荒漠草原檸條灌叢堆不同發(fā)育階段土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

王子寅 劉秉儒 李子豪 趙曉玉

（1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021；2.國家民委黃河流域農(nóng)牧交錯區(qū)生態(tài)保護重點實驗室，銀川 750021；3.寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，銀川 750021）

檸條錦雞兒（Caragana korshinskii Kom.）隸屬豆科（Leguminosae），多年生落葉灌木植物，主要分布于我國西北、華北等水土保持和防風(fēng)固沙地區(qū)［1］。檸條具有抗逆性強、根系發(fā)達(dá)、能產(chǎn)生一定經(jīng)濟價值、改良土壤和植被生態(tài)效益等諸多優(yōu)良特性［2］。檸條在生長發(fā)育過程中逐漸形成灌叢堆，它通過自身的生理代謝和與土壤微生物間的相互作用而改變土壤的物理特性，從而促進土壤的形成，并使流動沙丘向半固定、固定沙丘轉(zhuǎn)變［3］。因此實施退耕還林還草工程項目以來，在我國西北干旱及半干旱荒漠草原地區(qū)大面積種植檸條，用于沙丘固定和土壤質(zhì)地的改良，顯著改善了局部地區(qū)的生態(tài)環(huán)境，對荒漠化治理具有重要影響［3］。

土壤微生物是影響土壤形成與演化過程的重要因素［4］，能夠直觀反映其生態(tài)功能的變化［5］。土壤微生物作為生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的組成部分，在土壤的養(yǎng)分轉(zhuǎn)換、有機質(zhì)的分解和維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定過程中起著重要作用，是生物地球化學(xué)循環(huán)過程的關(guān)鍵驅(qū)動者［6］。卞瑩瑩等［7］研究發(fā)現(xiàn)相較于平茬和天然檸條林，人工種植檸條地下微生物數(shù)量、活性更佳，且土壤結(jié)構(gòu)和肥力較好。以土壤細(xì)菌為主的土壤微生物數(shù)量較多、分布較為廣泛，參與了土壤中多數(shù)養(yǎng)分的循環(huán)轉(zhuǎn)化，推動著生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換［8］。因此，通過對檸條灌叢堆土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分析，可以更好地理解檸條灌叢在不同發(fā)育階段的養(yǎng)分狀況，為促進檸條灌叢堆的可持續(xù)發(fā)展提供重要依據(jù)。

以往對檸條的研究主要集中在其土壤水熱條件［9-10］、生物力學(xué)性質(zhì)［11-12］以及土壤微生物［13-14］等方面，但對于生長期、成熟期和衰退期3種不同發(fā)育階段的檸條灌叢堆土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的研究少有報道。鑒于此，本文采用高通量測序技術(shù)，通過研究檸條灌叢堆不同發(fā)育階段土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，明確土壤細(xì)菌群落對不同發(fā)育階段土壤養(yǎng)分變化的影響，以期為防風(fēng)固沙區(qū)域檸條林的可持續(xù)發(fā)展提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所選取檸條灌叢堆位于寧夏鹽池縣南部荒漠草原（37°22'-37°24'N，106°57'-106°59' E），北鄰毛烏素沙地，位于鄂爾多斯臺地和黃土高原的過渡地帶，海拔約為1 500-1 600 m，屬典型的中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，干旱少雨，年降水量約為280-300 mm，集中于7-9月，約占全年降水量的70%［3］。年氣溫約為7-9℃，有效積溫約為3 000℃，無霜期在150 d左右［15］。植物種類以檸條錦雞兒（Caragana korshinskii Kom）、 賴 草（Leymus secalinus（Georgi）Tzvel）、 白 草（Pennisetum centrasiaticum Tzvel）、 糙隱子草（Cleistogenes squarrosa（Trin.）Keng）、長芒草（Stipa bungeana Trin）等干旱、中干旱灌木草本為主，灰鈣土、風(fēng)沙土是研究區(qū)主要土壤類型［3］。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 于2020年8月下旬植物生長旺盛時期，隨機選取15個外形規(guī)則、生長態(tài)勢均勻一致但大小有梯度差異的檸條灌叢堆（選取最大、最小灌叢堆基本可以代表當(dāng)?shù)刈畲?、最小灌叢堆）?］。參考熊小剛等［16］的方法將選取的15個灌叢堆按照高度及水平差異將其劃分為生長期（growing）、成熟期（mature）、衰退期（recession）3類灌叢堆，每組分別選取5個灌叢。采樣時分別在沙堆頂部（U）、中部（M）及底部（D）3個部位采集土樣，按東南西北4個方向的0-10 cm土層，將土樣等量混勻后作為一個樣品，然后將每個樣品分成兩份，一份立即放入冰盒帶回實驗室用于微生物特征的測定，另一份于室內(nèi)風(fēng)干后測定土壤理化性質(zhì)［3］。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)的測定 土壤樣品采集完畢經(jīng)室內(nèi)自然風(fēng)干后，測定土壤電導(dǎo)率（electrical conductance，EC）、pH、有機碳（soil organic carbon，SOC）、總磷（total nitrogen，TP）、速效磷（available phosphorous，AP）、總氮（total nitrogen，TN）等指標(biāo)［3］。采用水土比為2.5∶1的電位計法測定土壤pH值；采用便攜式電導(dǎo)率儀測定土壤EC；采用TOC測定儀測定土壤SOC；采用硫酸-高氯酸消煮-鉬銻抗比色法測定土壤TP；采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定土壤AP；采用硫酸鉀-硫酸銅-硒粉消煮，定氮儀自動分析法測定土壤TN［17］。

