基于PMA-CELL-qPCR的葡萄酒發(fā)酵中釀酒酵母活菌計數(shù)方法的開發(fā)與應(yīng)用

衛(wèi)博，王杰，陳亦新，王春光，陳卓君，張柏林，朱保慶

(北京林業(yè)大學(xué)，林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100083)

酒精發(fā)酵是酵母將糖分代謝成酒精和CO2的過程，可賦予葡萄酒濃郁的香氣和獨特的口感。釀酒酵母具有快速的糖消耗能力，因而常被用作酒精發(fā)酵過程中主要的發(fā)酵劑[1]，由于葡萄酒的味道、顏色和香氣與微生物的生長和代謝密切相關(guān)，且只有活性的微生物才會在發(fā)酵過程中起作用。因此，有必要建立一種快速和可靠的方法來檢測和識別葡萄酒釀造中的活性微生物。

平板計數(shù)法作為一種依賴培養(yǎng)的計數(shù)方法，已被廣泛應(yīng)用于葡萄酒釀造過程中的微生物計數(shù)[2-3]。然而，其耗時的生長過程和缺乏對可生存但不可培養(yǎng)(viable but non culturable，VBNC)微生物的計數(shù)能力，可能造成測得的微生物群體密度偏低[4]。據(jù)報道，在葡萄酒發(fā)酵過程中，死亡的微生物和VBNC狀態(tài)的微生物可能占微生物總數(shù)量的60%以上[5]。

最近，人們研究和開發(fā)了以微生物菌株DNA為模板的分子計數(shù)方法，以取代依賴培養(yǎng)的計數(shù)方法[6-7]。實時定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)已經(jīng)作為一種特定的區(qū)別于依賴培養(yǎng)的檢測方法，應(yīng)用于測量各種培養(yǎng)基條件下的微生物數(shù)量[8]。然而，qPCR技術(shù)缺乏區(qū)分死菌和活菌DNA的能力。這可能造成死菌DNA的錯誤擴增，并進一步導(dǎo)致對微生物數(shù)量的高估[9]。據(jù)報道，疊氮溴化丙啶(propidium monoazide，PMA)的引入可提高qPCR技術(shù)對微生物計數(shù)的準(zhǔn)確性[10]。PMA作為一種光敏的DNA配體染料，可以穿透死菌的細(xì)胞膜，在強光下進一步交聯(lián)死菌細(xì)胞的DNA，來自死菌細(xì)胞DNA的qPCR擴增被抑制[11-12]。同時，活菌細(xì)胞擁有完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，這使得PMA無法進入細(xì)胞膜與DNA發(fā)生作用[7]。

針對活菌的細(xì)胞實時定量PCR(CELL-qPCR)方法在計算葡萄酒中的微生物數(shù)量方面受到了廣泛關(guān)注。這種技術(shù)省去了DNA提取過程，直接利用細(xì)胞作為qPCR擴增的模板，縮短了反應(yīng)時間，降低了反應(yīng)成本[13-14]。目前尚無PMA與CELL-qPCR方法結(jié)合監(jiān)控釀酒過程中微生物動力學(xué)的研究。本研究擬開發(fā)和優(yōu)化PMA-CELL-qPCR檢測方法，以準(zhǔn)確測定葡萄酒中的活菌，并進一步應(yīng)用于葡萄酒釀造過程中，以測量微生物的動力學(xué)。研究結(jié)果有助于闡明葡萄酒發(fā)酵過程中的微生物生長機制，并進一步為葡萄酒釀造過程的質(zhì)量改進提供有益的啟示。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器設(shè)備

酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、氯霉素、熒光染料疊氮溴化丙啶(propidium monoazide，PMA)，二甲基亞砜、溶壁酶、酵母DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；商業(yè)化釀酒酵母菌株Red Fruit?，意大利Enartis公司；酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(yeast extract peptone dextrose, YPD)培養(yǎng)基，美國Difco公司；2x FastStart Essential DNA Green Master，美國 Roche公司， qPCR Mix Plus (ROX)， 愛沙尼亞Solis BioDyne公司。

