m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因在牛脂肪生成中的表達(dá)分析

楊昕冉 王建芳 馬鑫浩 昝林森，2

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100；2.國(guó)家肉牛改良中心，楊凌 712100）

牛肉因其高蛋白、低膽固醇，且富含人體需要氨基酸，越來(lái)越受到人們的青睞，但我國(guó)肉牛仍存在良種率偏低、產(chǎn)肉性能和肉品質(zhì)差等問(wèn)題。秦川牛作為我國(guó)地方良種黃牛，個(gè)體抗逆性好、耐粗飼、具有被開(kāi)發(fā)和培育成生產(chǎn)高品質(zhì)牛肉的專(zhuān)門(mén)化肉牛品種的潛力［1］。如何進(jìn)一步利用我國(guó)以秦川牛為代表的地方黃牛優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，提高牛肉品質(zhì)，是我國(guó)肉牛產(chǎn)業(yè)亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。

許多研究表明肌內(nèi)脂肪的分布和含量決定了大理石花紋豐度——衡量牛肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。動(dòng)物體內(nèi)脂肪的沉積和脂質(zhì)的合成主要是由脂肪細(xì)胞數(shù)量增多（前體脂肪細(xì)胞的增殖）、體積增大（脂肪細(xì)胞分化、甘油三酯積累、脂滴增大）和成熟來(lái)決定［2］。前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化除了受到一系列特定且關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控外［3］，還受到如DNA甲基化［4］、組蛋白修飾［5］等表觀遺傳的調(diào)控。而RNA N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）作為近幾年的研究熱點(diǎn)，其對(duì)脂肪發(fā)育的重要調(diào)控作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。作為mRNA中最常見(jiàn)的甲基化修飾，m6A修飾被證明具有動(dòng)態(tài)可逆性，主要由包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3（methyltransferase 3，METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白 14（methyltransferase 14，METTL14）［6］和腎細(xì)胞瘤 1-結(jié)合蛋白（Wilms’ Tumor 1-Associating Protein，WTAP）［7］等組成甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化RNA上腺苷酸發(fā)生m6A修飾，同時(shí)脂肪量與肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）［8］和 Alk B同源蛋白 5（AlkB Homolog 5，ALKBH5）［9］等去甲基化酶可以對(duì)已發(fā)生m6A修飾的堿基進(jìn)行去甲基化修飾。

越來(lái)越多的證據(jù)表明m6A修飾通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控RNA的穩(wěn)定性、定位、運(yùn)輸、剪切和翻譯進(jìn)而在調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞周期、胚胎干細(xì)胞重編程、個(gè)體發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能［10-13］。近年來(lái)，m6A在脂肪生成中的調(diào)控作用也不斷被發(fā)現(xiàn)，在FTO被發(fā)現(xiàn)可作為重要的肥胖候選基因后［14］，更多研究發(fā)現(xiàn)FTO可通過(guò)調(diào)控靶基因m6A的水平影響可變剪切、自噬通路、有絲分裂的克隆擴(kuò)增等生物學(xué)過(guò)程進(jìn)而促進(jìn)脂肪生成［15-17］。METTL3可以通過(guò)促進(jìn)CCNA2、FASN、JAK1等基因mRNA的m6A修飾調(diào)控脂肪生成［18-20］，近期研究還發(fā)現(xiàn)了METTL3對(duì)小鼠棕色脂肪的生成至關(guān)重要［21］。此外，國(guó)內(nèi)陸續(xù)在豬、雞等畜禽動(dòng)物中發(fā)表了脂肪組織發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組水平的m6A甲基化修飾圖譜，揭示m6A在畜禽脂肪生成和沉積中的潛在作用［22-23］。但m6A甲基化修飾對(duì)牛脂肪發(fā)育和脂質(zhì)合成的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，同時(shí)其在體外調(diào)控前體脂肪細(xì)胞增殖與分化的功能和機(jī)制仍不明確。