1.2.3 樣本DNA提取、16S rRNA基因的PCR擴增及高通量測序 樣品送至美吉生物醫(yī)藥科技（上海）有限公司，進行土壤樣品的DNA提取、16S rRNA基因的PCR擴增以及高通量測序。選擇細(xì)菌V4區(qū)域的16S rRNA進行PCR擴增，通用引物為515FmodF（5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'） 和806RmodR（5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3'）［18］。

1.2.4 統(tǒng)計分析 使用美吉生物云平臺（www.majorbio.com）進行稀釋曲線、韋恩圖、細(xì)菌群落相對豐度圖及功能預(yù)測等圖形繪制。使用IBM SPSS Statistics 24.0軟件對土壤理化性質(zhì)等數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。使用Origin 2021軟件對土壤細(xì)菌多樣性及豐富度進行 Paired Comparison Plot。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育階段檸條灌叢堆土壤理化性質(zhì)比較

隨著檸條灌叢堆發(fā)育階段的變化，如表1所示，土壤養(yǎng)分在不同發(fā)育階段之間存在顯著性差異（P＜0.05），土壤pH在7.6左右，呈弱堿性。AP和EC在成熟期表現(xiàn)為最大值；SOC、TP和TN沒有顯著性差異；SOC、TP、AP、TN以及EC在檸條灌叢堆不同發(fā)育階段均表現(xiàn)為先升高后降低。

表1 不同發(fā)育階段檸條灌叢堆土壤理化性質(zhì)Table 1 Soil physical and chemical properties of Caragana korshinskii Kom.Nebkhas at different developmental stages

2.2 高通量測序結(jié)果及Alpha多樣性評估

高通量測序結(jié)果如表2所示，不同發(fā)育階段樣品序列數(shù)在56 050-69 731之間，平均測序序列數(shù)為62 670，覆蓋度均在95%以上。不同發(fā)育階段檸條灌叢堆土壤細(xì)菌類群之間無顯著性差異，但3種發(fā)育階段之間檸條灌叢堆多樣性（Shannon指數(shù)）和豐富度（ACE和Chao 1指數(shù)）數(shù)值均表現(xiàn)為成熟期（mature）大于生長期（growing）和衰退期（recession）（P＜0.05）。

表2 不同發(fā)育階段檸條灌叢堆土壤細(xì)菌群落多樣性Table 2 Soil community diversity of C.korshinskii Kom.nebkhas at different developmental stages

2.3 土壤群落結(jié)構(gòu)組成分析

Veen圖可以較為直觀的表現(xiàn)不同發(fā)育時期檸條灌叢堆土壤細(xì)菌群落OTU的組成差異及其共有物種的情況。經(jīng)對有效序列進行質(zhì)控、拼接和優(yōu)化，通過 RDP 數(shù)據(jù)庫的注釋以及在97%的相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析，由圖1可知，共獲得15 383個細(xì)菌OTU，在生長期、成熟期、衰退期土壤中分別獲得12 513、12 362和12 201個細(xì)菌OTU。生長期、成熟期、衰退期3個階段共有OTU數(shù)為9 369，只占OTU總數(shù)的60.90%；3個階段特有的OTU數(shù)量分別為1 160、1 037和862，分別占OTU總數(shù)的7.54%、6.74%和5.60%；生長期和成熟期共有的OTU數(shù)量為985（6.40%），生長期和衰退期共有的OTU數(shù)量為999（6.49%），成熟期和衰退期共有的OTU數(shù)量為971（6.31%）。

