無柄靈芝醇提物對小鼠睡眠及腸道菌群的影響

陳天賜 武少蘭 楊國輝 江丹霞 江玉姬 陳炳智

（1. 福建農(nóng)林大學食品科學學院 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學菌物研究中心 福州 350002）

睡眠是維持人體健康的一個重要過程，長期失眠可能引起調(diào)節(jié)失衡，免疫力下降，內(nèi)分泌激素混亂，誘發(fā)阿爾茨海默等疾病［1-3］。研究表明，世界上超過三分之一的人患有失眠癥，該人群數(shù)量還在不斷增加［4］。睡眠-覺醒主要受中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，腸道菌群能通過腸-腦軸的神經(jīng)調(diào)節(jié)、內(nèi)分泌和免疫調(diào)節(jié)，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相互作用［5-6］。Reynolds等［7］研究表明睡眠不足和晝夜節(jié)律紊亂會產(chǎn)生生理壓力，進而改變腸道菌群和腸道通透性。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，越來越多的臨床和實驗研究證實，中藥與腸道微生態(tài)密切相關，對人體的生理和代謝功能起著重要的作用［8-10］。人類腸道內(nèi)的菌群不僅調(diào)節(jié)腸道活動，還影響宿主的大腦功能和行為［11-12］。胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間存在相互作用，即微生物-腸道-大腦軸在功能上存在聯(lián)系［13］。腸道菌群的不平衡可能導致腸道大腦疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病［14-15］。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)與睡眠之間的聯(lián)系，所以睡眠與腸道菌群之間也可能存在相關性。

靈芝是常見的中藥材，富含有多糖、蛋白質(zhì)、萜類、甾醇、生物堿和多肽類化合物，其中水溶性多糖和醇溶性三萜類是主要的生物活性成分。無柄靈芝（Ganoderma resinaceum）是靈芝屬的一個種，已較早就被用于預防和治療各類疾病，包括抗癌、保肝護肝等［16-18］。有研究表明靈芝可以減少自發(fā)的運動活動，放松中樞神經(jīng)，延長非眼球快速運動睡眠［19-20］，還可以通過調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸A型受體基因的表達來改善睡眠［21］。

靈芝多糖進入腸道中，與腸道菌群相互作用，被分解成小分子物質(zhì)吸收［22］。靈芝酸A和皂苷類可改變大鼠腸道菌群組成；靈芝醇提取物可以提高瘤胃球菌的相對豐度比例，降低小鼠體內(nèi)梭狀芽胞桿菌的相對豐度比例，還能保護腸道黏膜完整性［23-24］，這為研究無柄靈芝對睡眠及腸道菌群的影響提供了依據(jù)。但是靈芝能否通過腸道菌群影響睡眠仍然未知，因此，本研究通過分析無柄靈芝醇提物（Ganoderma resinaceumalcohol extract，GRAE）對小鼠睡眠的作用，通過16S rDNA測序來檢測分析GRAE處理組與空白對照組小鼠腸道菌群豐度的變化，進而探討腸道菌群與睡眠之間可能存在的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 無柄靈芝醇提物的制備及成分分析 無柄靈芝子實體由福建農(nóng)林大學菌物研究中心提供。選取栽培3個月且菌蓋直徑≥10 cm的無柄靈芝子實體，參照鐘千貴等［25］的方法制備無柄靈芝醇提物，提取率為9.83%；經(jīng)前期實驗可知無柄靈芝醇提物總糖含量為48.77%，總?cè)坪繛?5.37 mg/g，游離必需氨基酸總含量為45.542 mg/g，對ABTS、DPPH、羥基自由基清除率分別為 54.48%、24.42%、10.32%。

1.1.2 主要試劑 巴比妥鈉為分析純，購自北京嵐泰化工科技有限公司。戊巴比妥鈉為分析純，購自北京華業(yè)寰宇化工有限公司。Phusion Hot Start Flex 2X Master Mix購自北京華夏遠洋科技有限公司。E.Z.N.A.?Stool DNA Kit試劑盒試劑盒購自Omega Biotechnology公司。