本研究分析METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5等m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因在秦川肉牛體內(nèi)不同組織以及在體外前體脂肪細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中的表達(dá)模式。一方面為秦川肉牛的遺傳改良和分子育種提供理論依據(jù)，另一方面從新的表觀遺傳修飾角度研究RNA甲基化對(duì)脂生成的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用牛只為西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)家肉牛改良中心良種繁育場(chǎng)培育的秦川肉牛，分別選取3頭身體健康、狀態(tài)良好的新生（1日齡）和成年秦川肉牛（36月齡），分別采集其心、肝、脾、腎、背最長(zhǎng)肌、前腿肌、后腿肌和脂肪組織樣品，置于-80℃保存待用。

1.2 方法

1.2.1 前體脂肪細(xì)胞分離、培養(yǎng)與分化 從上述新生秦川肉牛腎周脂肪中分離前體脂肪細(xì)胞。取脂肪組織剪碎，加入等體積的I型膠原酶，37℃消化60 min，加入含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）終止消化，依次過(guò)100 μm和40 μm的細(xì)胞篩，濾液在1 500 r/min、4℃下離心10 min，收集沉淀且重懸于完全培養(yǎng)基中，吹打均勻后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-100%密度時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)，將含有10%FBS和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基換成含有10%FBS、0.01%地塞米松、0.3% 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1%胰島素和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，誘導(dǎo)成脂分化。2 d后換成含有10%FBS、1%胰島素和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，維持成脂分化，每2 d進(jìn)行一次換液。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 使用Trizol法提取組織和細(xì)胞中的總RNA，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA的純度和濃度，放于-80℃保存?zhèn)溆?。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，其中去除DNA反應(yīng)體系為：依次加入2.0 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1.0 μL gDNA Eraser、1 000 ng總RNA，RNase-free ddH2O補(bǔ)足 10 μL，42℃反應(yīng)2 min。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：在上述反應(yīng)液中依次 加 入 4.0 μL 5×PrimeScript Buffer、4.0 μL RNasefree dH2O、1.0 μL RT Primer Mix 和 1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix， 共 計(jì) 20 μL，37℃ 反 應(yīng) 15 min，85℃中15 s終止反應(yīng)。cDNA放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR） 使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNase H Plus）（TaKaRa，大連）熒光定量試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。15 μL的反應(yīng) 體 系 為 ：7.5 μL TB Green Premix Ex Taq（2×）、各0.5 μL的上下游引物、1.5 μL cDNA模板（10倍稀釋?zhuān)┖?5.0 μL RNase-free H2O，95℃ 30 s，95℃ 3 s、60℃ 30 s、40個(gè)循環(huán)。使用GAPDH（組織表達(dá)譜使用）或β-actin（細(xì)胞試驗(yàn)使用）為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品均設(shè)置至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR所用的引物見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR所用引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.2.4 油紅O染色 油紅O工作液配制：0.5 g油紅O染料溶于100 mL異丙醇后為油紅O原液，將原液與ddH2O按3∶2混合，過(guò)濾后為油紅O工作液。染色：棄去細(xì)胞培養(yǎng)基并用PBS漂洗細(xì)胞3遍，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min。棄去固定液再用PBS漂洗3遍，加入油紅O工作液染色30 min。棄去染液，PBS洗凈后在倒置顯微鏡下觀察并記錄脂滴形成情況。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 使用GraphPad Prism 7.00軟件（GraphPad Software公司，美國(guó)）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并生成圖片。分別用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析（One-way ANOVA）比較兩組和多組之間的差異，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，每組設(shè)置至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因在秦川肉牛不同組織中的表達(dá)分析

為了檢測(cè)m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因在不同月齡秦川牛各組織中的表達(dá)水平，分別采集了新生牛和成年牛的心、肝、脾、腎、背最長(zhǎng)肌、前腿肌、后腿肌和脂肪等組織。RT-qPCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在新生牛不同組織中，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14、WTAP和去甲基化酶FTO、ALKBH5的組織表達(dá)譜相似，均是在肝和脾中高表達(dá)，在心臟以及背最長(zhǎng)肌、前腿肌和后腿肌等骨骼肌中低表達(dá)，而在腎和脂肪組織中的表達(dá)穩(wěn)定且水平基本一致（圖1-A-E）。在成年牛中的表達(dá)模式與新生牛不同的是，除了在肝和脾中高表達(dá)外，METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5在成年牛腎臟和脂肪組織中也表現(xiàn)出高表達(dá)水平（圖1-F-J），并且METTL3、METTL14、WTAP和FTO不管在新生牛還是在成年秦川肉牛的脂肪組織中的表達(dá)量均顯著高于肌肉組織（P＜0.05），而ALKBH5在肌肉和脂肪組織中的表達(dá)無(wú)顯著差異。