YXQ-LS-50型立式壓力蒸汽滅菌器、HPX-9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FA204電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；VORTEX-5漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺，浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司；WD-9413B凝膠成像分析儀、HB150-S2金屬浴、DYY-6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；5425高速離心機，德國艾本德公司；FQD-96A實時熒光定量PCR儀，杭州博日科技有限公司；Q-bit檢測儀，浙江藍(lán)景科技有限公司；UV-3300紫外可見分光光度計，上海美普達(dá)儀器有限公司。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

YPD固體培養(yǎng)基：加入20 g/L瓊脂于液體培養(yǎng)基內(nèi)，同時加入100 mg/L氯霉素。

葡萄酒培養(yǎng)基：懷來、平谷兩地赤霞珠葡萄汁。

商業(yè)化酵母菌株在YPD培養(yǎng)基中28 ℃下培養(yǎng)24小時。為模擬葡萄酒發(fā)酵過程環(huán)境，將YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)末期的酵母菌，轉(zhuǎn)移至相同體積的赤霞珠葡萄汁中培養(yǎng)2 h后，用于后續(xù)實驗檢測計數(shù)。

1.3 細(xì)胞懸浮液處理

對于每個微生物菌株(釀酒酵母)，制備4個細(xì)胞懸液樣品，分別為：無PMA處理的活菌細(xì)胞(對照)、PMA處理的活菌細(xì)胞、PMA處理的死菌細(xì)胞、PMA處理的活菌和死菌細(xì)胞混合物。為了驗證PMA處理對死菌細(xì)胞的功效，將細(xì)胞懸液在85 ℃金屬浴中處理20 min，以破壞細(xì)胞膜。通過YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，確認(rèn)熱處理后的細(xì)胞已經(jīng)死亡。

1.4 PMA處理的優(yōu)化

參考LYU等[15]的方法并稍加修改，將PMA溶解在20%(體積分?jǐn)?shù))的二甲基亞砜中，制備PMA儲備溶液(20 mmol/L)。PMA儲備液在-20 ℃下避光儲存。將不同濃度的PMA溶液加入到1 mL細(xì)胞懸液中，產(chǎn)生不同濃度(0、5、10、25、50 μmol/L)的PMA溶液。之后，將PMA處理的細(xì)胞懸液在避光條件下200 r/min、4 ℃攪拌20 min。暗反應(yīng)孵育結(jié)束后，將細(xì)胞懸液暴露在距離7 cm的450 nm的藍(lán)色LED燈下(5 mm，3.7 V，20 mA，2 600 MCD)光活化10 min，完成PMA和細(xì)胞DNA的交聯(lián)[15]。未經(jīng)PMA處理的細(xì)胞懸浮液被用作陰性對照。

1.4 酵母細(xì)胞酶處理條件的優(yōu)化

使用溶壁酶分解酵母細(xì)胞壁。在PMA處理過的細(xì)胞懸液中加入一定量的溶壁酶30 ℃培養(yǎng)，具體優(yōu)化條件如表1所示。隨后，將細(xì)胞懸液在4 000 r/min離心10 min，收集酵母細(xì)胞。細(xì)胞顆粒用無菌蒸餾水洗滌2次。

表1 溶壁酶優(yōu)化條件Table 1 Optimised conditions for lyticase

1.6 DNA提取

從培養(yǎng)基和葡萄酒中各取1 mL細(xì)胞懸液，用酵母DNA提取試劑盒提取酵母DNA。取細(xì)胞懸液12 000 r/min離心1 min收集菌體，去上清液，然后加入山梨醇，溶壁酶進行破壁處理，4 000 r/min離心10 min收集沉淀，后續(xù)提取過程遵循酵母DNA提取試劑盒步驟。

1.7 引物

實驗最初選用3對引物對酵母進行擴增，并最終選用引物(S.c-f：5′-ACATATGAAGTATGTTTCTATATAACGGTG-3′；S.c-r：5′-TGGTGCTGGTGCGGATCTA-3′)對釀酒酵母進行定量，引物的序列和特征列于表2。

