巴卡亭III 對心房纖維化的作用及其機制研究

陳 龍 ,方國建 ,唐東方 ,林 雷 ,蔡俊鋒 ,周黎瑾 ,許 凌,沈 煒,劉 洋,高 文*

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院,上海 200040;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院,上海 200092）

心律失常是臨床最常見的心血管疾病之一.心衰發(fā)生率隨年齡增長而增加,且心律失常會增加心衰患者住院率、病死率及死亡率.慢性心衰合并心律失常在臨床較為常見且形式多樣,其中慢性心衰合并房顫最為常見[1],其比率超過30%.兩者互為因果關(guān)系,主要與其有共同的發(fā)病危險因素有關(guān),如年齡大、肥胖、高血壓、糖尿病、睡眠呼吸暫停等[2-3].兩者在病理生理機制上也相互促進(jìn),例如心衰可明顯增加心房纖維化、心房牽張以及氧化應(yīng)激等,從而進(jìn)一步促進(jìn)房顫的發(fā)生發(fā)展,最終形成一個惡性循環(huán)[4-5].因此,針對心衰相關(guān)房顫發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)(如心房纖維化)尋找可能的治療藥物是目前的重點研究方向.

巴卡亭III (Baccatin III,BAC)與紫衫醇同為紅豆杉的活性成分,且結(jié)構(gòu)相似.其作為紫衫醇合成的前體化合物,細(xì)胞毒性只有紫杉醇的0.1%～1%,且免疫調(diào)節(jié)活性更為顯著[6-7].此外,紫杉醇因其具有獨特的抗癌和抗纖維化作用,已成為研究熱點,而既往研究亦表明巴卡亭III 具有抗肺纖維化的作用[8].因此,本研究旨在探索巴卡亭III 在心衰誘導(dǎo)的心房纖維化中是否可以發(fā)揮作用及可能的作用機制,從而為尋找心衰相關(guān)房顫的有效治療藥物提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

野生型C57BL/6 購于上海斯萊克實驗動物中心;血管緊張素II (angiotensin II,Ang-II)購于MCE公司;巴卡亭III 購于陶素公司;DMEM 高糖培養(yǎng)基、DMEM 低糖培養(yǎng)基、PBS 粉末、二型膠原酶、0.25%胰酶(含0.02%EDTA)、Hanks 緩沖溶液以及胎牛血清等購于Gibco 公司;青霉素-鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS)以及細(xì)胞凍存液購于生工生物公司;Collagen I、α-SMA、CTGF、p-Smad2、p-Smad3、Smad2/3 等抗體購于CST 公司.

1.2 方法

1.2.1 小鼠心衰模型的制作

取6～8 周齡的野生型雄性C57BL/6 小鼠,使用戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔注射麻醉,并通過觀察肌肉抽動、夾尾等方法觀察麻醉的充分性.此后將小鼠仰面固定在手術(shù)板上,用眼科剪將胸骨剪開小口,橡皮筋撐開胸骨,完全暴露手術(shù)視野.輕輕地將一根直徑為27 號的結(jié)扎桿平行主動脈弓放置,然后用一根直徑7-0 的絲線將主動脈和結(jié)扎桿扎緊,將結(jié)扎桿緩慢取出,造成主動脈的部分縮窄;假手術(shù)組的小鼠進(jìn)行同樣的手術(shù)步驟,區(qū)別為不進(jìn)行主動脈收縮[9].等待小鼠蘇醒,放回SPF 環(huán)境中進(jìn)行飼養(yǎng).心衰手術(shù)的評價標(biāo)準(zhǔn): 術(shù)后8 周,用小動物心臟超聲檢測小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)來評估是否造模成功,若EF 顯著低于假手術(shù)組的值,則說明造模成功.

1.2.2 小鼠心臟超聲檢查

小鼠心衰模型手術(shù)8 周后進(jìn)行心臟超聲檢查(Vivid 7,GE Healthcare).首先用2%的異氟烷進(jìn)行麻醉,控制心率在400～500 之間.隨后進(jìn)行小鼠心功能的參數(shù)采集,主要為反映左心室功能的EF 和反映左心房功能的左心房內(nèi)徑(LAD).

1.2.3 免疫組化和免疫熒光

將臨床樣本的心房組織或小鼠的心房組織用10%福爾馬林固定24 h 后,石蠟包埋,4 μm 厚度的切片機切片.按照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行馬松染色和免疫熒光染色.馬松染色主要用來檢測心房纖維化的程度,免疫熒光染色主要觀察心房成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞的數(shù)量.

