益生菌復(fù)合配方對小鼠腸道功能的影響

汪家琦 康文麗 吳忠坤 唐溶雪 彭 燦 戴智勇 董 玲 潘麗娜

(1. 澳優(yōu)乳業(yè)〔中國〕有限公司，湖南 長沙 410127; 2. 湖南澳優(yōu)食品與營養(yǎng)研究院，湖南 長沙 410299; 3. 人體微生態(tài)制品湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410017;4. 錦喬生物科技有限公司，江蘇 淮安 223005)

常見胃腸道疾病如便秘、腹瀉和炎癥性腸病等胃腸道疾病嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。益生菌是一類對宿主有益的活的微生物，具有維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，抑制有害菌的生長，調(diào)節(jié)腸道微生物組成，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[1-2]。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，益生菌的攝入能有效調(diào)節(jié)腸道菌群，降低pH，增強(qiáng)小腸蠕動，改善便秘。益生菌制劑對維持腸道菌群紊亂，提高腸道菌群的定殖能力具有顯著效果[4-5]。

研究擬通過構(gòu)建鹽酸洛哌丁胺誘導(dǎo)的功能性便秘、DSS誘導(dǎo)的腸黏膜損傷、抗生素誘導(dǎo)的腹瀉3種模型，探究益生菌復(fù)合配方對小鼠小腸墨汁推進(jìn)率、排便情況、腸黏膜組織切片、腸黏膜損傷評分、腹瀉評分等指標(biāo)的影響，為推動益生菌復(fù)合配方工業(yè)化生產(chǎn)，應(yīng)用于腸道疾病的合理有效性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

萃可舒益生菌復(fù)合配方：具體成分為乳雙歧桿菌CP-9(BifidobacteriumlactisCP-9)、嬰兒雙歧桿菌BLI-02(BifidobacteriuminfantisBLI-02)、短雙歧桿菌BV-889(BifidobacteriumbreveBV-889)、鼠李糖乳桿菌MP-108(LactobacillusrhamnosusMP-108)、嗜熱鏈球菌SY-66(StreptococcusthermophilusSY-66)，輔料為低聚半乳糖、低聚乳糖、麥芽糊精、乳糖醇，澳優(yōu)乳業(yè)(中國)有限公司；

鹽酸洛哌丁胺：美國Selleck公司；

阿拉伯樹膠：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

活性碳粉：型號為10006619，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

硫酸葡聚糖鈉(DSS)：北京酷來搏科技有限公司；

硫酸慶大霉素注射液：2 mL，8萬單位/支，批號 5120106，上?，F(xiàn)代哈森(商丘)藥業(yè)有限公司；

頭孢拉定膠囊：0.25 g/粒，批號110804，廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

顯微鏡：SG50-2A43L-A型，蘇州神鷹光學(xué)有限公司；

組織切片機(jī)：McIlwain型，上海玉研科學(xué)儀器有限公司；

超凈工作臺：BBS-SDC型，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；

滅菌鍋：LMQ.C型，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：5810R型，德國艾本德股份公司。

1.2 試驗(yàn)動物

健康雄性BALB/c小鼠300只，體重18～22 g，倫理審核編號為JN.No20190530b3000730，飼養(yǎng)于江南大學(xué)動物中心，SPF級屏障環(huán)境，來源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.3 便秘模型

益生菌復(fù)合配方人體推薦用量為6 g/d，以人體攝入量的1，10，30倍，設(shè)低、中、高3個劑量組(活菌數(shù)分別為1.5×108，1.5×109，4.5×109CFU)，1個空白對照組和1個模型對照組，每組15只動物，灌胃量為0.2 mL/只，且每2 d調(diào)整灌胃量，具體試驗(yàn)安排及分組見表1。

表1 便秘模型小鼠試驗(yàn)安排及分組情況Table 1 Trial arrangement of mouse constipation model

1.3.1 墨汁推進(jìn)率測定 通過灌胃藥物洛哌丁胺，建立小鼠便秘模型，計算一定時間內(nèi)小腸的墨汁推進(jìn)率，來判斷模型小鼠胃腸蠕動功能[6]。給藥洛哌丁胺0.5 h后，低、中、高劑量組分別給予含受試樣品的墨汁(含5%活性炭粉、10%阿拉伯樹膠)，空白對照組和模型對照組小鼠給予墨汁灌胃。25 min后立即脫頸椎處死動物，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，置于托盤上，輕拉成直線，測量腸管長度為小腸總長度，從幽門至墨汁前沿為墨汁推進(jìn)長度[7]。并按式(1)計算墨汁推進(jìn)率。

