通脈舒絡(luò)膠囊對缺血性中風大鼠Th17細胞介導炎癥反應(yīng)的影響

王 逍，屈陽柳，胡雪純，程 穎，李 雨，賈 妮

(1.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712021；2.商洛市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 商洛 726000；3.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046)

中風是導致全世界60歲以上老年人死亡的第二大原因，是致殘的第一大原因[1]。中風分為缺血性和出血性兩類，出血性中風是由腦內(nèi)血管破裂引起[2]，而腦血管堵塞導致血流障礙引起缺血性中風，占中風病例的85%以上[3]，具有高致殘率、高病死率的特點。研究表明，免疫反應(yīng)誘導的缺血損傷后炎癥是缺血性中風進展過程中必不可少的一步，缺血損傷后24 h內(nèi)，激活了適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的輔助T細胞17(T helper cell 17，Th17)細胞介導的體液和炎癥效應(yīng)[4]。Th17細胞與其刺激釋放的其他促炎介質(zhì)一起造成了血腦屏障(BBB)破壞，故單核細胞、中性粒細胞、T細胞等全身炎癥細胞會透過BBB持續(xù)進入受損區(qū)域，加劇腦損傷[5]。

國醫(yī)大師張學文根據(jù)缺血性中風的發(fā)病機制及長期臨床實踐提出氣虛血瘀證是缺血性中風的常見證型[6]，其課題組經(jīng)過多年的研究和探索制訂了益氣養(yǎng)血、活血化瘀、通脈舒絡(luò)的治則，并在此基礎(chǔ)上，擬定了通脈舒絡(luò)方，由該方制成的通脈舒絡(luò)膠囊對治療氣虛血瘀所致缺血性中風取得了良好的治療效果。故本實驗擬通過研究通脈舒絡(luò)膠囊對缺血性中風大鼠Th17細胞介導的免疫炎癥反應(yīng)的影響，探討通脈舒絡(luò)膠囊是否通過影響神經(jīng)局部及外周免疫中Th17細胞亞群功能的失衡狀態(tài)，抑制促炎因子釋放，達到神經(jīng)保護作用，為缺血性腦卒中的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級成年雄性SD大鼠120只[合格證號SCXK(川)2020-030,成都達碩實驗動物有限公司]，體重220～280 g。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學中心實驗室動物房，自由攝食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本研究所有實驗方案及實驗手段均獲得陜西中醫(yī)藥大學倫理委員會批準。

1.1.2 實驗藥物：通脈舒絡(luò)膠囊(規(guī)格0.4 g/粒，批號20200321)；注射用青霉素鈉鹽80萬U(批號200409)；0.9% 氯化鈉注射液(100 ml/瓶，批號L116060801) 。

1.1.3 主要實驗試劑及儀器：2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(批號G3005-500ml，北京索萊寶)；Rat IL-17A ELISA Kit(批號70-EK317/3-96，杭州聯(lián)科)，RAT 維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(Retinoic acid recept-related orphan receptor γt,RORγt) Elsia kit(批號ml560717-96，上海酶聯(lián))，4%組織固定液(批號AR1068，武漢博士德)，伊紅染色液(批號G1100-500ml，北京索萊寶)，Cole蘇木素染色液(批號G1140-500ml，北京索萊寶)。石蠟切片機(型號R2235，德國徠卡)；生物組織自動脫水機(型號TC-120S+，德國徠卡)；自動恒溫烘片儀(型號TK-213，德國徠卡)；組織攤片、烤片機(型號TK-21811，德國徠卡)；冷凍臺、包埋機(型號TB-7188L，德國徠卡)；高速離心機(型號SH01D，上海知信)；酶標儀(型號Multiskan FC，Thermo公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物模型制備：采用大腦中動脈栓塞法[7]制備大鼠缺血性中風模型，采用TTC染色確定模型制備是否成功。缺血1 h后，取出插入的線栓，使缺血區(qū)再灌注，手術(shù)過程中及術(shù)后至麻醉清醒前利用取暖器維持動物體溫在正常范圍，并給予大鼠青霉素4萬U/只肌肉注射以預防感染。假手術(shù)組大鼠同上述操作方法，但僅分離血管，不插線栓。

