抗稻瘟病基因Pigm組合標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用

李白 蔡之軍 王蕾 陳婕 曹奎榮 李軍 種高軍

（1.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，嘉興 314016；2.嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院，嘉興 314036）

稻瘟病是水稻三大病害之一，化學(xué)防治是其最直接、有效的防治措施，但易產(chǎn)生耐藥性和生態(tài)問(wèn)題［1］。培育和種植抗性品種是目前防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效的手段［2-3］。傳統(tǒng)育種主要是通過(guò)表型抗性鑒定，篩選抗病品種，但整體工作量大，育種周期長(zhǎng)，且易受環(huán)境條件限制。分子標(biāo)記輔助選擇（mark-assisted selection，MAS）對(duì)內(nèi)部目標(biāo)基因或與目標(biāo)基因緊密連鎖的位點(diǎn)進(jìn)行選擇，不受外部環(huán)境影響，是傳統(tǒng)育種有效輔助手段［4］。

選育抗稻瘟病品種的關(guān)鍵策略，是聚合抗譜廣且持久的抗病基因［3，5］。Pigm 是從谷梅 4號(hào)（Gumei4）中鑒定到的抗稻瘟病基因，與Pi2、Pi9、Pi40、Pi50和Piz-t同屬6號(hào)染色體Piz位點(diǎn)，但較它們抗譜更廣，對(duì)葉瘟和穗瘟都有較好抗性，是目前常用的抗稻瘟病基因之一［3，6-13］。Wu 等［14］系統(tǒng)地評(píng)估了Piz位點(diǎn)不同等位基因與其他廣譜R基因（如Pi1、Pi33和Pi54）結(jié)合的抗性效應(yīng)，結(jié)果表明，Pigm與Pi1、Pi54或Pi33是最有效的基因組合模式。

用于檢測(cè)Pigm的標(biāo)記包括M80410［6］、Pigm-4［15］、T9E4［16］、DG-2［17］、R060939［18］、GMR-3［19］和T-Pigm［20］等，經(jīng)分析，這些分子標(biāo)記或特異性不足或不能鑒定雜合基因型。本研究通過(guò)對(duì)這7個(gè)Pigm分子標(biāo)記的分析與實(shí)驗(yàn)，篩選了Pigm-4與M80410組合標(biāo)記。利用組合標(biāo)記輔助選育鎮(zhèn)糯19×空育131（Pigm）雜交后代，選育了糯稻品系NK29，具有較好稻瘟病抗性。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)用的水稻材料主要為嘉興市農(nóng)科院留存，其中空育131（Pigm）由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供，鎮(zhèn)糯19引種于江蘇省鎮(zhèn)江市農(nóng)科院。

1.2 方法

1.2.1 分子標(biāo)記序列分析 在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng) 站 上 對(duì) 7個(gè) Pigm 標(biāo) 記 Pigm-4、T9E4、DG-2、M80410、R060939、GMR-3 和 T-Pigm 進(jìn)行分析，堿基序列見(jiàn)表1，其中T-Pigm是擴(kuò)增受阻PCR體系，包含2對(duì)引物，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 用于檢測(cè)Pigm基因的分子標(biāo)記Table 1 Molecular markers used to detect Pigm

1.2.2 PCR檢測(cè)分析 分別用7種標(biāo)記對(duì)40份水稻材料（表3）進(jìn)行檢測(cè)。采用TPS法提取水稻葉片基因組DNA，PCR檢測(cè)采用20 μL體系，含10 μL 2×PCR Mix，正、反向引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL（約25 ng），超純水補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 kb/min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min結(jié)束。使用2%瓊脂糖凝膠電泳。Pigm-4與M80410組合標(biāo)記多重PCR，引物各0.5 μL，其他反應(yīng)條件與上述相同。

1.2.3 輔助選育糯稻品系NK29 以鎮(zhèn)糯19為母本，空育131（Pigm）為父本進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代與鎮(zhèn)糯19進(jìn)行回交，之后連續(xù)自交至獲穩(wěn)定品系NK29，期間利用Pigm標(biāo)記輔助選擇，并進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定（苗期噴霧接種）。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)記比對(duì)分析