(1)

式中：

M——墨汁推進(jìn)率，%；

L1——墨汁推進(jìn)長度，cm；

L——小腸總長度，cm。

1.3.2 排便時間、糞便粒數(shù)和糞便重量測定 通過測定小鼠首次排黑便時間和6 h內(nèi)排便粒數(shù)和排便重量，分析模型小鼠的排便情況[8]。通過灌胃不同濃度的益生菌復(fù)合配方，測定益生菌復(fù)合配方的腸道調(diào)節(jié)作用及對便秘的緩解作用[9-10]。

1.4 腸黏膜損傷模型

通過飲水給予3%硫酸葡聚糖，建立小鼠腸黏膜損傷模型，觀察腸黏膜病理組織學(xué)改變，以此判斷模型小鼠腸黏膜損傷情況[11]。通過灌胃不同濃度的益生菌復(fù)合配方，觀察其對腸黏膜的保護(hù)作用。具體試驗(yàn)分組情況見表2。

表2 腸黏膜損傷小鼠試驗(yàn)安排及分組情況Table 2 Trial arrangement of mouse intestinal mucosal damage model

1.4.1 大便情況疾病活動度(DAI)評分 檢測各組小鼠大便情況疾病活動度，分析各組的病癥情況，具體評分細(xì)則見表3。

表3 大便情況疾病活動度(DAI)評分細(xì)則Table 3 Disease activity index (DAI) of mice stool

1.4.2 蘇木精—伊紅(HE)染色及腸黏膜損傷評價 給予受試樣品13 d后，剪取盲腸末端至肛門的完整結(jié)腸、直腸腸管，觀察各組小鼠結(jié)腸變化，測量結(jié)腸長度和重量并制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色后觀察病理組織學(xué)變化，并按Chiu腸黏膜損傷評分表(表4)進(jìn)行評分[12-13]。

表4 Chiu腸黏膜損傷評分表Table 4 Chiu intestinal mucosal damage score

1.5 腹瀉模型

采用混合抗生素造成菌群紊亂引起的腹瀉模型，給予受試樣品并觀察小鼠腹瀉癥狀及腸黏膜的改變，由此判斷受試樣品對小鼠腹瀉的影響作用[14]。小鼠灌胃混合抗生素主要是由硫酸慶大霉素注射液和頭孢拉定膠囊組成，將硫酸慶大霉素注射液和頭孢拉定膠囊用無菌生理鹽水配成質(zhì)量濃度為62.5 g/L的抗生素混合液[15]，造成小鼠體內(nèi)菌群紊亂進(jìn)而引起腹瀉。通過灌胃不同濃度的益生菌復(fù)合配方，研究益生菌復(fù)合配方對腸黏膜損傷和腹瀉癥狀的改善作用，具體的小鼠試驗(yàn)方案見表5，觀察每組病理組織學(xué)、腸黏膜損傷評分及腹瀉情況。

表5 腹瀉小鼠試驗(yàn)安排及分組情況Table 5 Trial arrangement of mouse diarrhea model

每天觀察并記錄小鼠形態(tài)行為、活動及排便情況，并按照Akinobu Kurita腹瀉評分表進(jìn)行評分[16]。0分：大便正?；驔]有；1分：輕度腹瀉，大便可見輕微濕軟；2分：中度腹瀉，大便較濕且不成型，并有輕度肛周著色；3分：重度腹瀉，水樣便并伴有重度肛周著色。停藥24 h后出現(xiàn)的腹瀉為遲發(fā)性腹瀉。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析[17]。對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換再進(jìn)行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計。字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌復(fù)合配方對小鼠便秘的影響

2.1.1 對小腸墨汁推進(jìn)率的影響 由表6可知，與空白組相比，模型組墨汁推進(jìn)率顯著降低(P<0.05)，說明便秘模型成立。而與模型組相比，低濃度組無顯著差異，益生菌復(fù)合配方(中、高濃度組)能顯著提高墨汁推進(jìn)率(P<0.05)，但高濃度組與空白組的墨汁推進(jìn)率無顯著差異，說明低濃度益生菌作用較弱，且復(fù)合菌液濃度越高，推進(jìn)率越高。在高濃度益生菌的干預(yù)下，小腸墨汁推進(jìn)率能接近正常水平，說明益生菌在便秘條件下能顯著提高小鼠腸道推進(jìn)率，并呈濃度依賴性。

