敲減骨橋蛋白對吉非替尼耐藥的非小細(xì)胞肺癌PC9細(xì)胞凋亡的研究

溫曉星 劉大海 吳學(xué)輝 王炳平 房濤

肺癌是世界上發(fā)病率第二高的腫瘤，其死亡率居所有腫瘤的首位[1]。晚期非小細(xì)胞肺癌的治療仍然是目前肺癌治療的難點(diǎn)[2]。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是治療EGFR有義突變的主要靶向藥物。但是，大多數(shù)患者在接受EGFR-TKI類藥物治療后1年左右會(huì)出現(xiàn)藥物耐藥[3]。EGFR-TKI耐藥機(jī)制及靶向的研究是目前肺癌耐藥主要的研究方向。

骨橋蛋白又被稱作分泌型磷酸糖蛋白1(SPP1)，在肺癌中異常高表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌對順鉑耐藥[4]。但骨橋蛋白在吉非替尼耐藥中的具體作用存在爭議，Wang等[5]發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白通過磷酸化EGFR，從而增加肺癌對吉非替尼的敏感性。Fu 等[6]發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白通過活化PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼耐藥。

本研究我們通過檢測骨橋蛋白在PC9R細(xì)胞中的表達(dá)，通過線粒體膜電位實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析骨橋蛋白與吉非替尼耐藥細(xì)胞線粒體功能的關(guān)系。進(jìn)一步證明骨橋蛋白在PC9R細(xì)胞生長過程的作用。為克服非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人非小細(xì)胞肺癌PC9細(xì)胞株及吉非替尼耐藥的PC9R細(xì)胞株為復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院惠贈(zèng)。吉非替尼購自Selleckchem公司。滅活胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、TRIzol試劑、線粒體膜電位檢測(MitoProbeTMJC-1 assay)試劑盒、EdU試劑盒購自賽默飛世爾科技公司。反轉(zhuǎn)錄酶購自TOYOBO公司。CCK-8試劑盒購自日本dojindo公司。SPP1抗體購自Abcam公司。Bax、Survivin、Cleaved caspase-3、Cleaved PARP抗體購自CST公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

PC9和PC9R細(xì)胞在含有10%熱滅活胎牛血清和100 U/mL青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過在培養(yǎng)基中添加1 μM吉非替尼來維持PC9R細(xì)胞對吉非替尼耐藥性。腫瘤細(xì)胞在恒溫箱中以37℃、5% CO2的條件下孵育。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

依據(jù)CCK-8試劑盒說明書，將敲除骨橋蛋白的PC9R細(xì)胞及對照組細(xì)胞按照1 000個(gè)/孔，接種在96孔板上，并加入培養(yǎng)基200 μL。培養(yǎng)24 h后，每孔加 CCK-8溶液 10 μL，37℃孵育1 h。最后，使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度值。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.4 線粒體膜電位檢測實(shí)驗(yàn)

使用線粒體膜電位試劑盒檢測線粒體膜電位的變化。JC-1是一種熒光探針，用JC-1轉(zhuǎn)染PC9R細(xì)胞，JC-1在正常線粒體基質(zhì)中聚合發(fā)出紅色熒光。腫瘤細(xì)胞凋亡早期，因線粒體功能受損，線粒體膜電位降低，JC-1單體游離于細(xì)胞漿內(nèi)發(fā)出綠色熒光。收集敲減骨橋蛋白(shSPP1)的PC9R細(xì)胞及對照組(shNEG)細(xì)胞，重現(xiàn)懸浮于培養(yǎng)基中，濃度為5×106個(gè)/mL。取0.5 mL懸浮液加入0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。在孵育期間，按照每1 mL JC-1染色緩沖液(5X)加入4 mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液(1X)，并放置于冰浴。37℃孵育結(jié)束后，600 g 4℃離心3～4 min，沉淀細(xì)胞。用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌2次：加入1 mL JC-1染色緩沖液(1X)重懸細(xì)胞，600 g 4℃離心3～4 min，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入1 mL JC-1染色緩沖液(1X)重懸細(xì)胞，600 g 4℃離心3～4 min，沉淀細(xì)胞，棄上清。再用適量JC-1染色緩沖液(1X)重懸后。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過流式細(xì)胞儀檢測。正常的線粒體在590 nm處發(fā)出紅色熒光，而去極化受損的線粒體在490 nm處發(fā)出綠色熒光。