為了分析m6A甲基化酶基因在秦川牛脂肪發(fā)育中的潛在作用，進(jìn)一步比較了m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14、WTAP和 去 甲 基 化 酶 FTO、ALKBH5在新生牛和成年牛脂肪組織中的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，不管是甲基轉(zhuǎn)移酶還是去甲基化酶在成年牛脂肪組織中的表達(dá)量均顯著高于新生牛（P＜0.05）（圖1-K），說(shuō)明m6A甲基化修飾可能對(duì)于牛的脂肪發(fā)育具有潛在且復(fù)雜的作用機(jī)制。其中，F(xiàn)TO的表達(dá)水平相對(duì)較高且表達(dá)差異最明顯，ALKBH5的表達(dá)量相對(duì)最低，暗示FTO可能在調(diào)控牛脂肪發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

圖1 m6A甲基化相關(guān)酶基因在秦川肉牛不同組織中的表達(dá)Fig.1 Expressions of m6A methylation-related genes in different tissues of Qinchuan beef cattle

2.2 秦川肉牛前體脂肪細(xì)胞的增殖檢測(cè)

為了進(jìn)一步研究m6A甲基化酶基因在牛體外前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)模式，在新生秦川肉牛中分離了前體脂肪細(xì)胞。如圖2-A所示，將第3代前體脂肪細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)后，細(xì)胞可以正常增殖，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞數(shù)量隨天數(shù)逐漸增多。前體脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)也基本呈現(xiàn)“S”型，從前期緩慢生長(zhǎng)到中期指數(shù)增長(zhǎng)，在第7天細(xì)胞基本長(zhǎng)滿(mǎn)且達(dá)到生長(zhǎng)平臺(tái)期（圖2-B）。這些結(jié)果表明本研究分離的前體脂肪細(xì)胞具有正常生長(zhǎng)增殖的能力。

圖2 秦川肉牛前體脂肪細(xì)胞的形態(tài)與生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.2 Morphology and growth curve of preadipocytes from Qinchuan beef cattle in vitro

2.3 秦川肉牛前體脂肪細(xì)胞的成脂分化

待前體脂肪細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后誘導(dǎo)成脂分化，并使用油紅O進(jìn)行脂滴染色。結(jié)果如圖3-A所示，在誘導(dǎo)分化第3天時(shí)，圍繞細(xì)胞核成簇分布的小脂滴開(kāi)始出現(xiàn)。而后隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，脂滴增多且逐漸融合形成大脂滴。同時(shí)提取了前體脂肪細(xì)胞分化第0、3、6、9、12天的總RNA，對(duì)調(diào)控成脂的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子——過(guò)氧化物酶體增生因子激活受體γ（PPARγ）、CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 α（C/EBPα）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（C/EBPβ）以及參與脂肪合成代謝的基因——脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）進(jìn)行了RT-qPCR檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)參與成脂分化早期的轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα的表達(dá)在第3天顯著上升，隨后下降（P＜0.05）（圖3-B）。而在成脂分化中后期發(fā)揮調(diào)控作用的C/EBPβ的表達(dá)在分化前期逐漸上升，分化后期有所下降但仍維持較高表達(dá)水平（圖3-B）。FABP4的表達(dá)則隨著成脂分化的進(jìn)行而不斷增加（圖3-B）。這些成脂分化標(biāo)志基因在牛前體脂肪細(xì)胞分化的時(shí)序表達(dá)趨勢(shì)以及脂滴的形成與脂肪細(xì)胞成脂分化的一般規(guī)律相符。這些結(jié)果表明本試驗(yàn)分離的牛前體脂肪細(xì)胞具有正常的成脂分化能力，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

圖3 秦川肉牛前體脂肪細(xì)胞成脂分化檢測(cè)Fig.3 Detection of preadipocytes adipogenic differentiation in Qinchuan beef cattle

2.4 m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因在前體脂肪細(xì)胞增殖過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)譜

