甜瓜CmABCG8基因的表達特性分析

洪天澍 海英 恩和巴雅爾 高峰

（1.內蒙古師范大學生命科學與技術學院，呼和浩特 010022；2.內蒙古興安盟科爾沁右翼前旗第一中學，興安盟 137400）

三磷酸腺苷結合盒（ATP-binding cassette）蛋白又稱ABC轉運蛋白，是一個廣泛存在、種類繁多的超家族，它以ATP水解酶為能源，促進多種底物的跨膜轉運，大多數(shù)ABC基因編碼的膜結合蛋白直接參與多種分子的跨膜運輸［1］，植物ABC蛋白家族由3種結構類型組成，其包括完全轉運蛋白、半轉運蛋白、可溶性轉運蛋白。完全轉運蛋白由兩個跨膜結構域（transmembrane domains，TMD）和兩個核苷酸結合結構域（nucleotide-binding domains，NBD）組成，半轉運蛋白由一個TMD和一個NBD組成，通過形成同二聚體、異二聚體或多聚體來行使功能。第三類型的轉運蛋白沒有TMD，但有兩個NBD，這類蛋白稱為可溶蛋白類型［2］，它們都有一個胞質的核苷酸結合域（NBD）。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，植物ABC蛋白不僅參與了激素、脂質、金屬、次生代謝物和外源物質的運輸，而且還參與了植物與病原菌的相互作用和離子通道的調節(jié)［3］。在高等植物中，ABC蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上被組織成8個簇，即ABCAABCI亞家族（植物中不存在ABCH）［4］。ABCG轉運蛋白是植物ABC轉運蛋白家族中最大的亞家族，在擬南芥和水稻中均有40多個成員［5］，其結構為NBD-TMD，這種結構只有經過二聚才能成為功能型轉運體，ABCG亞家族可分為半分子式轉運蛋白和全分子式轉運蛋白兩類，并且功能多樣化。與其他類型生物相比，ABCG亞家族在植物中的比例要大得多。其原因在于植物的固著生活方式，例如需要輸出有毒化合物和植物產生的種類繁多的次生代謝物，這些次生代謝物通常需要跨膜運輸?shù)剿鼈兊淖饔貌课唬?］。研究得知，植物ABCG轉運蛋白亞家族成員具有參與植物激素傳遞（包括生長素、細胞分裂素和獨角金內酯等）功能［7］；ABCG全分子式轉運蛋白參與植物體內抗重金屬、抗病原菌、生長素應答、轉運信號分子等功能［8-10］，而ABCG半分子式轉運蛋白參與植物體內卡那霉素抗性、脂類平衡、脫落酸轉運等功能［11-13］。表皮細胞的形成與角質層的合成對植物果實的生長具有重要作用［14］，有研究報道，AtABCG11參與擬南芥葉片和莖部角質形成，AtABCG13參與擬南芥花組織的角質形成［15］，水稻中OsABCG26和OsABCG15通過絨氈層細胞轉運脂類。在人體中HsABCG5與HsABCG8共同作用可以促進多種底物跨細胞膜的轉運［16］。

甜瓜（Cucumis melo L.）是廣泛栽培的重要的經濟農作物。其果實香甜，營養(yǎng)豐富，富含糖、淀粉、少量蛋白質、維生素、礦物質等。隨著對甜瓜研究的深入，甜瓜已經成為闡明肉質果實發(fā)育成熟分子機理的植物。近年來，甜瓜轉基因工程技術的廣泛運用，使得甜瓜具有抗病、抗逆、耐鹽堿等優(yōu)良特性。目前，ABC轉運蛋白家族基因的功能在甜瓜中研究較少，甜瓜中ABCG轉運蛋白的研究還尚未可知。因此，對于ABCG轉運蛋白在甜瓜中的功能及作用還需要進一步深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為甜瓜品種‘河套密瓜’，由本實驗室 保 存。1/2 MS培 養(yǎng) 基、MnCl2、CuSO4、FeSO4、細胞分裂素（CTK）、油菜素內酯（BR）、過氧化氫（H2O2）等試劑購自呼和浩特洪陽生物技術有限公司，TRIzol試劑購自北京全式金生物技術有限公司，反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、熒光定量PCR試劑 SYBR?Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甜瓜CmABCG8基因的系統(tǒng)進化樹構建 通過NCBI網站和MELONOMICS（https://www.melonomics.net/）數(shù)據(jù)庫下載擬南芥、番茄、甜瓜、黃瓜4個物種的ABCG家族基因序列，通過MEGA7軟件進行多序列比對，用Neighbor joining的方法做進化樹分析。