7個(gè)Pigm分子標(biāo)記比對(duì)分析表明，M80410區(qū)段序列僅在Gumei4中有擴(kuò)增片段，特異性強(qiáng)，但不能區(qū)分雜合基因型；Pigm-4、T9E4、R060939和T-Pigm標(biāo)記能鑒定雜合基因型，但在其它非Pigm序列中也有擴(kuò)增片段，特異性不足；DG-2、GMR-3特異性不足，也不能區(qū)分雜合基因型，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2。Gumei4 Pigm序列（NCBI登記號(hào)：KU904633.2）長(zhǎng)度為178 704 bp， 標(biāo) 記 Pigm-4、T9E4、DG-2、M80410、GMR-3、T-Pigm擴(kuò)增片段均在Pigm內(nèi)部，根據(jù)Gumei4和Nipponbare分子標(biāo)記的相對(duì)位置，估計(jì)R060939的位置為-897 333- -896 515，相對(duì)遺傳距離見(jiàn)圖1。

圖1 Pigm標(biāo)記相對(duì)遺傳距離Fig.1 Relative genetic distances of Pigm markers

表2 Pigm標(biāo)記引物NCBI比對(duì)分析Table 2 Alignment and analysis of Pigm marker primers by NCBI

2.2 PCR檢測(cè)分析

用7個(gè)Pigm分子標(biāo)記對(duì)40份水稻品種品種進(jìn)行檢測(cè)，見(jiàn)表3，其中Gumei4 7個(gè)標(biāo)記均為陽(yáng)性。根據(jù)結(jié)果推斷，標(biāo)記中M80410、Pigm-4和T-Pigm特異性好，僅Gumei4是陽(yáng)性，結(jié)合引物比對(duì)結(jié)果，M80410特異性最好，Pigm-4和T-Pigm對(duì)Pigm檢測(cè)可能會(huì)受Pi50（KP985759.1）干擾；GMR-3、T9E4和DG-2檢測(cè)特異性稍差；T9E4和DG-2兩個(gè)標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果相似度較高，40個(gè)品種中除日本晴，其他39個(gè)結(jié)果一致。這些標(biāo)記中R060939雖與Pigm連鎖，但檢測(cè)特異性不明顯。

表3 水稻樣品Pigm標(biāo)記檢測(cè)Table 3 Detection of Pigm markers in rice varieties

2.3 組合標(biāo)記檢測(cè)

M80410特異性強(qiáng)，但是顯性標(biāo)記，不能區(qū)分雜合基因型，降低了MAS育種的準(zhǔn)確性與速度。而Pigm-4能區(qū)分雜合基因型，特異性也較好，帶型與M80410相差400 bp左右，見(jiàn)圖2?？山Y(jié)合兩個(gè)標(biāo)記特點(diǎn)，利用多重PCR建立組合標(biāo)記檢測(cè)體系，M80410與Pigm-4組合標(biāo)記的帶形圖和結(jié)果判定見(jiàn)圖3。將組合標(biāo)記應(yīng)用于鎮(zhèn)糯19×空育131（Pigm）的MAS育種，見(jiàn)圖4，結(jié)果說(shuō)明組合標(biāo)記能特異性檢測(cè)Pigm基因，并能區(qū)分雜合型基因。

圖2 M80410、Pigm-4擴(kuò)增條帶類(lèi)型Fig.2 Types of M80410 and Pigm-4 amplified bands

圖3 M80410和Pigm-4組合標(biāo)記擴(kuò)增條帶結(jié)果Fig.3 Amplification results of M80410 and Pigm-4 combined marker

2.4 組合標(biāo)記輔助選育糯稻品系NK29

水稻品系NK29及主要中間材料經(jīng)組合標(biāo)記檢測(cè)，能區(qū)別Pigm “+”、“-”和“±”3種基因型，提高輔助育種效率，見(jiàn)圖4。Pigm導(dǎo)入后高世代材料的稻瘟病抗性見(jiàn)表4。NK29經(jīng)安徽省農(nóng)科院植微所鑒定，兩年稻瘟病病情綜合指數(shù)均在1.8-2.7級(jí)，表現(xiàn)為“抗”或“中抗”，較鎮(zhèn)糯19的稻瘟病抗性具有顯著的改良。