1.2.4 成年C57BL/6 小鼠心房肌細(xì)胞的分離和藥物處理

主要參考了Wang等[11]分離小鼠心房成纖維細(xì)胞的方法.簡言之,取6～8 周的野生C57BL/6 小鼠,行脫頸處死后,用70%酒精浸泡消毒,取下小鼠心臟左右心房.用PBS 沖洗心房3～4 次,剪碎,用含1 500 U·mL-1二型膠原酶、0.25%胰蛋白酶和15 mg·L-1牛血清白蛋白的消化液在37 ℃水浴鍋消化20 min.至形成單細(xì)胞懸液,用含有10%胎牛血清的DMEN 培養(yǎng)基終止消化.通過直徑70 μm 的細(xì)胞濾網(wǎng)進(jìn)行過濾,離心,重懸在10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中,37 ℃孵育60 min,通過差速貼壁的方法獲得成纖維細(xì)胞.培養(yǎng)24 h 后,換成無糖培養(yǎng)基,根據(jù)實驗?zāi)康姆譃閷φ战M、單純加Baccatin III 處理組、單純加Ang-II 處理組以及同時加Ang-II和Baccatin III 處理組進(jìn)行實驗.

1.2.5 細(xì)胞遷移實驗

使用胰酶將培養(yǎng)的心房成纖維細(xì)胞消化后,用無血清培養(yǎng)基以2.0×105個·mL-1的密度種植在Transwell 板中,在上層中加入含Ang-II (1 μM)的600 μL 培養(yǎng)基,放入孔中繼續(xù)培養(yǎng).第2 天,洗去未遷移到下一層的細(xì)胞,已經(jīng)遷移的細(xì)胞用10%的福爾馬林固定后,再用0.25%的結(jié)晶紫染色,為每個視野內(nèi)的遷移細(xì)胞拍照.

1.2.6 熒光定量PCR

實時定量PCR采用TRIzol 試劑提取細(xì)胞的總RNA,Primer-Script 一步法RT-PCR 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA.利用SYBR Premix Dimmer Erase試劑盒通過qRT-PCR 擴增cDNA.每個樣本的基因表達(dá)用內(nèi)參GAPDH 均一化.引物購自生工生物公司,見表1.以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 的相對表達(dá)水平.

表1 qRT-PCR 分析的基因引物序列

1.2.7 Western 印跡法

將經(jīng)過處理的小鼠心房肌細(xì)胞用PBS 洗滌3次.加入強RIPA裂解液,置冰上30 min,然后轉(zhuǎn)移至新的EP 管中離心10 min.取上清液,用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白,按比例加入蛋白上樣緩沖液 95 ℃煮沸 10 min.取 20 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上.用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入一抗(1:1 000),4 ℃搖床孵育過夜,TBST 洗膜3 次后加入HRP 二抗(1:1 000)室溫?fù)u床1 h,繼續(xù)TBST 洗膜3 次,用化學(xué)發(fā)光成像分析儀對條帶進(jìn)行分析.

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析.每一個實驗重復(fù)3 次以上,計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.兩組之間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗,多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 實驗結(jié)果

2.1 心衰與房顫的相關(guān)性

為驗證心衰與房顫的相關(guān)性,首先檢測了竇性心律、單純房顫病人以及同時患有心衰和房顫疾病病人的左心房組織的纖維化程度.馬松染色顯示單純房顫病人心房組織纖維化區(qū)域比竇性心律病人更多(P＜0.05),心衰合并房顫病人的左心房組織比單純房顫病人纖維化區(qū)域明顯增加(P＜0.05).同時,在臨床標(biāo)本上進(jìn)一步檢測了與纖維化密切相關(guān)的標(biāo)志物ACTA2 和CTGF的mRNA 水平的改變,也得到了一致的結(jié)果,如圖1 所示,表明心衰確實可以加重左心房的纖維化水平.