1.2.2 數(shù)據(jù)庫中甜瓜ABCG家族表達量分析 通過CuGenDB（http://cucurbitgenomics.org/）數(shù)據(jù)庫得到甜瓜ABCG亞家族成員在根、果實、葉、雄蕊、雌蕊的表達量，使用TBtools軟件做成熱圖，對其進行分析。

1.2.3 甜瓜CmABCG8基因的互作蛋白網絡圖構建 通過STRING（https://cn.string-db.org/）網站分析CmABCG8氨基酸序列，得到與其互作的蛋白數(shù)據(jù)導出后用Cytoscape軟件做圖。

1.2.4 甜瓜種植及處理 甜瓜種植于內蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市磴口縣，在甜瓜盛花期使用人工自交授粉，標記授粉起始日期。果實的采摘從授粉后開始，取所摘果實的中果皮組織，速凍于液氮中保存，每隔5 d采一次，直到授粉后的50 d為止；當生長期到40 d時取根、莖、葉和花4種組織，速凍于液氮中保存；選取籽粒飽滿、大小均一的甜瓜種子種植于營養(yǎng)土中，待其長出第2片真葉后，進行不同的處理。其中，取甜瓜根部，用于金屬離子處理。離 子 濃 度 分 別 為 Fe2+、Cu2+：0、50、100 和200 mg/L［17-18］，Mn2+：0、0.272、1.36 和 6.8 mg/L［19-20］；取甜瓜幼葉，用于過氧化氫（H2O2）、植物激素細胞分裂素（CTK）和油菜素內酯（BR）的 處 理，3種 處 理 濃 度 均 為 ：0、0.4、4和40 μmol/L［21］。具體方法如下，以細胞分裂素為例：配置400 mL的1/2 MS液體培養(yǎng)基，分裝在4個三角瓶中，其中3個分別加入不同濃度的細胞分裂素（0.4、4和40 μmol/L），第4個不加，作為對照。將甜瓜幼葉或根分別用70%乙醇和0.1%的HgCl2浸泡，浸泡前后均使用無菌水沖洗、晾干。將幼葉和根分別加入對應濃度的1/2 MS液體培養(yǎng)基中進行室溫培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別為2 h和36 h，無菌水沖洗、晾干，使用液氮速凍保存于-80℃超低溫冰箱中。以上每種材料均設3個生物學重復。

1.2.5 RNA的提取 采用TRIzol法提取已保存材料的總RNA，將材料在液氮中冷卻并迅速研磨至粉末狀，每50 mg液氮研磨的嫩葉組織加入1 mL TRIzol反復吹打，室溫放置5 min后，加入200 μL的氯仿強烈震蕩后，室溫條件下靜置2-3 min，4℃ 12 000 r/min低溫離心15 min，移取上清液至新的離心管中加入等量的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10 min，再低溫離心10 min棄去上清液，1 mL 75%的乙醇洗滌沉淀，低溫離心3 min棄上清，使用去RNase的滅菌水溶解沉淀，即得到甜瓜總RNA。經瓊脂糖凝膠電泳檢測和超微量紫外分光光度計檢測后，將提取的RNA置于-80℃冰箱中儲存。

1.2.6 cDNA的合成 以上述提取的總RNA作為模板，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒進行cDNA合成。反應體系共包括反應1和反應2兩個部分。反應1主要進行RNA的變性，反應2進行cDNA的合成。反應 1體系為：取 2 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser、1 μg總 RNA，用去 RNase水補平至10 μL，混合均勻。反應程序為：42℃，2 min，4℃暫時保存。反應2體系為：1 μL Prime Script RT Enzyme Mix I、1 μL RT Primer Mix、4 μL 5×Prime Script Buffer、4 μL RNase Free dH2O 與 10 μL 反 應1混合液混合均勻。反應程序為：42℃，15 min；85℃，5 s，冰上冷卻。

1.2.7 熒光定量PCR 利用Mastercycler?ep實時熒光定量RCR儀，對樣品進行表達特性分析。以合成的cDNA第一條鏈為模板，PCR反應體系共25 μL，其中 12.5 μL SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ，5 μmol/L的上下游引物各 2 μL，cDNA 5 μL，RNaseFree dH2O 3.5 μL。反應過程為95℃預變性10 s；95℃變性5 s；60℃退火20 s；65℃延伸10 s，共40個循環(huán)結束；同時做溶解曲線分析，95℃，10 s。使用甜瓜GADPH基因作為內參。