1.5 EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

用10 μM EdU對PC9和PC9R細(xì)胞孵育4 h，在室溫下用含有3.7%甲醛的PBS固定15 min。根據(jù)EdU細(xì)胞增殖試劑盒以及我們以前實(shí)驗(yàn)方法[7]，配置5個(gè)反應(yīng)的Click反應(yīng)液，每孔加入500 μL反應(yīng)液，并加用DNA染料Hoechst33342混勻。使用共焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行共焦成像。通過使用Image J系統(tǒng)計(jì)算EdU陽性和Hoechst 33342染色陽性的PC9R細(xì)胞數(shù)。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的PC9R細(xì)胞，胰酶消化離心后接種在6孔板中，第二天細(xì)胞密度約60%～80%時(shí)進(jìn)行病毒感染，包裹腺病毒的骨橋蛋白敲減質(zhì)粒(shSPP1 組)和對照組質(zhì)粒(shNEG)購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)染操作和病毒使用滴度嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.7 免疫蛋白印跡法實(shí)驗(yàn)(Western blot，WB)

使用蛋白裂解液消化細(xì)胞后，提取目標(biāo)細(xì)胞的總蛋白。配制10%聚丙烯酰胺凝膠分離膠，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。SPP1抗體(1∶200)、Bax抗體(1∶200)、Cleaved caspase-3(1∶200) ，Cleaved PARP(1∶200)、β-actin(1∶20 000)孵育NC膜4℃過夜。并使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)孵育。暗室中用Super Signal化學(xué)發(fā)光底物顯色并對條帶進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative RT-PCR qPCR)

應(yīng)用TRIzol試劑提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒明書，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA按1∶50稀釋后進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)。20 ng RNA量為反應(yīng)底物，一共設(shè)置40個(gè)循環(huán)，參數(shù)設(shè)置如下：95℃，15 s；60℃，15 s；72℃，45 s。根據(jù)每個(gè)樣本的CT值計(jì)算2-ΔΔCT，進(jìn)行比較。β-actin為內(nèi)參。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。引物序列祥見表1。

表1 PCR所用引物

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用雙因素方差分析(Two—way ANOVA)分析分組與濃度對PC9R細(xì)胞增殖的影響，組間比較行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨橋蛋白在吉非替尼耐藥細(xì)胞中的表達(dá)水平

qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在mRNA水平骨橋蛋白在吉非替尼耐藥PC9R細(xì)胞中表達(dá)量較PC9細(xì)胞明顯增加(P<0.001)(圖1A)。通過WB檢測骨橋蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白在PC9R細(xì)胞中的表達(dá)量較PC9細(xì)胞明顯增加(圖1B)。

圖1 骨橋蛋白在吉非替尼耐藥細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.2 敲減骨橋蛋白對PC9R細(xì)胞線粒體膜電位的作用

qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與shNEG組相比，shSPP1組骨橋蛋白mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)(圖2A)。Western blot結(jié)果顯示，與shNEG組相比，shSPP1組骨橋蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)(圖2B)。流式細(xì)胞儀檢測兩組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲減骨橋蛋白后，shSPP1組發(fā)生綠色熒光的細(xì)胞比例明顯增加，進(jìn)一步證明敲減骨橋蛋白引起PC9R細(xì)胞線粒體功能障礙(P<0.05)(圖2C，D)。

圖2 敲減骨橋蛋白對PC9R細(xì)胞線粒體膜電位的作用

2.3 敲減骨橋蛋白對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的作用

線粒體膜功能異常是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要作用機(jī)制，在PC9R細(xì)胞中敲減骨橋蛋白后，本研究發(fā)現(xiàn)凋亡促進(jìn)基因Cleaved caspase-3、Cleaved PARP及Bax升高，進(jìn)一步證明敲減骨橋蛋白改變線粒體膜電位從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡(圖3)。

圖3 減骨橋蛋白對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的作用

2.4 敲減骨橋蛋白對PC9R細(xì)胞增殖的抑制作用

敲減骨橋蛋白促進(jìn)吉非替尼耐藥細(xì)胞發(fā)生凋亡，為進(jìn)一步驗(yàn)證骨橋蛋白對吉非替尼耐藥細(xì)胞增殖功能作用，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)敲減骨橋蛋白抑制吉非替尼耐藥細(xì)胞的增殖(P<0.05)(圖4A)。為進(jìn)一步證實(shí)骨橋蛋白在吉非替尼耐藥過程中的作用，通過EdU增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲減骨橋蛋白后，吉非替尼耐藥細(xì)胞的增殖活性被明顯抑制(P<0.05)(圖4B，C)，進(jìn)一步證明敲減骨橋蛋白促進(jìn)吉非替尼的抗腫瘤作用。