對(duì)5個(gè)m6A甲基化酶基因在牛前體脂肪細(xì)胞增殖期的不同時(shí)間點(diǎn)（第1、2、3、4、5、6、7天）進(jìn)行了相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的表達(dá)量在增殖前期逐漸降低，METTL14、WTAP也均與之一樣在第3天達(dá)到最低表達(dá)量，且在第4天有所上升，但僅維持較低的表達(dá)水平。而m6A去甲基化酶FTO在增殖前期基本無(wú)變化，隨后呈緩慢上升趨勢(shì)（P＜0.01）；另一個(gè)m6A去甲基化酶ALKBH5的表達(dá)先升高后下降（P＜0.01），在增殖中后期不斷升高（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14和WTAP可能在牛前體脂肪細(xì)胞增殖前期具有潛在的調(diào)控作用，而m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5可能在增殖中后期發(fā)揮作用。

圖4 m6A甲基化相關(guān)基因在前體脂肪細(xì)胞增殖過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)譜Fig.4 Temporal expression profile of m6A methylationrelated genes during preadipocytes proliferation

2.5 m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因在前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)譜

同樣地，使用RT-qPCR檢測(cè)了5個(gè)基因在牛前體脂肪細(xì)胞成脂分化不同時(shí)間點(diǎn)（第0、3、6、9、12天）的時(shí)序表達(dá)模式。結(jié)果如圖5所示，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14和去甲基化酶FTO的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，均在分化前期下降（P＜0.01），在第6天上升至高表達(dá)（P＜0.01），隨后又逐漸降低。而WTAP與ALKBH5的表達(dá)變化相似，前期維持穩(wěn)定表達(dá)，在第6天表達(dá)顯著增加且隨后繼續(xù)維持高表達(dá)水平至分化晚期第12天。這些結(jié)果暗示這些m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因可能具有潛在的調(diào)控牛前體脂肪細(xì)胞分化、影響脂肪生成的功能。

圖5 m6A甲基化相關(guān)基因在前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)譜Fig.5 Temporal expression profile of m6A methylationrelated genes during preadipocytes differentiation

3 討論

盡管m6A甲基化修飾早在20世紀(jì)70年代就被發(fā)現(xiàn)［24］，但因?yàn)檫^(guò)去實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法的限制，一直沒(méi)能引起人們的重視。而隨著m6A甲基化修飾動(dòng)態(tài)可逆模式［8］和高通量測(cè)序技術(shù)［25-26］的發(fā)展，m6A修飾發(fā)揮的生物學(xué)功能不斷被揭示，RNA甲基化研究也成為近十年的研究熱點(diǎn)。m6A已被發(fā)現(xiàn)可影響如多種癌癥細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移、胚胎干細(xì)胞分化、細(xì)胞命運(yùn)決定等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程［27-30］。近年來(lái)，m6A在畜禽肌肉和脂肪發(fā)育中的修飾模式和潛在作用也不斷被發(fā)現(xiàn)［21-23，31-34］。但m6A修飾在牛體內(nèi)和體外脂肪發(fā)育方面研究仍未見(jiàn)報(bào)道，而我國(guó)本地黃牛品種的脂肪沉積能力較國(guó)外優(yōu)良肉牛品種仍有一定差距，國(guó)內(nèi)肉牛行業(yè)仍需圍繞促進(jìn)牛肉脂肪沉積，增加大理石花紋，提高牛肉品質(zhì)等方面開(kāi)展科研創(chuàng)新。本研究選用國(guó)內(nèi)良種黃牛——秦川肉牛為研究對(duì)象，研究m6A修飾相關(guān)甲基化酶基因METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5在秦川肉牛不同組織中的表達(dá)水平，比較其在新生牛和成年牛脂肪組織中的表達(dá)差異；并分離出具有正常增殖和成脂分化能力的前體脂肪細(xì)胞，檢測(cè)這5個(gè)基因在秦川肉牛前體脂肪細(xì)胞增殖和成脂分化過(guò)程中的表達(dá)情況。