圖1 左心房組織纖維化程度差異

2.2 巴卡亭III 對心房成纖維細(xì)胞的作用

為了驗證巴卡亭III 是否對心衰誘導(dǎo)的心房纖維化有作用,首先在體外分離的心房成纖維細(xì)胞上進(jìn)行了實驗.細(xì)胞增殖實驗表明,在給予0、5、10、20、40 μmol·L-1濃度的巴卡亭III 刺激心房成纖維細(xì)胞48 h 的情況下,細(xì)胞活性并沒有受到明顯的影響,說明巴卡亭III 沒有明顯的細(xì)胞毒性,因此選擇最大濃度40 μmol·L-1進(jìn)行了后續(xù)實驗.細(xì)胞免疫熒光實驗(圖2(a)～(b))證明,使用1 μm 的Ang-II 因子刺激心房成纖維細(xì)胞48 h 可以顯著增加細(xì)胞的大小和膠原纖維的形成,α-SMA標(biāo)志陽性的肌成纖維細(xì)胞增多,同時給予40 μmol·L-1巴卡亭III處理的情況下,膠原纖維明顯降低,α-SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞比例明顯下降(P＜0.01).進(jìn)一步通過細(xì)胞遷移實驗(圖2(c)～(d))證明,Ang-II 因子刺激48 h 后可以促進(jìn)心房成纖維細(xì)胞的遷移,同時加入巴卡亭III可以降低細(xì)胞遷移的程度(P＜0.01).最后還檢測了纖維化相關(guān)的因子Collagen I、α-SMA以及CTGF 的蛋白水平的改變,如圖2(e)～(g)所示,巴卡亭III 40 μmol·L-1處理后可以顯著下調(diào)由于Ang-II 因子刺激所引起的纖維化蛋白的上調(diào).上述實驗表明,巴卡亭III 可以通過減少心房成纖維細(xì)胞的分化、遷移和纖維化蛋白的分泌來抑制Ang-II誘導(dǎo)的心房成纖維細(xì)胞的激活.

圖2 巴卡亭III 在體外減輕Ang-II 誘導(dǎo)的心房成纖維細(xì)胞的分化、遷移和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力

2.3 巴卡亭III 對心房纖維化的作用

既往研究已經(jīng)表明,通過小鼠主動脈弓縮窄可以造成顯著的射血分?jǐn)?shù)下降的心衰模型以及相應(yīng)的左心房的擴大和纖維化水平升高[12-13].為了驗證巴卡亭III 在體給藥是否對心衰誘導(dǎo)的心房重構(gòu)具有保護(hù)作用,參照之前的給藥方法,對心衰小鼠10 mg·kg-1劑量腹腔給藥[8],并觀察相應(yīng)指標(biāo).如圖3(a)～(b)所示,心衰模型可以導(dǎo)致顯著的射血分?jǐn)?shù)下降,而同時給予巴卡亭III 的治療組具有明顯的保護(hù)效應(yīng),且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01).通過超聲心動圖檢查心衰誘導(dǎo)的左心房擴大顯示,心衰模型可顯著造成左心房的擴大,而巴卡亭III的治療可以明顯逆轉(zhuǎn)心衰所引起的這種作用(P＜0.01,圖3(c)～(d)).進(jìn)一步對各組小鼠左心房組織切片后行馬松染色,并計算心房纖維化的面積大小,結(jié)果顯示,心衰組相較于假手術(shù)組大鼠心房纖維化程度明顯增加(P＜0.01),而經(jīng)過巴卡亭III處理后可以明顯減輕心衰誘導(dǎo)的心房纖維化程度,表現(xiàn)為心房間質(zhì)和血管周的纖維化程度下降(圖3(e)～(f)).最后,提取各組心房組織進(jìn)行Western 印跡法檢測心肌纖維化標(biāo)志物(圖3(g)～(h)),發(fā)現(xiàn)與對照組相比,心衰模型可以顯著增加左心房組織Collagen I、α-SMA 以及CTGF 的表達(dá)(P＜0.01),而巴卡亭III 給藥后,這些重要的纖維化標(biāo)志物降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01).上述結(jié)果表明,巴卡亭III 在體給藥可以顯著降低心衰誘導(dǎo)的心房重構(gòu).

圖3 巴卡亭III 在體內(nèi)可以減輕心衰誘導(dǎo)的心功能下降,心房擴大和心房纖維化改變

2.4 巴卡亭III 對TGF-β1/Smad2/3 信號通路的作用

為了驗證巴卡亭III 如何在心衰誘導(dǎo)的心房纖維化中發(fā)揮作用,本文關(guān)注了與纖維化發(fā)生關(guān)系密切的經(jīng)典的TGF-β1/Smad2/3 信號通路[8,14-15].首先檢測了Ang-II 刺激的心房成纖維細(xì)胞上該信號通路的激活,發(fā)現(xiàn)與給PBS 組相比,Ang-II 刺激心房成纖維細(xì)胞48 h 后可以顯著上調(diào)TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 的表達(dá)水平,而同時給予Ang-II和巴卡亭III 后可以起到明顯的保護(hù)作用,表明巴卡亭III 在細(xì)胞水平上可以抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路的激活(圖4(a)～(b)).此外,在動物水平方面,也在假手術(shù)組、假手術(shù)組+巴卡亭III 給藥組、心衰手術(shù)組、心衰手術(shù)+巴卡亭III 給藥組中檢測了TGF-β1/Smad2/3 信號通路的表達(dá)水平,與細(xì)胞實驗得到的結(jié)果相似,心衰模型可以顯著激活左心房組織內(nèi)TGF-β1/Smad2/3 信號通路的水平,而心衰手術(shù)+巴卡亭III 給藥組可以具有明顯的下調(diào)作用,兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(圖4(c)～(d)).