表2 釀酒酵母引物序列Table 2 Primer sequences of S.cerevisiae

1.8 qPCR條件

PCR擴增反應(yīng)體系為25 μL，包括：2× FastStart Essential DNA Green Master、qPCR Mix Plus (ROX) 12.5 μL，正反引物各1 μL， DNA模板2 μL或細(xì)胞模板10 μL，剩余體積無菌水補充。

qPCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性15 min，40個循環(huán)：95 ℃變性15 s，然后60 ℃退火/延伸20 s。熔解曲線從60 ℃緩慢加熱到95 ℃，每隔5 s加熱0.5 ℃，連續(xù)收集熒光得到。對擴增的DNA進行熔解曲線分析以確定反應(yīng)的特異性。所有的分析都是在C100TM熱循環(huán)儀、FQD-96A實時系統(tǒng)中進行。通過將qPCR的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)與不同細(xì)胞濃度(102～109CFU/mL)作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.9 PMA-CELL-qPCR方法應(yīng)用于葡萄酒

將2個不同產(chǎn)地的葡萄去梗并擠壓成葡萄汁。然后對葡萄汁進行膜過濾殺菌，將生長至106CFU/mL的釀酒酵母接入葡萄汁以啟動酒精發(fā)酵。在發(fā)酵期間，每2～3 d對葡萄酒進行采樣。使用CELL-qPCR、PMA-CELL-qPCR和平板計數(shù)法測量葡萄酒樣品中的釀酒酵母細(xì)胞量。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗均平行3次，數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism軟件分析。采用5%顯著性水平的t檢驗來確定不同方法間的差異。對PMA-CELL-qPCR和CELL-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線進行統(tǒng)計分析，在Tukey多重比較檢驗下采用單因素方差分析，以確定基質(zhì)對細(xì)胞定量能力的影響。使用Duncan多重比較檢驗下的單因素方差分析，以確定PMA-CELL-qPCR檢測的特異性，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳PMA濃度的確定

使用不同濃度的PMA分別處理細(xì)胞濃度為107CFU/mL的活菌細(xì)胞和熱致死細(xì)胞，然后用CELL-qPCR技術(shù)進行計數(shù)，將其Ct與未經(jīng)PMA處理的活菌細(xì)胞進一步比較，以確定最佳的ΔCt值。ΔCt按公式(1)計算：

ΔCt=Ct處理-Ct未處理

(1)

由圖1所示，熱致死細(xì)胞的ΔCt值隨著PMA處理濃度的增加而增加。5 μmol/L PMA處理組活釀酒酵母細(xì)胞與未經(jīng)PMA處理的熱致死細(xì)胞相比，ΔCt只增加了0.34(P>0.05)，這表明PMA可以穿過熱致死細(xì)胞的細(xì)胞膜與DNA相互作用，并抑制qPCR中的DNA擴增。在進行CELL-qPCR擴增之前，PMA處理過的熱致死細(xì)胞還要用溶壁酶處理。用5 μmol/L PMA處理的熱致死細(xì)胞與未經(jīng)PMA處理的活菌細(xì)胞相比，ΔCt差異顯著(P<0.05)，這表明釀酒酵母的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)并沒有阻止PMA分子進入細(xì)胞。在PMA濃度為25 μmol/L和50 μmol/L的情況下，對熱致死細(xì)胞的抑制作用最高。然而，PMA濃度為50 μmol/L時，活菌細(xì)胞的DNA擴增也受到顯著抑制(P<0.05)。濃度在5～25 μmol/L的PMA處理對活菌細(xì)胞的DNA擴增無負(fù)面作用。

圖1 PMA濃度對釀酒酵母活/死細(xì)胞的 PMA-CELL-qPCR信號的影響Fig.1 Effect of PMA concentration on PMA-CELL-qPCR signals of live/dead cells of S.cerevisiae注：不同大寫字母表示不同組間死菌細(xì)胞差異顯著，不同小寫 字母表示不同組間活菌細(xì)胞差異顯著(P<0.05)