關(guān)于m6A修飾相關(guān)基因在動(dòng)物體內(nèi)不同組織中的表達(dá)研究較少，為了探究m6A修飾相關(guān)甲基化酶在牛不同組織中的表達(dá)特異性，對(duì)5個(gè)經(jīng)典的m6A甲基化酶基因進(jìn)行了表達(dá)量檢測(cè)。得到的結(jié)果與朱琳娜等［35］在不同品種豬的不同組織中關(guān)于FTO和METTL3的表達(dá)研究結(jié)果一致，均是在骨骼肌中低表達(dá)，在肝臟中高表達(dá)。此外，上述研究還發(fā)現(xiàn)了FTO和METTL3在不同品種豬的脂肪組織中有著穩(wěn)定的表達(dá)，本研究結(jié)果也表明除ALKBH5外，METTL3、METTL14、WTAP和FTO在脂肪組織中的表達(dá)顯著高于肌肉組織。另一項(xiàng)研究表明，F(xiàn)TO在大鼠的多種組織中均有表達(dá)［36］，與本研究不同的是該研究的數(shù)據(jù)顯示FTO在大鼠骨骼肌中表達(dá)要高于脂肪組織，本研究則是發(fā)現(xiàn)FTO在牛脂肪組織中的表達(dá)量顯著高于骨骼肌。另外，馬子玉等［37］的研究發(fā)現(xiàn)METTL3在豬的不同組織和器官中廣泛表達(dá)且差異較不明顯。這些不同結(jié)果的產(chǎn)生可能是由于品種間的差異所致。此外，這5個(gè)基因在牛的肝臟中均有明顯的高表達(dá)水平，暗示m6A修飾可能對(duì)牛肝臟功能的調(diào)控具有潛在作用，多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾在肝臟疾病中發(fā)揮重要作用也支持此推論［38-39］。再綜合這5個(gè)基因在成年牛脂肪組織中高表達(dá)的結(jié)果，表明m6A修飾相關(guān)酶基因與牛脂肪沉積、代謝和發(fā)育性能密切相關(guān)。

在體外研究脂肪細(xì)胞的功能可以便于更好地理解脂肪生成的分子機(jī)制。根據(jù)脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的變化一般將脂肪細(xì)胞分為：脂肪母細(xì)胞、脂肪前體細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞和成熟的脂肪細(xì)胞［40-41］，其中前體脂肪細(xì)胞是脂肪組織基本的生物學(xué)單位，其增殖分化能力的持續(xù)發(fā)生伴隨著動(dòng)物的一生［41］，而脂肪的沉積主要由前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化決定。為了進(jìn)一步研究m6A對(duì)脂肪生成的作用，試驗(yàn)分離了秦川肉牛的前體脂肪細(xì)胞，并鑒定了其具有正常增殖和成脂分化的能力，進(jìn)而在體外開(kāi)展上述5個(gè)基因在前體脂肪細(xì)胞增殖和分化中的表達(dá)分析。已有研究發(fā)現(xiàn)敲低m6A的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物METTL3/METTL14/WTAP中的任意一種都會(huì)通過(guò)降低CCNA2的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞周期，減弱脂肪生成［18］。另外，METTL3、METTL14和WTAP被發(fā)現(xiàn)促進(jìn)心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及多種癌細(xì)胞等的增殖［42-48］。本研究的增殖時(shí)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，METTL3、METTL14和WTAP均在增殖前期表達(dá)下降，增殖中后期表達(dá)恢復(fù)，說(shuō)明m6A甲基轉(zhuǎn)移酶可能也參與調(diào)控牛前體脂肪細(xì)胞的增殖。與甲基轉(zhuǎn)移酶的作用相對(duì)地，m6A去甲基化酶FTO被發(fā)現(xiàn)抑制白血病細(xì)胞的增殖［49］，ALKBH5可抑制干細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞的增殖［50-51］。此外，在脂肪生成方面，有研究發(fā)現(xiàn)FTO沉默推遲細(xì)胞周期的進(jìn)程，抑制脂肪形成［17，52］。任倩等［53］的研究表明 FTO 可通過(guò)抑制線(xiàn)粒體UPR來(lái)緩解小鼠脂肪細(xì)胞的凋亡。綜合本研究發(fā)現(xiàn)的FTO和ALKBH5在牛前體脂肪細(xì)胞增殖時(shí)序中的表達(dá)水平變化明顯且與甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)模式明顯不同的結(jié)果，可以推斷這5個(gè)m6A修飾相關(guān)酶基因可能通過(guò)發(fā)揮其調(diào)控m6A甲基化修飾的作用來(lái)參與牛前體脂肪細(xì)胞的增殖過(guò)程。