圖4 巴卡亭III 通過TGF-β1/Smad2/3 信號通路發(fā)揮作用

3 討論

心衰是房顫發(fā)生發(fā)展過程中最重要的獨立危險因素之一,在臨床上,兩者總是伴隨出現(xiàn)[16-17].心衰可以加重心房的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu),進(jìn)而促進(jìn)房顫的發(fā)生與維持;反過來,房顫也會大大提高心衰相關(guān)心血管事件的發(fā)生率和死亡率[18].在這一病理生理過程中,心房纖維化往往被認(rèn)為是心衰病人發(fā)生房顫最重要的結(jié)構(gòu)特征,大量研究表明心衰進(jìn)展與心房纖維化密切相關(guān).心房纖維化是炎癥或其他損傷導(dǎo)致的纖維結(jié)締組織對心房侵害的結(jié)果.在后負(fù)荷增加引起的心衰模型中,心肌細(xì)胞肥厚觸發(fā)炎癥反應(yīng),激活鄰近的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞,導(dǎo)致膠原蛋白性瘢痕沉積.同時,其他的病理生理狀況也會誘發(fā)隱性間質(zhì)和血管周膠原沉積,最終導(dǎo)致心房纖維化,比如高血壓或主動脈瓣狹窄引起的壓力超負(fù)荷以及瓣膜反流性病變引起的容量超負(fù)荷.另外,肥厚型心肌病、擴張型心肌病、代謝紊亂以及多種毒性損傷,在疾病進(jìn)展到后期,也可以表現(xiàn)為明顯的心房纖維化,同時導(dǎo)致心肌細(xì)胞之間電耦聯(lián)及心電傳導(dǎo)異常,引起房顫等房性心律失常[19].

抑制或逆轉(zhuǎn)心房成纖維細(xì)胞的激活及其不良后果是目前臨床用于治療房顫干預(yù)措施的主要目標(biāo).但由于心房纖維化的病理機制復(fù)雜,且存在諸多危險因素及作用機制,所以目前針對心房纖維化的治療方法匱乏且療效甚微[20-21].Ang-II 及其受體在心肌纖維化病理進(jìn)程中起重要作用,低劑量的Ang-II 可用于體外激活心房成纖維細(xì)胞[22].

本研究首先將從臨床收集到的左心房樣本按照是否為竇性心律,有無心衰分為: 竇性心律、單純房顫病人、心衰伴有房顫病人三類,著重觀察了纖維化相關(guān)指標(biāo),結(jié)果表明心衰伴有房顫病人的纖維化程度更加嚴(yán)重.體內(nèi)動物實驗顯示,10 mg·kg-1的劑量腹腔給藥處理小鼠后可顯著降低胸主動脈縮窄8 周引起的心房纖維化,減輕其引起的大鼠心功能不全、左心房擴大和左心房纖維化.體外細(xì)胞實驗顯示,巴卡亭III 可顯著抑制Ang-II 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞分化和遷移以及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力,同時給予不同濃度的巴卡亭III 對細(xì)胞的活性未造成明顯影響,表明它是一種安全的抑制心肌纖維化的藥物[21].在研究巴卡亭III 的抗纖維化機制上,參照了既往的研究,巴卡亭III 可以通過抑制Ang-II 對經(jīng)典的TGF-β1/Smad2/3 信號通路的激活作用而發(fā)揮作用,給予巴卡亭III 后可以大大減少心房成纖維細(xì)胞分泌TGF-β1,進(jìn)而抑制下游Smad2/3 信號通路的激活.

綜上,本研究闡述了心衰可以促進(jìn)心房纖維化發(fā)生發(fā)展,巴卡亭III 作為一種新型的抗纖維化藥物,可以通過經(jīng)典的TGF-β1/Smad2/3 信號通路來抑制心房成纖維細(xì)胞的激活和心衰誘導(dǎo)的心房纖維化的進(jìn)展,表明巴卡亭III 可能一種是防治心衰誘導(dǎo)的心房纖維化的潛在治療藥物.