表6 益生菌復(fù)合配方對小鼠小腸墨汁推進(jìn)率的影響Table 6 Effects of the composite probiotics on intestinal ink propulsion rate in mice

2.1.2 對小鼠首粒黑便時間、粒數(shù)及重量的影響 由圖1可知，與空白組相比，模型組首粒黑便時間、黑便粒數(shù)、黑便重量均有顯著差異(P<0.05)，說明便秘模型建立成功。與模型組相比，干預(yù)組(中、高濃度的益生菌復(fù)合配方)能顯著縮短首粒黑便形成時間，并顯著增加6 h內(nèi)黑便粒數(shù)及重量(P<0.05)；但低濃度益生菌組無明顯作用效果；高濃度益生菌組可恢復(fù)至接近空白組水平，說明低濃度益生菌改善便秘的效果不顯著，中、高濃度益生菌復(fù)合配方的攝入可顯著促進(jìn)小鼠腸道蠕動，進(jìn)而促進(jìn)小鼠排便效果，特別是在高濃度的益生菌干預(yù)下小鼠能恢復(fù)到正常水平。

圖1 益生菌復(fù)合配方對小鼠6 h內(nèi)首粒黑便時間、粒數(shù)及重量的影響Figure 1 Effects of composite probiotics on the first defecation time, grain number and weight of 6 h black stools in mice

有研究[18-19]表明，微生態(tài)失衡也是便秘發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。其中成人便秘患者雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、鏈球菌屬均顯著降低[20]。微生物提高腸道動力的原因有：① 微生物主要通過發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸、甲烷等刺激腸道神經(jīng)系統(tǒng)，加快腸道轉(zhuǎn)運(yùn)[21]；② 腸道菌群可影響5-羥色胺(神經(jīng)內(nèi)分泌因子和胃腸激素)的產(chǎn)生，促進(jìn)腸動力[22]。陳家倫等[23]研究表明，益生菌組合物低、高劑量組可顯著提高小腸推進(jìn)率、黑便粒數(shù)和黑便重量，顯著降低首粒黑便時間，具有改善慢傳輸型便秘的作用，與試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.2 益生菌復(fù)合配方對小鼠腸炎的影響

2.2.1 大便情況疾病活動度(DAI)評價及腸黏膜損傷等級 由圖2可知，模型組和干預(yù)組(低、中、高濃度組)DAI得分均高于空白組，說明各組均有不同程度的疾病癥狀。與空白組相比，模型組小鼠DAI評分顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，干預(yù)組(低、中、高濃度組)小鼠DAI評分隨干預(yù)組中益生菌濃度的升高而降低。此外，經(jīng)DSS干預(yù)的小鼠腸黏膜損傷評分等級均顯著高于空白組小鼠(P<0.05)，說明DSS干預(yù)的小鼠出現(xiàn)了急性腸炎的癥狀，造模成功。與模型組相比，低濃度組干預(yù)后的小鼠腸黏膜損傷評分等級無顯著差異，而中、高濃度組干預(yù)后的小鼠腸黏膜損傷評分均顯著降低。說明中、高濃度的益生菌復(fù)合配方在急性腸炎癥狀下對腸黏膜有保護(hù)作用，且高濃度組的效果更佳，但仍未恢復(fù)至空白組水平。

圖2 益生菌復(fù)合配方對小鼠大便情況疾病活動度(DAI)及結(jié)腸黏膜評分的影響Figure 2 Effects of composite probiotics on the disease activity index (DAI) and colonic mucosa grading in mice

