煙臺地區(qū)豬源大腸桿菌分離鑒定及耐藥性分析

●宋慶華（山東省煙臺市蓬萊區(qū)村里集畜牧獸醫(yī)站 山東 煙臺 265612）

大腸桿菌對仔豬危害性較大，感染仔豬會出現(xiàn)腹瀉、脫水、生長緩慢等癥狀，甚至突發(fā)死亡，由于仔豬免疫力較低，還易感染其他細菌、病毒等，進而影響生豬正常發(fā)育，同時大腸桿菌引發(fā)的仔豬黃、白痢還具有傳染性，不利于仔豬健康成長[1]。為保障生豬正常生長和出欄，許多養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶在生豬養(yǎng)殖過程中定期使用抗生素藥物進行疾病防治，但長期用藥或過量使用均可造成抗生素藥物在生豬體內(nèi)殘留，不僅影響豬肉產(chǎn)品質(zhì)量，還會因糞尿排泄中含有抗生素破壞土壤和生態(tài)環(huán)境[2]。因此，合理選擇抗生素治療，縮短用藥時間，降低細菌耐藥性問題尤為重要。本試驗通過采集山東煙臺某豬場腹瀉病料，經(jīng)過細菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色、生化鑒定和藥敏試驗建立豬源大腸桿菌耐藥譜，為臨床合理選用防治藥物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2021年11月初在山東煙臺某養(yǎng)豬場對出現(xiàn)腹瀉癥狀的生豬進行肛拭樣本采樣，共采集132例樣本。

1.2 試劑與儀器

磷酸鹽緩沖液、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色液試劑盒、氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、氯霉素、鏈霉素、氨芐西林、卡那霉素、頭孢他啶、阿米卡星、頭孢噻肟、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、氨曲南、頭孢哌酮、哌拉西林等藥敏紙片購自北京索萊寶科技有限公司。葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、七葉苷、山梨醇、蛋白胨水、MR-VP培養(yǎng)基、吲哚、尿素、硫化氫、苯丙氨酸、西蒙氏枸櫞酸鹽、克氏檸檬酸鹽等細菌生化反應(yīng)管購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

精密電子天平（型號：JA2603B，上海精科天美儀器有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（型號：JH-100A，青島景弘環(huán)?？萍加邢薰荆?，光學(xué)顯微鏡（型號：BA310Digital，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司），超凈工作臺（型號：SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌的分離培養(yǎng)將肛拭樣本與100 μL磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4，無菌）均勻混合，浸泡1 h后，取50 μL混合溶液分別均勻涂布于普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)約20 h，從麥康凱瓊脂平板挑取單菌落置于SS瓊脂平板和伊紅美蘭瓊脂，相同條件下培養(yǎng)后觀察細菌生長狀態(tài)。

1.3.2 革蘭氏染色和形態(tài)觀察從麥康凱瓊脂平板挑取菌落制成涂片，利用革蘭氏染色法進行染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察細菌顏色、形態(tài)。

1.3.3 生化試驗按生化反應(yīng)管操作說明進行細菌生化鑒定。

1.3.4 藥敏試驗按照藥敏紙片（擴散法）說明書對分離的病原菌進行藥敏試驗。將純化細菌液制成1×108CFU/mL懸液，無菌條件下吸取100 μL，均勻涂布到普通瓊脂平板上，然后用無菌鑷子將藥敏紙片輕輕放置到瓊脂表面，在37℃培養(yǎng)20 h后測定抑菌圈直徑，判斷病原菌對藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離和初步鑒定

132例樣本中共分離到豬源大腸桿菌86株，豬源大腸桿菌在普通瓊脂平板上可見圓形、光滑的白色菌落，在麥康凱瓊脂平板上可見圓形、光滑的玫紅色菌落，在SS瓊脂平板上可見圓形、光滑的紅色菌落，在伊紅美蘭瓊脂上可見圓形、有金屬光澤的深褐色或黑色菌落。革蘭氏染色結(jié)果顯示涂片上有紅色、短小桿菌。

2.2 生化試驗結(jié)果

生化試驗結(jié)果，見表1。

表1 分離菌株的生化試驗結(jié)果

將分離純化的細菌進行生化鑒定（表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)細菌在葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、阿拉伯糖生化試管中可產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，在七葉苷、VP、尿素、硫化氫、苯丙氨酸、西蒙氏枸櫞酸鹽、克氏檸檬酸鹽的試驗結(jié)果為陰性，在山梨醇、蛋白胨水（色氨酸肉湯）、MR、吲哚的試驗結(jié)果為陽性。參照文獻[3]，與大腸桿菌的基本生化特性相符。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