GADPH內參引物序列為（上游引物：5'-ATCATTCCTAGCAGCACTGG-3'，下游引物：5'-TTGGCATCAAATATGCTTGACCTG-3'）；CmABCG8基因引物序列為（上游引物：5'-AAACATCGGAATGGACAAAGCC-3'，下游引物：5'-ACGAGGACGAAGTAGGCGAAAG-3'）。

2 結果

2.1 CmABCG8的系統(tǒng)進化樹的分析

選取擬南芥、番茄、甜瓜、黃瓜中ABCG亞家族成員的氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹，結果如圖1所 示，CmABCG8 與 CsABCG23、CsABCG5、CsABCG10、SlABCG19在同一支中，其中CmABCG8和CsABCG23的一致性最高。

圖1 CmABCG8和擬南芥、番茄、黃瓜、甜瓜中ABCG基因的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic trees of ABCG genes in CmABCG8 and Arabidopsis thaliana，tomato（Solanum lycopersicum），cucumber（Cucumis sativus L.）and melon（Cucumis melo L.）

2.2 甜瓜ABCG家族基因表達譜熱圖

通過TBtools軟件將甜瓜ABCG亞家族在甜瓜根、莖、葉、雄蕊、雌蕊中的表達量做成熱圖（圖2），可明顯的看出甜瓜ABCG亞家族整體在雄蕊中表達量偏高，在果實中整體表達量偏低。CmABCG8在雌蕊中表達最高，在根、雄蕊、葉中表達量較高，在果實中表達量不明顯。

圖2 甜瓜ABCG基因家族在不同組織中的表達Fig.2 Expression of ABCG gene family in the different tissues of melon

2.3 甜瓜CmABCG8蛋白互作網絡圖

通過STRING網站對CmABCG8有相互作用的蛋白質進行預測，發(fā)現(xiàn)CmABCD1、Pattellin-4、Ferredoxin-nitrite、Thioredoxin H2、DHN1、Tc-0109、Mildew resistance6、Sulfate transporter3.5、LOC103482955、NRT1等10個 蛋 白 直 接 與CmABCG8存在相互作用關系（圖3），結合Cytoscape軟件清晰標注發(fā)生互作的蛋白名稱。

圖3 甜瓜CmABCG8的蛋白質互作網絡Fig.3 Protein interaction network of CmABCG8 in melon

2.4 果實不同發(fā)育時期CmABCG8基因的表達特性分析

在果實不同發(fā)育時期，表達量如圖4所示，以0 DAP的表達量設為1，CmABCG8基因在10 DAP的表達量達到峰值，增加了1.50倍，其他時期均呈現(xiàn)出下降的趨勢，到35 DAP時表達量達到最低，是10 DAP時表達量的1/35 000，35 DAP后，表達量又開始輕微上升，但極其不明顯。

圖4 甜瓜果實不同發(fā)育時期CmABCG8基因的相對表達量Fig.4 Relative expressions of CmABCG8 gene in melon fruit at different development stages

2.5 甜瓜不同組織中CmABCG8基因的表達特性分析

在甜瓜不同組織中，以根的表達量設為1，莖、葉、花的表達量都呈現(xiàn)上升的趨勢（圖5），基因在葉的表達量最高，為根的26倍。方差分析結果顯示，與根相比，莖、葉的表達量差異達到極顯著水平，與葉相比，莖和花的表達量差異均達極顯著水平。

圖5 甜瓜不同組織中CmABCG8基因的相對表達量Fig.5 Relative expressions of CmABCG8 gene in the different tissues of melon

2.6 植物激素和H2O2處理后CmABCG8基因的表達特性分析

不同濃度的CTK、BR和H2O2處理，均會誘導甜瓜葉片中CmABCG8基因的表達。處理濃度為4 μmol/L時，該基因在CTK和H2O2處理組中的表達量達到最大值；處理濃度為40 μmol/L時，在BR處理中該基因表達量達最高值（圖6）。

圖6 植物激素和H2O2處理對CmABCG8基因表達特性的影響Fig.6 Effects of plant hormones and H2O2 treatment on the expression characteristics of CmABCG8 gene