圖1 不同發(fā)育階段檸條灌叢堆土壤細(xì)菌群落韋恩圖Fig.1 Venn diagram of soil bacterial community at different developmental stages of C.korshinskii Kom.nebkhas

高通量測序結(jié)果顯示，按照最小樣本序列數(shù)抽平后，檸條灌叢堆不同發(fā)育階段土壤細(xì)菌隸屬50門146綱364目590科1 111屬。在不同分類水平上統(tǒng)計檸條灌叢堆不同發(fā)育階段的物種豐度，通過群落柱形圖可以直觀的研究群落的結(jié)構(gòu)組成，并且能夠反映各發(fā)育階段中優(yōu)勢物種的分布比例。如圖2所示，不同發(fā)育階段土壤細(xì)菌群落中優(yōu)勢菌群有放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、酸 桿 菌 門（Acidobacteriota）、 綠 彎 菌 門（Chloroflexi）、泉古菌門（Crenarchaeota）、浮霉菌門（Planctomycetota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、黏球菌門（Myxococcota）、擬桿菌門（Bacteroidota）等9種，約占微生物總數(shù)的90.00%-93.82%。其中占比大于5%的有放線菌門占比27.50%-90.62%，變形菌門占比14.35%-20.75%，酸桿菌門占比10.93%-14.30%，綠彎菌門占比9.34%-11.20%，泉古菌門占比6.46%-8.98%，芽單胞菌門占比4.92%-6.34%，浮霉菌門占比4.25%-5.66%。

圖2 門分類水平上細(xì)菌群落相對豐度圖Fig.2 Relative abundance of bacterial community at the phylum level

為了尋找不同發(fā)育階段檸條灌叢堆土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中具有顯著差異的微生物門，基于各發(fā)育階段群落豐度數(shù)據(jù)，選取門分類水平下Top50優(yōu)勢物種，對不同發(fā)育階段土壤細(xì)菌相對豐度差異通過單因素方差（one-way ANOVA）分析，來評估物種豐度差異的顯著性水平，從而得到具有顯著性差異的物種，并且通過豐度降序，列出了生長期、成熟期和衰退期3個發(fā)育階段中存在顯著差異性的前11種細(xì)菌（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前11種細(xì)菌分別是Gemmatimonadota（芽單胞菌門）、Bacteroidota（擬桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、unclassified_k__norank_d__Bacteria、Methylomirabilota、Patescibacteria（髕骨細(xì)菌 門 ）、Entotheonellaeota、GAL15、NB1-j、WPS-2以及Dadabacteria。其中，Patescibacteria和Entotheonellaeota的豐度差異性達(dá)到非常顯著水平，NB1-j豐度差異性達(dá)到了極顯著水平，Gemmatimonadota、Bacteroidota、Firmicutes、unclassified_k__norank_d__Bacteria、GAL15、WPS-2和 Dadabacteria的豐度差異性均達(dá)到顯著水平。

圖3 門水平物種相對豐度差異分析Fig.3 Analysis on the relative abundance differences of dominant fungi at the phylum level

2.4 不同發(fā)育階段檸條灌叢堆土壤細(xì)菌優(yōu)勢類群與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