分離菌株的藥敏試驗結(jié)果，見表2。

表2 分離菌株的藥敏試驗結(jié)果

如表2所示，從抗生素類別來分析，上述菌株對青霉素類（耐藥比例為66.28%～80.23%）、氨基糖苷類（耐藥比例為43.02%～82.56%）、喹諾酮類（耐藥比例為37.21%～68.60%）具有一定的耐藥性。而對頭孢類、單酰胺環(huán)類、氯霉素類藥物表現(xiàn)出不同程度的敏感，對頭孢唑啉（敏感比例為97.67%）、頭孢哌酮（敏感比例為96.51%）、氨曲南（敏感比例為84.88%）、氯霉素（敏感比例為94.19%）高度敏感。從細菌的多重耐藥性來分析，耐藥率超過60%的抗生素藥物共有7種，表明豬場在防治生豬腹瀉時存在多重耐藥問題。

3 討論

豬肉一直居于我國生肉消耗量的首位，豬場產(chǎn)品的安全性同消費者日常飲食安全密切相關(guān)。大腸桿菌是伴隨人畜生產(chǎn)生活的一種條件性致病菌，動物機體的腸道組織內(nèi)存在少量大腸桿菌，氣溫驟變、衛(wèi)生不良、應(yīng)激刺激等均可造成大腸桿菌大量繁殖，進而出現(xiàn)一系列炎癥反應(yīng)。

由于大腸桿菌是引發(fā)生豬細菌性腹瀉的主要病原體之一，且屬革蘭氏陰性菌，對其進行耐藥性試驗還能側(cè)面反映仔豬副傷寒、豬肺疫、豬布氏桿菌病、豬放線菌病等革蘭氏陰性菌株的藥物敏感問題。

耐藥菌株主要和抗生素用量、使用頻率有關(guān)。從細菌耐藥性來看，主要包括單一抗生素耐藥和多重耐藥現(xiàn)象。孫慧琴等[4]分離鑒定了443株豬源大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對8種抗生素的耐藥率超過70%，對5種抗生素的耐藥率超過90%。鄧珊珊等[5]對某規(guī)?；i場豬源大腸桿菌進行分離株藥敏試驗和耐藥基因PCR檢測，發(fā)現(xiàn)豬源大腸桿菌對氨芐西林、環(huán)丙沙星、青霉素等抗生素存在耐藥性問題，PCR結(jié)果顯示9種耐藥基因均能檢出，表明豬場存在大腸桿菌耐藥性和多重耐藥問題。本試驗發(fā)現(xiàn)，分離獲得的豬源大腸桿菌對氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素、諾氟沙星的耐藥率超過65%，表明豬場存在多重耐藥問題，但對氯霉素這種禁用抗生素的敏感性較高，表明豬場對國家規(guī)定的生豬養(yǎng)殖禁用藥存在認知，但對其他非禁用抗生素的使用仍存在不合理性。

為保障豬肉產(chǎn)品安全，有關(guān)部門需要加大豬肉產(chǎn)品耐藥性監(jiān)測，以防因豬肉產(chǎn)品的藥物殘留導(dǎo)致食用者出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)和過敏反應(yīng)等。李榮等[6]研究發(fā)現(xiàn)，育肥豬日糧中添加0.5%益生菌可提高盲腸中的乳酸桿菌數(shù)量，減少腹瀉發(fā)病率。藍婧婷等[7]研究發(fā)現(xiàn)保育豬飼料為80%基礎(chǔ)日糧+20%發(fā)酵飼料的，仔豬腹瀉率顯著下降了74.35%，且血清中的IgM含量顯著提高了100%。鄧位喜等[8]研究發(fā)現(xiàn)仔豬日糧中添加復(fù)方杜仲中草藥發(fā)酵制劑，腹瀉發(fā)生率降低了11.67%，且仔豬日增重提高了6.02%。因此，建議豬場和養(yǎng)殖戶生產(chǎn)中使用益生菌、發(fā)酵飼料、中草藥添加劑等減抗和替抗產(chǎn)品，促進生豬健康養(yǎng)殖。

4 結(jié)論

本試驗通過對檢出的86株豬源大腸桿菌進行檢測，結(jié)果顯示該豬場的大腸桿菌病原體對7種抗生素藥物的耐藥率超過60%，對頭孢唑啉、頭孢哌酮、氨曲南和氯霉素（禁用藥）高度敏感，以上結(jié)果可為生豬大腸桿菌感染的治療提供用藥參照。同時建議使用益生菌等減抗替抗產(chǎn)品，促進生態(tài)健康養(yǎng)殖。