1.1.3 實驗動物 清潔級ICR雄性小鼠，體重（20±1）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號碼：SCXK（滬）2017-0005。小鼠飼養(yǎng)在小鼠飼養(yǎng)籠內(nèi)，控制環(huán)境溫度為（24±1）℃，相對濕度為60%±10%，12 h間替的光/暗循環(huán)。實驗前老鼠進行一周的適應性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間老鼠自由進食。動物實驗的操作嚴格遵循實驗室動物使用指南，動物方案得到了福建農(nóng)林大學食品科學學院動物護理與使用委員會的批準（FS-2019-0055）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 參考《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003版）稍作修改，選擇40只體重偏差在2 g以內(nèi)的小鼠，隨機分為4組：對照組（CK，蒸餾水）、低劑量組（LDG，250 mg/（kg·bw）、中劑量組（MDG，500 mg/（kg·bw）和高劑量組（HDG，1 000 mg/（kg·bw）。每天上午9：00-10：00，通過灌胃給藥，每天1次。根據(jù)小鼠的體重灌胃相應體積的藥劑，劑量為0.2 mL/10 g·bw，連續(xù)灌服30 d。

1.2.2 睡眠實驗 睡眠實驗參照Yu等［26］的方法，戊巴比妥鈉和巴比妥鈉的濃度是經(jīng)預實驗驗證的能引起小鼠睡眠的最低濃度。

戊巴比妥鈉誘導下GRAE延長小鼠睡眠時間實驗：各組小鼠在末次給藥20 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉（55 mg/kg），注射量為0.2 mL/20 g，觀察GRAE能否延長戊巴比妥鈉睡眠時間。

戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗：各組小鼠在末次給藥20 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉（32 mg/kg），注射量為0.2 mL/20 g，記錄30 min內(nèi)入睡小鼠數(shù)量。

巴比妥鈉誘導下GRAE對小鼠睡眠潛伏期影響的實驗：各組小鼠在末次給藥20 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉（280 mg/kg），注射量為0.2 mL/20 g，觀察在巴比妥鈉誘導下GRAE對小鼠睡眠潛伏期的影響。

1.2.3 血清指標檢測 持續(xù)給藥30 d后，將小鼠禁食12 h，提供充足的水，眼球取血，離心收集血清，備用。測定血清中的血糖（glucose，GLU），甘油三酯（triglyceride，TG），血清總膽固醇（total serum cholesterol，TCHO），低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C） 的含量。

1.2.4 16S rDNA測序鑒定小鼠腸道菌群及功能分析 收集小鼠糞便樣品，采用干冰送樣的方法送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進行測序。根據(jù)公司反饋的高質(zhì)量的clean標簽。使用Vsearch軟件（v2.3.4）對嵌合序列進行過濾，用QIIME2進行Beta多樣性分析，R包繪制圖。最后采用BLAST進行序列比對，每個代表性序列用SILVA數(shù)據(jù)庫對特征序列進行注釋，用生物信息學方法對結(jié)果進行了分析［27］。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 16.0，并使用GraphPad Prism 6進行繪圖。所有數(shù)值以平均值±SD表示。每組實驗設計為3個平行，實驗結(jié)果采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P< 0.05的差異被認為是顯著的。

2 結(jié)果

2.1 GRAE對小鼠體重的影響

由表1可知，與空白組相比，無柄靈芝低、中、高劑量組均不存在顯著性差異（P> 0.05），但隨著給藥天數(shù)的增加體重差異越來越明顯。實驗組中隨著給藥劑量的增加小鼠體重有遞減趨勢，實驗組間不存在顯著性差異。說明GRAE對小鼠的體重的增長沒有明顯影響。

表1 無柄靈芝醇提物對小鼠的體重的影響Table 1 Effects of GRAE on the body weights of mice

2.2 無柄靈芝醇提物改善小鼠睡眠能力分析

小鼠在給藥后均未出現(xiàn)入睡現(xiàn)象，但出現(xiàn)活動減少現(xiàn)象；CK組的小鼠在灌胃同等體積的蒸餾水后，活動正常，無任何安靜和減少活動的現(xiàn)象。由此可知，無柄靈芝醇提物對小鼠沒有直接睡眠的作用，但有一定的安眠鎮(zhèn)神的作用。GRAE對小鼠沒有直接睡眠作用，根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003版），可以使用戊巴比妥鈉和巴比妥鈉誘導小鼠睡眠進行下一步實驗。