通過Person相關(guān)性熱圖分析土壤理化性質(zhì)對不同發(fā)育階段檸條灌叢堆土壤細(xì)菌門水平群落組成的影響（圖4）。結(jié)果顯示，在門分類水平上，AP、SOC、TP、EC、pH、TN均與土壤細(xì)菌總豐度前20的優(yōu)勢類群存在相關(guān)關(guān)系，AP和SOC是影響不同發(fā)育階段檸條灌叢堆土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子。其中，AP對 Bacteroidota、Bdellovibrionota、Proteobacteria、Patescibacteria、Thermoplasmatota、unclassified_k__norank_d__Bacteria、Firmicutes、Methylomirabilota、Gemmatimonadota、Actinobacteriota和Nitrospirota門呈非常顯著相關(guān)關(guān)系，對Crenarchaeota門呈極顯著相關(guān)關(guān)系，對Entotheonellaeota門呈顯著相關(guān)關(guān)系；SOC對Bacteroidota、Proteobacteria、Thermoplasmatota、unclassified_k__norank_d__Bacteria、Firmicutes、Methylomirabilota門呈非常顯著相關(guān)關(guān)系，對Crenarchaeota、Bdellovibrionota、Patescibacteria、Gemmatimonadota、Armatimonadota門呈極顯著相關(guān)關(guān)系，對Nitrospirota、Acidobacteriota、Chloroflexi門呈顯著相關(guān)關(guān)系，另外EC、pH、TP、TN也顯著影響多個門菌群的豐度。

圖4 門水平的土壤細(xì)菌優(yōu)勢類群與環(huán)境因子相關(guān)性熱圖Fig.4 Heat map of the correlation between dominant ant groups of soil bacterial and environmental factors based on phylum level

2.5 土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)分析與PICRUSt功能預(yù)測

物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖主要反映某一環(huán)境條件下各分類水平的物種相關(guān)性。選用Pearson模型，設(shè)定參數(shù)為相對系數(shù)絕對值≥0.5、P＜0.05，對生長期、成熟期和衰退期檸條灌叢堆土壤細(xì)菌中相對豐度排名前30的屬進行單因素網(wǎng)絡(luò)分析，如圖5所示。本研究中不同發(fā)育階段檸條灌叢堆土壤細(xì)菌的單因素網(wǎng)絡(luò)呈連通狀態(tài)，網(wǎng)絡(luò)直徑是4，節(jié)點間平均最短路徑長度為1.773，共210個邊，對應(yīng)29個節(jié)點。前30個物種OTU，分別屬于泉古菌門（Crenarchaeota）、放線菌門（Actinobacteriota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota），網(wǎng)絡(luò)中心性數(shù)值最高的節(jié)點為變形菌門（Proteobacteria）的Sphingomonadales屬，與其他門類20個屬進行互作，大多數(shù)為負(fù)相關(guān)。

圖5 土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Network of soil bacteria

為了解不同發(fā)育階段檸條灌叢堆土壤細(xì)菌群落功能，采用PICRUSt軟件，將測序所得到的16S rRNA數(shù)據(jù)，基于 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫進行對比預(yù)測，在一級功能層共獲得 6 類通路：細(xì)胞過程（cellular processes）、環(huán)境信息處理（environmental information processing）、遺傳信息處理（genetic information processing）、人類疾病（human diseases）、代謝（metabolism）、有機系統(tǒng)（organismal systems）和目前分類學(xué)尚未分類的通路。其中代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理是一級功能層中最主要的組成部分，豐度值分別為68 277 089.01-69 450 987.46、6 067 770.89-6 107 170.17和4 298 763.26-4 400 881.69，占比分別為78.76%-78.86%、6.93%-7.00%和4.95%-4.99%。二級功能層共有46類通路，其中相對豐度大于1%的有18類，如表3所示。在生長期、成熟期、衰退期3個階段，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中一級和二級通路的數(shù)量和多樣性差異不顯著。

表3 土壤細(xì)菌群落中相對豐度＞1%的二級功能豐度表Table 3 Secondary functional abundance table with relative abundance ＞ 1% in the soil bacterial community