2.2.2 結(jié)腸組織切片 由圖3可知，與正常組小鼠結(jié)腸組織相比，模型組小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯的炎癥，隱窩結(jié)構(gòu)組織被破壞；與模型組相比，益生菌復(fù)合配方組大部分隱窩損傷被修復(fù)，組織結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常。益生菌復(fù)合配方能顯著降低DAI及結(jié)腸黏膜損傷評分，可能是益生菌中含有一些專性厭氧菌，可以長期在腸道中定殖，具有維持小鼠腸道微生態(tài)平衡的功能[24]。同時益生菌中具有可以調(diào)節(jié)腸道屏障功能因子，可以分泌抗病源活性物質(zhì)以抑制病原微生物的生長并有效阻止致病菌對小腸上皮細(xì)胞的損傷[25]。另外，益生菌中有一些可產(chǎn)丁酸的菌株，丁酸可有效地修復(fù)腸道黏膜上皮組織的再生，并具有一定的抗炎作用[26]。

圖3 結(jié)腸組織切片F(xiàn)igure 3 Slices of the colon tissues

2.3 益生菌復(fù)合配方對小鼠腹瀉的影響

2.3.1 對小鼠腹瀉評分、結(jié)腸長度及重量的影響 由圖4可知，根據(jù)腹瀉評分，空白組無腹瀉癥狀，其他各組均有不同程度的腹瀉癥狀。與空白組相比，其他各組腹瀉評分均有顯著差異(P<0.05)，說明使用混合抗生素構(gòu)建小鼠腹瀉模型成功。模型組與空白組結(jié)腸長度無顯著差異，說明腹瀉對結(jié)腸長度無明顯影響。在益生菌干預(yù)下結(jié)腸重量比正常小鼠更加發(fā)達(dá)，高濃度組與模型組的結(jié)腸重量具有顯著差異(P<0.05)，說明高濃度益生菌對結(jié)腸重量有明顯作用。

圖4 益生菌復(fù)合配方對小鼠腹瀉評分、結(jié)腸長度及重量的影響Figure 4 Effects of composite probiotics on the diarrhea score, colon length and colon weight

2.3.2 對結(jié)腸黏膜損傷的影響 由表7可知，與空白組相比，其他組腸黏膜損傷評分均具有顯著差異(P<0.05)，說明腹瀉模型造模成功。與模型組相比，干預(yù)組的腸黏膜損傷等級均顯著降低，具有保護(hù)腸黏膜的作用(P<0.05)。由圖5可知，與正常組小鼠結(jié)腸組織相比，模型組小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯的炎癥，隱窩結(jié)構(gòu)組織被破壞；與模型組相比，益生菌復(fù)合配方組大部分隱窩損傷被修復(fù)，組織結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常。

圖5 益生菌復(fù)合配方對結(jié)腸形態(tài)學(xué)影響Figure 5 Effects of composite probiotics on the colon morphology

表7 益生菌復(fù)合配方在小鼠腹瀉時對其結(jié)腸黏膜損傷的影響Table 7 Effects of composite probiotics on the colonic mucosal damage in the diarrhea model

抗生素造成腹瀉的機(jī)制有：① 抗生素直接引起腸黏膜損害，造成腸上皮纖毛萎縮，降低胞內(nèi)酶活性，導(dǎo)致膽汁合成障礙，減少脂肪吸收，最終造成腹瀉；② 抗生素的使用導(dǎo)致敏感菌群被殺滅，從而造成腸道微生態(tài)失衡，致病菌增加，腸屏障受損，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉[27-28]。而益生菌復(fù)合配方具有抑制抗生素腹瀉癥狀的功能，可能是在一定程度上抑制了病原微生物的生長，維護(hù)小腸腸道正常菌群的生長[29]。同時，益生菌在一定情況下可定殖到小鼠腸道中，并產(chǎn)生一系列活性機(jī)制，達(dá)到維護(hù)腸道生態(tài)環(huán)境的作用[30]。試驗(yàn)表明益生菌復(fù)合配方能顯著降低結(jié)腸黏膜損傷評分，緩解抗生素所致腹瀉。

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，在小鼠便秘癥狀下，益生菌可通過增加排便數(shù)量和重量、提高墨汁推進(jìn)率等指標(biāo)促進(jìn)腸道蠕動，有效緩解便秘作用；在急性腸炎和腹瀉癥狀下，益生菌能通過降低腸黏膜損傷評分，恢復(fù)隱窩結(jié)構(gòu)組織，保護(hù)腸黏膜進(jìn)而改善腹瀉及炎癥癥狀。但是益生菌復(fù)合配方改善腸道疾病的機(jī)制仍未明確，具體是單一菌改善還是復(fù)合菌協(xié)同作用仍未知，有待進(jìn)一步研究。