表4 Pigm導(dǎo)入系高世代稻瘟病抗性鑒定Table 4 Identification of blast resistance of Pigm introgression line in high generation

圖4 M80410與Pigm-4組合標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection results of M80410 and Pigm-4 combined marker

3 討論

稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的，水稻與病菌的相互變異、進(jìn)化、作用像是一項(xiàng)持久的“軍事裝備戰(zhàn)”［21］，其中Pigm正扮演著重要角色。Deng 等［22］對(duì) Pigm 的研究表明，Pigm是一個(gè)包含 13 個(gè)元件的基因簇，這可能是其較 Piz基因座其他等位基因抗譜更廣的原因，進(jìn)一步研究表明 Pigm 表觀遺傳主要受 PigmR（R6）與 PigmS（R8）共同作用，這維持了水稻抗性與產(chǎn)量的平衡，可能是它抗性持久的原因之一?？沟疚敛』蚓哂蓄?lèi)似NBS結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致了這類(lèi)基因有部分相似或相同序列區(qū)段。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)標(biāo)記Pigm-4 標(biāo)記所在區(qū)段序列與同屬一個(gè)基因座的Pi2、Pi9、Pi40、Piz-t、Piz、均不同［16］，表現(xiàn)出Pigm序列的特異性，但與Pi50、Pid4所在區(qū)段序列相似，其特異性較M80410稍差，在MAS工作中，也存在一些樣品Pigm-4檢測(cè)為“+”，M80410檢測(cè)為“-”。M80410特異性強(qiáng)，但它是顯性標(biāo)記，不能區(qū)分純合與雜合基因型，這不利于分子輔助育種中對(duì)純合體的篩選及雜合體的鑒別。Pigm-4 擴(kuò)增條帶大小約 81 bp（+）、125 bp（-）和 155 bp（-），M80410擴(kuò)增條帶約 517 bp（+），4種條帶差異明顯，故本研究將Pigm-4與M80410組合標(biāo)記在一起，利用多重PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Pigm基因型。組合標(biāo)記的多重PCR條件與單個(gè)標(biāo)記相同，擴(kuò)增效果較好，未經(jīng)優(yōu)化也可用于檢測(cè)。但檢測(cè)體系也存在不足，如PCR的引物濃度配比、體積縮減、最優(yōu)Tm和延伸時(shí)間篩選等可做進(jìn)一步優(yōu)化，以更好地應(yīng)對(duì)大批量樣品的Pigm標(biāo)記檢測(cè)。同時(shí)更好的Pigm檢測(cè)方法或可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

近年來(lái)育種家們已利用Pigm育成多個(gè)優(yōu)良品種或品系，如空育131、龍粳26、墾鑒稻6、農(nóng)香42、R9311（Pigm）、KT27S 和 JF35-2 等［23-28］。 本研究以鎮(zhèn)糯19為母本，空育131（Pigm）為父本，利用M80410與Pigm-4組合標(biāo)記，遴選了一批含Pigm的高世代材料。結(jié)果表明F1、BC1F1和BC2F6株系均比母本鎮(zhèn)糯19提高了稻瘟病抗性，最終結(jié)合農(nóng)藝性狀選育了攜帶Pigm的糯稻品系NK29。NK29較鎮(zhèn)糯19的稻瘟病抗性具有顯著改良，且保留了鎮(zhèn)糯19較好糯性的特性，目前已進(jìn)入?yún)^(qū)試?yán)m(xù)試階段，但要準(zhǔn)確評(píng)價(jià) Pigm 在糯稻育種中的利用價(jià)值，還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

M80410標(biāo)記特異性強(qiáng)，Pigm-4標(biāo)記能區(qū)分雜合基因型，將Pigm-4與M80410作為組合標(biāo)記，能快速準(zhǔn)確地鑒定Pigm 的純合顯性、純合隱性和雜合基因型。組合標(biāo)記用于MAS，選育了糯稻品系NK29，具有較好稻瘟病抗性。