實驗結(jié)果表明，高濃度的PMA通過與熱致死細(xì)胞的DNA相互作用，能夠完全抑制死菌DNA擴增。然而，過量的PMA分子在CELL-qPCR中抑制了活菌細(xì)胞DNA擴增。類似的研究也有報道，PAN等[17]發(fā)現(xiàn)50 μmol/L 的PMA對李斯特菌活菌有輕微的細(xì)胞毒性效應(yīng)，SHAO等[18]使用高濃度的PMA處理保加利亞乳桿菌時，其細(xì)胞計數(shù)明顯減少，但目前這一現(xiàn)象的機制還未被闡明。本研究中，釀酒酵母的最佳PMA處理濃度為25 μmol/L，此濃度下，死菌細(xì)胞的DNA擴增被完全抑制，且對活菌細(xì)胞DNA擴增無負(fù)面作用。

2.2 酵母CELL-qPCR樣品預(yù)處理的優(yōu)化

本研究中直接以細(xì)胞為模板與從細(xì)胞中提取的DNA為模板進行qPCR擴增，兩者Ct值有明顯差異。ANDORR等[19]研究表明，釀酒酵母的細(xì)胞壁可能是造成Ct值差異的原因。在本研究中，對釀酒酵母進行PMA處理后，進一步對其進行溶壁酶破壁處理。溶壁酶處理有助于降低Ct值，提高檢測靈敏度和限度。

由圖2-a所示，對照組(DNA模板)的Ct值與未經(jīng)溶壁酶處理的釀酒酵母細(xì)胞相比，存在顯著差異(P<0.05)。在溶壁酶處理30 min后，細(xì)胞的Ct值明顯下降(P<0.05)。表明釀酒酵母的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)抑制了CELL-qPCR檢測下的DNA擴增。在進行45 min的溶壁酶處理后，以細(xì)胞為模板與從細(xì)胞中提取的DNA為模板進行qPCR擴增，兩者Ct值差異明顯縮小。而將溶壁酶處理時間延長到60 min并沒有明顯改變Ct值(P>0.05)。對于不同溶壁酶濃度的影響，如圖2-b所示，與對照組相比，溶壁酶處理后的樣品表現(xiàn)出較低的Ct值。使用CELL-qPCR在75 U的溶壁酶處理下，釀酒酵母細(xì)胞的Ct值與qPCR的量化結(jié)果相似。與75 U的溶壁酶濃度相比，100 U溶壁酶濃度的Ct值無明顯變化(P>0.05)。因此，釀酒酵母溶壁酶預(yù)處理的最佳條件為溶壁酶75 U處理45 min。這也是第一項為CELL-qPCR定量而對釀酒酵母進行的溶壁酶處理的優(yōu)化研究。

2.3 培養(yǎng)基環(huán)境下的標(biāo)準(zhǔn)曲線

為了驗證CELL-qPCR和PMA-CELL-qPCR方法對細(xì)胞的計數(shù)，將這些方法的擴增量與qPCR在相同細(xì)胞懸浮液下的DNA擴增量進行了比較。表3顯示了Ct值與細(xì)胞濃度之間的相關(guān)性。

a-溶壁酶處理時間；b-溶壁酶濃度圖2 釀酒酵母PMA-CELL-qPCR預(yù)處理條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of the pretreatment conditions of S.cerevisiae PMA-CELL-qPCR注：不同字母表示不同組間差異顯著(P<0.05)

表3 在培養(yǎng)基和葡萄酒中使用特異性引物構(gòu)建的 qPCR、CELL-qPCR、PMA-CELL-qPCR的 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)、效率(平板計數(shù)值與循環(huán)閾值的對數(shù))和檢測限Table 3 Correlation coefficients, efficiencies of standard curves (log of plate count value vs.cycle threshold) and detection limit constructed by qPCR, CELL-qPCR, PMA-CELL-qPCR using specific primers in culture and wine