由表2可知，在戊巴比妥鈉（55 mg/kg）的催眠下，LDG組的小鼠睡眠時間與空白組的相比不具有顯著性差異（P>0.05），MDG和HDG組的小鼠睡眠時間與CK組相比存在極顯著性差異（P<0.01）。在戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗中，隨著給藥劑量的增加，入睡小鼠的只數(shù)增多，入睡率增加。在巴比妥鈉（280 mg/kg）對小鼠睡眠潛伏期的研究中，隨著給藥劑量的增加，小鼠的睡眠潛伏時長呈遞減的趨勢。與CK組對比，LDG和MDG組雖然睡眠潛伏期有縮短，但不具有顯著差異性；HDG組的睡眠潛伏期與空白組相比，具有顯著的減少（P<0.01）。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003版）可判定，GRAE（1 000 mg/kg·bw）有改善睡眠的功能。

2.3 GRAE對小鼠血清的影響

由圖1可知，與CK組相比，HDG組的血糖和甘油三脂均極顯著下降（P<0.01），血清總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇均無顯著性差異，但有一定的下降趨勢。

圖1 持續(xù)給藥30 d后小鼠的血清指標變化Fig.1 Changes of serum indexes in mice after 30 d of continuous administration

2.4 16S rDNA測序數(shù)據(jù)

由公司對原始數(shù)據(jù)進行雙端拼接、質(zhì)量控制、嵌合體過濾后，獲得有效數(shù)據(jù)（clean data），進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表3。由表3可知，有效數(shù)據(jù)都在80%以上，可以有效滿足后續(xù)的實驗分析。

表3 有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 3 Effective data statistics

2.5 小鼠腸道菌群的feature分析

Feature是經(jīng)過去除背景噪音獲得的特征序列。通過對Feature的Venn圖分析，CK組獨有的feature有1 294個，HDG組獨有的feature有1 663個，兩組共有的feature有1 053個（圖2）。

圖2 兩組樣本的韋恩圖Fig.2 Venn diagram in two groups of samples

2.6 Alpha多樣性分析和beta多樣性分析

本研究采用Chao1和Observed_species估計小鼠腸道菌群中包含物種的數(shù)目，Shannon和Simpson指數(shù)來評估物種的均勻度和豐富度，Goods _coverage反映樣本的測序深度。由表4可知，CK組和HDG組的Coverage指數(shù)都是0.908，表明該次樣本測序結(jié)果可代表樣本的真實情況。與CK組相比，HDG組的Observed_species、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)均出現(xiàn)不同程度的降低。PCA分析結(jié)果表明HDG與CK組的腸道菌群結(jié)構(gòu)組間差異大。PCA分析結(jié)果表明HDG與CK組的組間差異明顯，說明GRAE對小鼠腸道菌群的多樣性有影響（圖3）。

圖3 PCA分析比較組間差異Fig.3 Difference between PCA analysis and comparison groups

表4 各組小鼠糞便樣品中α多樣性的指數(shù)Table 4 Alpha diversity index of each group in fecal samples

2.7 小鼠腸道菌群分類學組成分析

對小鼠腸道菌群的16S rDNA測序結(jié)果進行分類學組成分析，總共注釋到19個門、43個綱、65個目、107個科、185個屬、213個種，根據(jù)注釋結(jié)果選取門、屬水平菌群豐度排名前20 feature生成堆疊圖。在門水平上（圖4-A），CK組和HDG組的優(yōu)勢菌群均為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）。與CK組相比，HDG組中厚壁菌門、變形桿菌門、脫鐵桿菌門的菌群豐度有所下降；擬桿菌門和放線菌門的菌群豐度有所增加。在屬水平上（圖4-B），CK組和HDG組的優(yōu)勢菌群主 要 集 中 在Porphyromonadaceae、Lachnospiraceae、Desulfovibrio、Alistipes和Ruminococcus屬。與CK組相比，HDG組中脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、Alistipes屬、乳酸菌屬（Lactobacillus）的菌群豐度有所下降，Porphyromonadaceae、Ruminococcaceae、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的菌群豐度有所增加。

圖4 群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig. 4 Distribution of community structure

進一步將HDG與CK組的數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，結(jié)果如圖5所示，在屬水平上，與CK組相比，HDG組的菌群豐度具有顯著性差異（P< 0.05）變化的菌群有5個，分別為Rikenellaceae、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、Proteobaceria、醋桿菌屬（Acetobacterium）、丙酸桿菌屬（Propionibacterium），這5個屬的菌群的豐度均表現(xiàn)為降低。