2.7 不同金屬離子處理后CmABCG8基因的表達特性分析

不同濃度的Fe2+與Cu2+處理后的甜瓜根部CmABCG8基因表達量與對照組相比均呈下降趨勢，且方差分析結果（圖7）顯示，對照組與其它濃度的差異性極顯著。不同濃度Mn2+中，當濃度達到6.8 mg/L時表達量達到最高，與對照組相比，表達量的差異性達到顯著性水平（圖7）。

圖7 不同金屬離子處理對CmABCG8基因表達特性的影響Fig.7 Effects of different metal ion treatment on the expression characteristics of CmABCG8 gene

3 討論

近年來，ABC轉運蛋白在擬南芥、番茄、水稻中均有報道，認為該蛋白能夠將外源毒性物質發(fā)生螯合作用，并將其從細胞質運入液泡，減少其對植物的傷害。隨著研究的不斷深入，植物中ABC轉運蛋白的更多功能逐漸被發(fā)現(xiàn)。ABCG作為ABC轉運蛋白家族中最大的亞家族，深受廣大研究人員的關注，該亞家族成員可以通過響應一些植物激素或植物激素前體，在植物的生長和代謝過程中發(fā)揮著重要作用［22］。本文通過生物信息學和表達特性分析，來判斷甜瓜CmABCG8行使的功能。通過蛋白網絡互作圖，預測到甜瓜CmABCG8與10個蛋白有相互作用，其中Dehydrin蛋白可以調控植物響應低溫脅迫效應［23］；Ferredoxin-nitrite蛋白參與了高等植物硝酸鹽同化還原為氨的過程［24］；Patellin蛋白具有轉移脂質的能力，能在生物膜運輸?shù)冗^程中發(fā)揮功能［25］，可在植物激素和環(huán)境變化的調控下參與細胞分裂的過程［26］，煙草中的Patellin蛋白，能參與植物對病毒的防御［27］；NRT蛋白位于細胞原生質膜上，參與NO3-從土壤中根際向植株體內的轉運和植株體內NO3-在器官、組織和細胞間的再度運輸［28］；Thioredoxin蛋白是過氧化物酶家族的一員，能夠替代金屬離子輔基所發(fā)揮的功能，清除各種過氧化物，并且植物體內的葉綠體硫氧還原蛋白，可介導環(huán)境信號到葉綠體蛋白，維持植物體細胞氧化還原穩(wěn)定性，提高植物本身的抗逆性［29-31］。因此猜測CmABCG8在甜瓜中可能具有類似這些蛋白的功能。

基因表達差異能夠揭示基因行使的功能，使用實時熒光定量的技術能夠分析出基因的作用和功能。通過不同金屬離子對甜瓜根部處理后，發(fā)現(xiàn)CmABCG8的表達量呈下降的趨勢，但隨著金屬離子濃度的增加，表達量有回升的趨勢，在Mn2+的濃度達到6.8 mg/L時表達量有明顯的上升，推測CmABCG8對不同的金屬離子存在劑量效應。通過果實不同時期的表達量，得出CmABCG8基因在果實發(fā)育前期表達量很高，而在果實發(fā)育后期不明顯，該結果與甜瓜轉錄組得到的數(shù)據(jù)完全一致，可說明CmABCG8基因在果實發(fā)育前期發(fā)揮一些作用。通過外源H2O2和植物激素CTK、BR對甜瓜幼苗處理，表達特性結果顯示，3種處理均能大幅度影響CmABCG8基因的表達量，與對照相比，隨著濃度增加，均呈現(xiàn)出上升的趨勢，但達到一定濃度后，表達量有下降的趨勢，但還是遠遠高于對照組表達量。推測CmABCG8對不同植物激素的影響存在劑量效應，除可以調節(jié)果實發(fā)育外，還能抵抗環(huán)境壓力［32］，由本試驗結果能看出外源植物激素能夠誘導CmABCG8基因的表達，是否可以通過調節(jié)外源植物激素來加強甜瓜面對多種復雜的環(huán)境脅迫，還要繼續(xù)進行深入研究。

4 結論

甜瓜ABC轉運蛋白亞家族G成員CmABCG8基因在葉中表達量顯著高于其他組織，果實發(fā)育早期表達水平較高，H2O2、CTK、BR等處理均能誘導CmABCG8的表達，推測其可能在果實膨大期發(fā)揮重要作用，并且CmABCG8可能在甜瓜金屬離子轉運和抵抗非生物脅迫的過程中發(fā)揮作用。