如圖3所示，qPCR方法在102～108CFU/mL的細(xì)胞濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)高于0.99(R2>0.99)。與qPCR方法相比，CELL-qPCR和PMA-CELL-qPCR方法在檢測限上表現(xiàn)出明顯的差異。在CELL-qPCR和PMA-CELL-qPCR方法下，釀酒酵母在細(xì)胞濃度為103～107CFU/mL建立了線性相關(guān)關(guān)系。在本研究中，所有的擴增方法都顯示出良好的擴增效率(0.9～1.1)，qPCR的表現(xiàn)略勝于其他2種檢測方法(表3)。然而，CELL-qPCR的相關(guān)系數(shù)、擴增效率都與qPCR方法相當(dāng)，且省去了DNA提取過程，加快了檢測速度，減少了檢測成本。因此，在對菌株進行定量分析時，CELL-qPCR可以作為qPCR的替代方法。此外，使用PMA-CELL-qPCR方法繪制的釀酒酵母標(biāo)準(zhǔn)曲線在檢測限、相關(guān)系數(shù)和擴增效率等方面都與CELL-qPCR方法下的標(biāo)準(zhǔn)曲線相似。這表明PMA-CELL-qPCR方法同樣具有良好的穩(wěn)定性，可以作為量化活性微生物的方法。

圖3 釀酒酵母在培養(yǎng)基中標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of S.cerevisiae in the medium matrix

2.4 死菌對PMA處理效率的影響

本研究中的PMA-CELL-qPCR方法是為了監(jiān)測葡萄酒發(fā)酵過程中的活菌數(shù)量而提出的。因此，有必要評估葡萄酒發(fā)酵過程中的死菌細(xì)胞是否會影響該方法的準(zhǔn)確性。為了評估死菌如何影響PMA的處理效率，取3個濃度的熱致死細(xì)胞(103、105、107CFU/mL)與活菌細(xì)胞(103、107CFU/mL)按1∶1(體積比)混合。比較使用和不使用PMA處理的混合細(xì)胞樣品的Ct值。ΔCt按照公式(2)計算：

ΔCt=Ct活菌-Ct活死菌混合

(2)

當(dāng)使用CELL-qPCR對微生物種群進行定量時，隨著活菌細(xì)胞中熱致死細(xì)胞濃度的增加，樣品Ct值也明顯增加(圖4)，這表明CELL-qPCR方法不能區(qū)分死菌和活菌。

a-103 CFU/mL活菌;b-107 CFU/mL活菌圖4 不同濃度死細(xì)胞對PMA-CELL-qPCR檢測 103和107 CFU/mL釀酒酵母的影響Fig.4 Effects of concentrations of dead cells on the detection of 103 and 107CFU/mL S.cerevisiae by PMA-CELL-qPCR注：不同大寫字母表示不同組未經(jīng)PMA處理差異顯著，不同 小寫字母表示不同組間PMA處理差異顯著(P<0.05)

如圖4-a所示，PMA處理使CELL-qPCR的活菌細(xì)胞定量得到明顯改善，活菌細(xì)胞(103CFU/mL)與103和105CFU/mL熱致死細(xì)胞混合，與單純的活菌細(xì)胞相比，Ct值差異不顯著(P>0.05)。在與107CFU/mL熱致死細(xì)胞混合的活菌細(xì)胞樣品中，ΔCt值明顯增加(P<0.05)。表明過量的死菌會降低PMA分子與DNA分子相互作用的效率[20]。當(dāng)活菌數(shù)量≤死菌數(shù)量時，PMA-CELL-qPCR方法可以有效抑制死菌的擴增。TAKAHASHI等[21]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)活菌與死菌的比例高于1∶1 000時，PMA-qPCR可以準(zhǔn)確地量化活的金黃色葡萄球菌的數(shù)量，與本研究結(jié)果一致。