圖4 敲減骨橋蛋白對PC9R細(xì)胞增殖的抑制作用

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，晚期非小細(xì)胞肺癌的治療方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療轉(zhuǎn)向分子靶向藥物和免疫檢查點(diǎn)抑制劑。吉非替尼等酪氨酸激酶抑制劑通過阻斷EGFR信號(hào)通路抑制腫瘤生長[8]。以吉非替尼和奧西替尼等為代表的小分子酪氨酸激酶抑制劑已經(jīng)成為EGFR有義突變的晚期非小細(xì)胞肺癌的一線治療選擇。然而EGFR-TKI類藥物一線治療非小細(xì)胞肺癌的有效率在70%～80%。仍有一部分EGFR突變的患者不能從小分子酪氨酸激酶抑制劑中獲益[9]。并且對于大部分患者而言，常規(guī)口服吉非替尼等第一代酪氨酸激酶抑制劑1年左右時(shí)間后會(huì)發(fā)生疾病進(jìn)展及藥物耐藥[10]。EGFR-TKI類藥物的耐藥是目前肺癌治療亟需解決的問題。

目前研究發(fā)現(xiàn)，多種機(jī)制均參與調(diào)節(jié)EGFR-TKI類藥物耐藥。其中EGFR第20外顯子T790M突變是吉非替尼獲得性耐藥最主要的機(jī)制之一[8]。其他的耐藥機(jī)制包括c-met[11]、肝細(xì)胞生長因子(HGF)擴(kuò)增[12]以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[13]等。目前仍然有大約25%的EGFR-TKIs耐藥機(jī)制是不明確的[10]。

骨橋蛋白是一種分泌型磷酸糖蛋白，在肺癌、乳腺癌和肝癌等多種腫瘤中起到重要作用[14]。Donati等[15]研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白在肺癌組織中表達(dá)明顯升高，骨橋蛋白的高表達(dá)與肺癌復(fù)發(fā)相關(guān)。骨橋蛋白的高表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等[16]。在化療藥物耐藥機(jī)制研究中，骨橋蛋白通過AKT信號(hào)通路增加了對順鉑的耐藥性[5]。然而在EGFR-TKIs耐藥機(jī)制的研究中，卻存在明顯的爭議。Wang等[17]報(bào)道在肺癌中骨橋蛋白促進(jìn)阿法替尼的獲得性耐藥。2020年Fu[6]在《J Hematol Oncol》發(fā)表的文章中提到，作者通過CCK-8實(shí)驗(yàn)證明敲減骨橋蛋白抑制吉非替尼耐藥細(xì)胞的增殖，并激活了integrin αVβ3/ FAK信號(hào)通路，從而增加了肺癌細(xì)胞對吉非替尼及奧希替尼的耐藥性。然而2021年Wang等[5]卻發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞中加入分泌性的骨橋蛋白，能增加吉非替尼對肺癌細(xì)胞的殺傷作用，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白通過促進(jìn)EGFR的磷酸化，增加肺癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性。臨近的兩項(xiàng)研究得到截然相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中可能與不同細(xì)胞系及腫瘤微環(huán)境影響骨橋蛋白的功能有關(guān)。同樣說明骨橋蛋白在EGFR-TKIs耐藥作用機(jī)制的復(fù)雜性。

凋亡是酪氨酸激酶抑制劑抗腫瘤過程中的重要機(jī)制之一[18]。為了進(jìn)一步明確骨橋蛋白在吉非替尼耐藥中的作用，我們進(jìn)行了線粒體膜電位實(shí)驗(yàn)。線粒體功能受損是細(xì)胞凋亡早期的主要表現(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)敲減骨橋蛋白后，吉非替尼耐藥細(xì)胞的線粒體膜電位出現(xiàn)異常，導(dǎo)致線粒體功能發(fā)生障礙，最終引起凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生。Bax是細(xì)胞凋亡過程中的重要分子，凋亡發(fā)生的過程中，細(xì)胞漿中的Bax可插入線粒體外膜上，從而改變線粒體膜功能，增加線粒體膜鈣離子的滲透性。敲減骨橋蛋白的PC9R細(xì)胞中Bax表達(dá)量異常增加，進(jìn)一步證明敲減骨橋蛋白改變線粒體膜電位從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證骨橋蛋白對耐藥細(xì)胞的增殖作用，我們常規(guī)進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)，得到與之前實(shí)驗(yàn)同樣的結(jié)果[6]。同時(shí)我們還進(jìn)行了EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，通過共聚焦顯微鏡，我們直觀的發(fā)現(xiàn)敲減骨橋蛋白后，吉非替尼耐藥細(xì)胞的增殖活性被明顯抑制。通過不同的實(shí)驗(yàn)方法，我們進(jìn)一步證明敲減骨橋蛋白明顯抑制吉非替尼耐藥細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白在吉非替尼耐藥的PC9R細(xì)胞中異常高表達(dá)，證實(shí)敲減骨橋蛋白導(dǎo)致PC9R細(xì)胞線粒體膜電位受損，并促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。通過CCK-8和EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證敲減骨橋蛋白抑制吉非替尼耐藥細(xì)胞的增殖。敲減骨橋蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡。