfide bond contents

2.3.4 表面疏水性分析

表面疏水性反映了蛋白質(zhì)的展開程度和表面疏水基團(tuán)的暴露程度，這些結(jié)構(gòu)的變化能改變蛋白質(zhì)間的疏水相互作用，進(jìn)而影響凝膠的形成[22]。為了進(jìn)一步探明SPI與CPI復(fù)配后有效促進(jìn)凝膠強(qiáng)度上升和凝膠溫度下降的原因，測定了SPI、CPI和復(fù)配蛋白的表面疏水性，結(jié)果見圖7。SPI與CPI的表面疏水性差異極大；隨著蛋白混合物中CPI含量的增加，混合蛋白的表面疏水性也顯著下降，存在顯著的量效關(guān)系。蛋白質(zhì)的表面疏水性與其氨基酸組成有關(guān)，特別是與分子表面暴露的氨基酸殘基的類型和數(shù)量有關(guān)[23]。該結(jié)果也進(jìn)一步說明，2種蛋白之間存在相對較強(qiáng)的相互作用，形成的復(fù)合物的整體疏水性下降，這可能也是復(fù)合蛋白溶解性提高的重要原因。

圖7 CPI添加比例對表面疏水性的影響Fig.7 Effect of camellia seed protein addition ratio on surface hydrophobicity

2.3.5 粒徑分析

為了進(jìn)一步證實(shí)2種蛋白相互作用形成的復(fù)合物的狀態(tài)，采用動態(tài)光散射測定了2種蛋白及其復(fù)配后的粒徑變化。圖8顯示，SPI的粒徑呈雙峰分布，位于60和255 nm處，CPI則主要分布在15 nm處，在60和300 nm處存在2個(gè)小峰，說明CPI的粒徑遠(yuǎn)小于SPI。SPI和CPI復(fù)配后的粒徑分布與SPI類似，CPI在15 nm處的粒徑峰消失，說明2種蛋白間產(chǎn)生了相互作用，形成了復(fù)合物。PIZONES等[24]也發(fā)現(xiàn)了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將大豆7S球蛋白與β-乳球蛋白以5∶5的比例復(fù)配后，復(fù)配蛋白的粒徑分布圖中沒有β-乳球蛋白的峰，幾乎與7S球蛋白峰重合，2種蛋白間發(fā)生了絡(luò)合。

圖8 CPI添加比例對蛋白粒徑的影響Fig.8 Effect of camellia seed protein addition ratio on protein particle size

2.3.6 紅外光譜分析

采用傅里葉紅外光譜對SPI、CPI和復(fù)配蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析，如圖9所示。蛋白質(zhì)的主要特征譜帶由酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)、酰胺Ⅱ帶(1 480～1 575 cm-1)和酰胺Ⅲ帶(1 230～1 400 cm-1)組成，其中酰胺Ⅰ帶是由4種不同的二級結(jié)構(gòu)組成，可采用高斯積分法擬合計(jì)算蛋白中各二級結(jié)構(gòu)的含量占比，如表3所示。SPI二級結(jié)構(gòu)以β-折疊為主，其次是β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲和α-螺旋，與安然[25]的研究結(jié)果相似。CPI二級結(jié)構(gòu)同樣以β-折疊為主，但其相對含量低于SPI，而其他幾種二級結(jié)構(gòu)相對含量則高于SPI。2種蛋白復(fù)配后，隨著CPI含量的增加，復(fù)配蛋白的β-折疊相對含量下降，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的含量增至與CPI相近，α-螺旋相對含量無明顯變化。說明2種蛋白間發(fā)生相互作用導(dǎo)致復(fù)配蛋白的二級結(jié)構(gòu)由有序態(tài)向無序態(tài)轉(zhuǎn)變，這種改變有利于復(fù)配凝膠強(qiáng)度的改善。

圖9 CPI添加比例對FTIR光譜的影響Fig.9 Effect of camellia seed protein addition ratio on FTIR spectra

表3 CPI添加比例對二級結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effect of camellia seed protein addition ratio on the secondary structure

3 結(jié)論

本文利用SPI和不同比例的CPI復(fù)配制備凝膠，從2種蛋白自身氨基酸組成、復(fù)配蛋白溶液的凝膠性質(zhì)以及2種蛋白相互作用機(jī)制3方面進(jìn)行研究，揭示了CPI對復(fù)配凝膠特性的改善機(jī)制。結(jié)果表明，一定比例的CPI可以有效提升SPI的凝膠強(qiáng)度。這種提升作用主要是基于2種蛋白間發(fā)生二硫鍵相互作用，使SPI和CPI形成了二硫鍵參與的復(fù)合物，有效誘導(dǎo)復(fù)配蛋白溶解度提升，促進(jìn)復(fù)配蛋白形成致密均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果說明，基于親疏水性和二硫鍵含量有顯著差異的蛋白的相互作用，可以提升混合蛋白的溶解性和凝膠性，這為未來高凝膠性植物基蛋白的制造提供了一種新的思路。