3 討論

在荒漠草原干旱與半干旱地區(qū)，植物灌叢堆可以通過堆積枯落物等手段富集自己所需養(yǎng)分。楊陽等［19］研究發(fā)現(xiàn)檸條灌叢堆對土壤養(yǎng)分有明顯的富集作用。一方面，檸條灌叢堆的發(fā)育能夠明顯增加荒漠地區(qū)沙面粗糙度，在發(fā)育過程中通過逐漸抵擋風(fēng)沙侵蝕、截取大氣降塵等方法，增加土壤黏粒的含量［20］，從而改變土壤容重和保水性，進而增加土壤養(yǎng)分的儲存量［21］；另一方面，通過根際分泌物的釋放、根系等衰老組織的分解以及枯落物的堆積，可以為微生物提供有利的生存環(huán)境，從而加快土壤養(yǎng)分的積累［22］。本研究中不同發(fā)育階段的檸條灌叢堆土壤AP和EC存在顯著性差異，表現(xiàn)為成熟期＞生長期＞衰退期，即隨著檸條灌叢堆的發(fā)育，其對土壤養(yǎng)分的富集呈現(xiàn)先增加后降低，在成熟期表現(xiàn)為最大的現(xiàn)象，其他土壤養(yǎng)分如SOC、TP、TN、pH雖然不存在顯著性差異，但同樣在數(shù)值上表現(xiàn)為成熟期＞生長期＞衰退期，與陳鴻洋等［23］、裴世芳等［24］研究結(jié)果一致。說明在檸條發(fā)育過程中由于成熟期生長旺盛，更新周期短，并且其冠層結(jié)構(gòu)茂密更有利于堆積枯落物，最終使得成熟期檸條灌叢堆的土壤養(yǎng)分顯著高于生長期和衰退期。

土壤中細(xì)菌菌群特征受到土壤理化性質(zhì)、氣候、植被類型、生理［25］等多種因素的影響。本研究從檸條灌叢堆總體土壤細(xì)菌類群特征上分析，檢測出土壤細(xì)菌隸屬50門146綱364目590科1 111屬，不同發(fā)育階段檢測出的細(xì)菌總體門種類及數(shù)量相近，沒有顯著差異；各發(fā)育階段共有的OTU占比達(dá)60%以上，特有的OTU數(shù)量低于10%；以及本研究兼顧數(shù)據(jù)的可信度，未深入分析屬種層次。原因可能由于樣地之間沒有顯著的地理隔離，加之氣候干旱等因素的影響。研究表明，不同類型的土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢種類基本是相似的，包括放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮 霉 菌 門（Planctomycetota）、 芽 單 胞 菌 門（Gemmatimonadota）、擬桿菌門（Bacteroidota）等［26］。這些菌門在凍土、森林、濕地、荒漠等地形中也常被作為優(yōu)勢菌門被檢出［27-32］。本研究中測定出荒漠草原區(qū)檸條灌叢堆土壤中豐度最高的4個的細(xì)菌門類分別是放線菌門、變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門，4個門類共同豐度占總檢出數(shù)量的60%以上，優(yōu)勢菌門同樣為以上菌門，且優(yōu)勢程度明顯。

土壤環(huán)境和土壤細(xì)菌群落的組成有著密不可分的聯(lián)系，沈聰?shù)龋?4］研究表明，檸條根際土壤pH值、AN和TK與細(xì)菌群落關(guān)系密切，而在本研究中，門水平的土壤細(xì)菌優(yōu)勢類群與環(huán)境因子相關(guān)性熱圖表明，AP、SOC、TP、EC、pH、TN均與土壤細(xì)菌總豐度前20的優(yōu)勢類群存在相關(guān)關(guān)系，其中AP是影響細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)的最主要因子，說明土壤中P含量的增加能夠影響微生物的群落結(jié)構(gòu)，這與納小凡等［33］的研究結(jié)果一致。PICRUSt功能預(yù)測通過與KEGG數(shù)據(jù)庫進行對比，將微生物的變化與生物體功能緊密聯(lián)系［34］。一級功能層中代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理三類豐度較高，能使檸條灌叢堆土壤細(xì)菌代謝更加旺盛、長勢更好，從而提高其群落結(jié)構(gòu)的多樣性。二級功能層中主要有全局概況圖、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔酶和纖維素代謝、轉(zhuǎn)譯等46類通路，證明其功能的豐富性。但目前PICRUSt功能預(yù)測仍然存在較多局限，隨著科技的進步，后續(xù)可通過宏基因組學(xué)等方法進一步詳細(xì)研究檸條灌叢堆不同發(fā)育階段土壤細(xì)菌的群落功能。

4 結(jié)論

荒漠草原區(qū)檸條灌叢堆不同發(fā)育階段土壤細(xì)菌隸屬于50門146綱364目590科1 111屬，主要優(yōu)勢門為放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門。不同發(fā)育階段成熟期的土壤養(yǎng)分含量最高，其細(xì)菌的多樣性和豐富度也處于最高水平。AP和SOC是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子，TP、EC、pH、TN也有一定影響。不同發(fā)育階段土壤細(xì)菌功能豐富，在代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理方面表現(xiàn)活躍。