脂肪生成除了受前體脂肪細(xì)胞的增殖影響外，成脂分化中脂滴的形成和脂肪酸合成與代謝更是起到?jīng)Q定性作用。近年來(lái)，關(guān)于m6A修飾在畜禽脂肪生成和沉積中的作用機(jī)制研究逐漸增多，但主要圍繞m6A修飾的兩個(gè)明星酶基因——METTL3和FTO展開(kāi)。中科院楊運(yùn)桂課題組最早發(fā)現(xiàn)FTO的m6A去甲基化作用是脂肪生成必需的［15］。其他研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)FTO可以通過(guò)調(diào)控自噬［16］、線(xiàn)粒體DNA含量［54］等促進(jìn)小鼠脂肪積累。在畜禽動(dòng)物中的研究，Jia等［55］在雞脂肪中的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO通過(guò)介導(dǎo)m6A去甲基化，促進(jìn)與脂質(zhì)合成相關(guān)的基因表達(dá)進(jìn)而增加甘油三酯（TG）的積累。浙江大學(xué)汪以真課題組近些年來(lái)圍繞METTL3和FTO調(diào)控豬脂肪沉積方面的一系列研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO通過(guò)負(fù)調(diào)控豬脂肪細(xì)胞m6A水平，正調(diào)控脂肪沉積［35，56-57］；而METTL3通過(guò)正調(diào)控m6A甲基化水平，抑制豬脂肪沉積［20，35］。他們的研究中還發(fā)現(xiàn)了METTL3和FTO在豬脂肪細(xì)胞分化前期增加而中后期下降［35］，這與本研究的結(jié)果一致，暗示著METTL3和FTO也對(duì)牛的脂肪發(fā)育可能具有重要調(diào)控作用。與上述研究不同，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)METTL3正調(diào)控乳脂的合成［58］，還有其他研究發(fā)現(xiàn)METTL3通過(guò)提高靶基因的m6A水平介導(dǎo)其表達(dá)進(jìn)而正調(diào)控脂質(zhì)合成與代謝［19，59］。這些結(jié)果不同的研究表明了在不同物種中METTL3和FTO調(diào)控脂肪生成的作用和機(jī)制可能是復(fù)雜且存在差異的。此外，與我們的結(jié)果不同，有研究發(fā)現(xiàn)FTO在人皮下前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)下降［60］，而另一項(xiàng)研究卻發(fā)現(xiàn)FTO在人皮下脂肪細(xì)胞以及人脂肪細(xì)胞株（SGBS）分化中的表達(dá)無(wú)明顯變化［61］。造成這些不同結(jié)果的原因可能是動(dòng)物品種、細(xì)胞來(lái)源以及成脂誘導(dǎo)方法的不同導(dǎo)致的。另外3個(gè)基因——METTL14、WTAP和ALKBH5在牛前體脂肪細(xì)胞分化中表達(dá)模式基本一致，都是在分化中期顯著上升，而后維持高表達(dá)水平，這與脂滴的形成過(guò)程呈正相關(guān)，暗示其可能正向調(diào)控成脂分化。也有研究發(fā)現(xiàn)了METTL14促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化［30］和脂肪生成［18］。而關(guān)于WTAP和ALKBH5在脂肪生成中的研究較少。本研究揭示了METTL3、METTL14、WTAP、FTO和 ALKBH5在 牛脂肪發(fā)育和脂生成中可能發(fā)揮的潛在作用，后續(xù)還需進(jìn)一步的試驗(yàn)來(lái)探究并驗(yàn)證m6A甲基化修飾以及甲基化酶基因?qū)εＶ旧傻淖饔煤头肿訖C(jī)制。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14、WTAP，以及m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5，均在成年秦川肉牛體內(nèi)脂肪組織中的表達(dá)均顯著高于新生牛，在體外前體脂肪細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)也都有著明顯的差異表達(dá)，表明m6A修飾在牛脂肪發(fā)育中可能發(fā)揮重要作用且這5個(gè)m6A甲基化酶具有調(diào)控牛前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的潛在作用。