對于濃度為107CFU/mL的活菌細(xì)胞，加入3個濃度水平的熱致死細(xì)胞并沒有改變ΔCt值(P>0.05)(圖4-b)，表明PMA-CELL-qPCR定量分析可以在高水平活菌條件下取得更可靠的結(jié)果，死菌產(chǎn)生的干擾可被PMA有效地消除。值得注意的是，當(dāng)死菌與活菌比例高于10 000∶1時，PMA-CELL-qPCR測定可能產(chǎn)生0.5 lg CFU/mL的細(xì)胞定量檢測誤差。當(dāng)死菌與活菌比例低于100∶1時，PMA-CELL-qPCR方法可以消除死活菌的錯誤判斷，提供準(zhǔn)確可靠的活菌群體定量。

2.5 葡萄酒中標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖5所示，在葡萄酒基質(zhì)中，使用CELL-qPCR和PMA-CELL-qPCR方法在細(xì)胞濃度為103～107CFU/mL時觀察到線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。這與YPD培養(yǎng)基中觀察到的釀酒酵母群體的標(biāo)準(zhǔn)曲線相似(圖3)。同時，2種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線都表現(xiàn)出良好的重復(fù)性(R2>0.98)(表3)。對于PMA-CELL-qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，平谷葡萄酒和懷來葡萄酒中釀酒酵母的擴增效率分別為1.012和1.085，與CELL-qPCR技術(shù)下的擴增效率相當(dāng)，表明葡萄酒環(huán)境中的PMA預(yù)處理并不影響釀酒酵母的擴增準(zhǔn)確性。PMA-CELL-qPCR和CELL-qPCR在監(jiān)測葡萄酒基質(zhì)中的釀酒酵母種群方面可以發(fā)揮類似的作用，PMA-CELL-qPCR方法可以替代CELL-qPCR方法檢測葡萄酒發(fā)酵過程中的釀酒酵母菌群動態(tài)變化。

a-平谷葡萄酒；b-懷來葡萄酒圖5 釀酒酵母在葡萄酒基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of S.cerevisiae in wine matrix

2.6 PMA-CELL-qPCR在葡萄酒中的應(yīng)用

選取平谷和懷來2個地區(qū)的赤霞珠葡萄榨汁滅菌(不含酵母)，研究是否可以利用PMA-CELL-qPCR方法來監(jiān)測葡萄酒釀造過程中的活菌群動力學(xué)。平谷和懷來葡萄汁的初始還原糖含量如表4所示。

表4 兩個產(chǎn)地葡萄酒在發(fā)酵前后的還原糖含量 單位：g/L

在葡萄汁中接種濃度為106CFU/mL的釀酒酵母，以啟動酒精發(fā)酵(圖6)。整個酒精發(fā)酵過程持續(xù)了16 d。采用平板計數(shù)、CELL-qPCR和PMA-CELL-qPCR方法測定2種葡萄酒樣品中的釀酒酵母活菌數(shù)。

如圖6-a所示，在平谷葡萄酒中，由于葡萄汁中的營養(yǎng)物質(zhì)充足，在酒精發(fā)酵的初始階段，釀酒酵母迅速生長。在酒精發(fā)酵的第6天，釀酒酵母的數(shù)量快速增加，并達(dá)到了最高濃度(2.57×107CFU/mL)，3種檢測方法顯示了相似的釀酒酵母數(shù)量。3種檢測方法顯示了相似的釀酒酵母數(shù)量?？赡苁且驗槠咸丫浦械母郀I養(yǎng)水平，大部分的釀酒酵母是有活力的。在酒精發(fā)酵的中期階段(第6～12天)，葡萄酒樣品中的釀酒酵母數(shù)量保持在107CFU/mL的水平。使用CELL-qPCR檢測方法計算的釀酒酵母數(shù)量明顯高于(10倍)實際存活的菌株數(shù)量，釀酒酵母的變化隨著酒精發(fā)酵過程的進行而增加，通過CELL-qPCR測定的釀酒酵母菌濃度比實際活菌濃度高104倍?？赡苁且驗獒劸平湍傅募?xì)胞壁結(jié)構(gòu)可以延遲細(xì)胞的降解，從死亡的釀酒酵母中釋放的DNA分子可以在葡萄酒中保持一定的時間[22]。酒精發(fā)酵后期(第12～16天)，釀酒酵母的數(shù)量明顯減少，可能是由于葡萄酒中營養(yǎng)水平降低以及還原糖含量的減少導(dǎo)致的。在發(fā)酵結(jié)束后的一段時間內(nèi)，有活力的釀酒酵母數(shù)量不斷減少。