圖5 差異菌群顯著性分析（CK vs HDG）Fig.5 Significance analysis of differential microbiota（CK vs HDG）

3 討論

小鼠睡眠實驗結(jié)果顯示，GRAE（1 000 mg/kg·bw）可以延長戊巴比妥鈉誘導下小鼠的睡眠時間，增加戊巴比妥鈉閾下劑量催眠下小鼠的睡眠率，并縮短巴比妥鈉誘導下小鼠的睡眠潛伏期。這些結(jié)果表明，GRAE能延長小鼠睡眠時間，該結(jié)果為開發(fā)改善睡眠的功能性健康產(chǎn)品提供了依據(jù)。血清指標結(jié)果表明，改善睡眠后小鼠的血糖和甘油三脂含量顯著下降。黃曙文［28］研究證明血清中的甘油三脂含量過高，會影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，產(chǎn)生抑郁情緒障礙，進而影響入睡，與本文結(jié)果相符。

腸道微生物群與大腦之間存在雙向關系，通常稱為微生物群-腸-腦軸，該軸在調(diào)節(jié)腦功能和行為中起關鍵作用。在腸道菌群影響情緒的過程中，微生物代謝物可能起重要的作用，一些細菌能夠產(chǎn)生與動物神經(jīng)系統(tǒng)中相同的神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，包括γ-氨基丁酸、乙酰膽堿、多巴胺、血清素和去甲腎上腺素［29］。睡眠深受大腦調(diào)節(jié)，情緒的變化也會對睡眠質(zhì)量產(chǎn)生影響。本研究的16S rDNA測序結(jié)果表明，CK組與HDG組的腸道菌群豐度都存在差異。小鼠腸道菌群分類學組成分析表明，GRAE能使擬桿菌門和放線菌門的菌群豐度增加。李云等［30］研究發(fā)現(xiàn)剝奪睡眠后大鼠的腸道菌群中的擬桿菌門豐度減少。這與本文中，GRAE可能通過調(diào)節(jié)小鼠腸道中擬桿菌的豐度進而對小鼠睡眠產(chǎn)生影響的結(jié)果相符。此外，菌群分類學組成分析還表明，GRAE能增加雙歧桿菌屬的菌群豐度，降低乳酸菌屬的菌群豐度。雙歧桿菌屬是人類的益生菌，能改善腸道菌群的平衡，促進營養(yǎng)吸收，具有良好的預防疾病作用［31］。任曉宇等［32］研究表明，剝奪睡眠后，小鼠糞便中雙歧桿菌顯著減少。雙歧桿菌可減少了動物模型中的焦慮行為，增加REM 睡眠持續(xù)時間，恢復了產(chǎn)前應激動物的睡眠結(jié)構(gòu)［33］。乳酸菌可通過生成γ-氨基丁酸影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而改善睡眠模式和質(zhì)量［34］。因此可以推測，GRAE可能通過調(diào)節(jié)小鼠腸道擬桿菌門、雙歧桿菌和乳酸菌的豐度，進而改善小鼠睡眠。

屬水平上的顯著性分析表明，GRAE使克雷伯氏菌屬的菌群豐度顯著性下降?？死撞暇饕嬖谌撕驮S多動物的呼吸道以及消化道中，可導致肺炎、支氣管炎、腦膜炎等疾病［35］，是一種有害菌。已有研究表明，腸道微生物誘發(fā)的炎癥明顯存在精神分裂癥、重度抑郁癥和雙相情感障礙等精神疾病的患者中［36］。這些精神疾病均會導致患者發(fā)生不同程度的睡眠障礙。因此，可推測GRAE可能通過減少克雷伯氏菌屬的豐度，預防由小鼠腸道中有害菌引起的炎癥，從而間接地改善睡眠質(zhì)量。

4 結(jié)論

GRAE可能通過調(diào)節(jié)腸道中的擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸菌和克雷伯氏菌的豐度影響小鼠睡眠。盡管還需要進一步的研究來確定無柄靈芝中能夠改善睡眠和調(diào)節(jié)腸道菌群的活性成分，但這項研究為今后研究無柄靈芝的功能和作用機制提供了數(shù)據(jù)支持。