如圖6-b所示，在懷來葡萄酒的發(fā)酵過程中，經(jīng)平板計數(shù)、CELL-qPCR和PMA-CELL-qPCR方法證實，在酒精發(fā)酵的初始階段，釀酒酵母細(xì)胞濃度快速增至107CFU/mL。然而，與平板計數(shù)法和PMA-CELL-qPCR方法相比，CELL-qPCR方法對菌株的計數(shù)結(jié)果在葡萄酒的其余釀造期(第6～20天)均表現(xiàn)出差異。用PMA-CELL-qPCR方法測定的葡萄酒中的活菌細(xì)胞數(shù)與用平板計數(shù)法測定的結(jié)果相似。酒精發(fā)酵結(jié)束后，由于還原糖含量減少，釀酒酵母數(shù)量呈下降趨勢。表明不同的葡萄酒基質(zhì)對死菌的降解速度以及死菌釋放的DNA可能起到不同的作用。

a-平谷葡萄酒發(fā)酵；b-懷來葡萄酒發(fā)酵圖6 通過不同方法對葡萄酒釀造過程中 釀酒酵母進行定量分析Fig.6 Quantitative analysis of S.cerevisiae during wine brewing determined by different methods

由于2種葡萄酒樣品都存在大量的死菌，CELL-qPCR方法顯示死菌與活菌數(shù)量存在巨大差異。然而，在PMA-CELL-qPCR和平板計數(shù)法之間發(fā)現(xiàn)細(xì)胞群計數(shù)誤差僅為0.5 lg CFU/mL，可能是由于發(fā)酵過程葡萄酒體系中存在大量VBNC狀態(tài)的微生物。與本研究結(jié)果類似，使用qPCR、PMA-qPCR和平板法計數(shù)Majiapo葡萄酒中釀酒酵母動態(tài)變化時，qPCR與平板計數(shù)相差一個數(shù)量級，而PMA-qPCR與平板結(jié)果擬合較好[19]。與本實驗不同的是，以DNA為模板的擴增在提取DNA過程中會去除環(huán)境DNA干擾因素，相比CELL-qPCR，qPCR計數(shù)方法與平板計數(shù)誤差小于本研究中結(jié)果。

圖6中，PMA-CELL-qPCR方法確定的釀酒酵母細(xì)胞計數(shù)結(jié)果與平板計數(shù)法測量的結(jié)果相當(dāng)一致，表明PMA-CELL-qPCR可以準(zhǔn)確、可靠地測定葡萄酒中的活體微生物。更重要的是，這種技術(shù)可以在不考慮微生物濃度水平的情況下直接檢測和量化葡萄酒中的活性微生物群體。

3 結(jié)論

本研究通過將PMA與CELL-qPCR相結(jié)合，優(yōu)化了PMA處理濃度、CELL-qPCR前處理方法，并最終利用PMA-CELL-qPCR準(zhǔn)確定量，開發(fā)的PMA-CELL-qPCR計數(shù)方法能夠準(zhǔn)確量化葡萄酒相關(guān)基質(zhì)中的釀酒酵母的活菌數(shù)量。且這種檢測方法省略了DNA提取過程，可以將死菌與活菌區(qū)分開來，同時降低假陽性結(jié)果出現(xiàn)的可能。此外，與葡萄酒釀造過程中的傳統(tǒng)平板計數(shù)法相比，PMA-CELL-qPCR表現(xiàn)出了一致的計數(shù)結(jié)果，極大提升了工作效率。該方法在食品領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景，為葡萄酒及果酒產(chǎn)品發(fā)酵過程中活菌快速檢測提供了新的參考方法。