1.2.2 實驗動物分組及給藥：成年雄性SD大鼠120只，體重220～280 g，隨機分為五組，包括假手術(shù)組、模型組、通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)中劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組，每組24只。通脈舒絡(luò)劑量組大鼠分別按照1 ml/100 g給予低、中、高濃度(0.032、0.064、0.128 g/ml)的通脈舒絡(luò)膠囊藥液灌胃，假手術(shù)組、模型組大鼠同樣以1 ml/100g濃度的0.9%氯化鈉溶液灌胃，各組大鼠均每天灌胃1次，且給予同樣喂養(yǎng)方法。各組分別于模型建立后1、3、7、14 d進行神經(jīng)功能缺損評分，每組每個時間點分配6只大鼠，評分結(jié)束后處死，取材。

1.2.3 取 材：各組大鼠于腦缺血再灌注1、3、7、14 d后分別進行神經(jīng)功能缺損評分并記錄。大鼠麻醉后摘除脾臟，用0.9%氯化鈉溶液進行心臟灌注，迅速取腦，分離出全腦，一部分全腦分離出雙側(cè)海馬置于2 ml離心管標記號后-80 ℃冰箱備用，一部分全腦冠狀位用刀片切厚度約2～2.5 mm，剔除腦干、小腦部分，分別標記好后置于組織固定液中備用；摘除的脾臟用預冷等滲鹽水沖凈，去除其表面筋膜后用濾紙吸水稱重后，切取一部分置于2 ml離心管標記好后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；剩余部分置?%多聚甲醛中固定。

1.2.4 梗塞灶TTC染色：大鼠麻醉后斷頭，迅速取出全腦，將腦組織置-20 ℃冰箱5～10 min后取出，置于新鮮冰塊上，切去額極1 mm，間隔2 mm作大腦連續(xù)冠狀切片，立即置于2%的TTC染液中，37 ℃水浴鍋避光孵育15～20 min。取出后可見正常腦組織呈紅色，梗塞區(qū)未被染色而呈白色。

1.2.5 神經(jīng)功能缺損評分：按照Longa 5分法對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分。0分為無神經(jīng)功能損傷癥狀及體征；1分為不能夠完全伸展左側(cè)前爪；2分為爬行時向左偏斜或轉(zhuǎn)圈，有追尾現(xiàn)象；3分為爬行時身體向左側(cè)傾倒；4分為不能夠自發(fā)爬行，意識喪失。根據(jù)評分結(jié)果，納入1～3分的大鼠進行后續(xù)實驗，若各組出現(xiàn)樣本量不足，及時給予缺失組及時間點等量補充。

1.2.6 HE染色：每個大鼠樣本隨機選取腦切片進行HE染色，首先脫蠟至水，再用蘇木素染色6 min，浸入分化液30 s后再用自來水浸泡15 min，然后用伊紅染色2 min，自來水浸泡2～5 min后再用5%乙醇脫水至透明，最后封片、采集圖像。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠腦及脾臟勻漿中RORγt、白介素17(Interleukin-17，IL-17)含量：將組織取出解凍后，加入PBS溶液用勻漿機勻漿；取出96孔板，分別加入100 μl稀釋好的標準品和稀釋好的樣品，37 ℃孵育90 min；吸干酶標板內(nèi)反應(yīng)液，加生物素標記抗體，37 ℃孵育60 min，1×洗滌緩沖液洗滌3次，每次浸泡1 min，加過氧化物酶標記的親和素(ABC)，37 ℃孵育30 min，1×洗滌緩沖液洗滌5次，每次浸泡90 s，加入底物(TMB)，37 ℃孵育避光孵育20 min，加終止液，輕柔混勻；根據(jù)酶標儀器操作方法，上機檢測OD值(450 nm處)，通過ELISA Cale軟件計算獲得所測物質(zhì)濃度。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠TTC染色結(jié)果 假手術(shù)組大鼠均未閉塞其大腦中動脈，故其TTC染色結(jié)果為明顯紅色，模型組及通脈舒絡(luò)各劑量組均行造模術(shù)，故其缺血區(qū)顯示為白色。

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 見表1。分別在再灌注1、3、7、14 d后進行神經(jīng)功能缺損評分。假手術(shù)組大鼠未閉塞大腦中動脈，故其神經(jīng)功能評分為0分。模型組神經(jīng)功能缺損評分與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在1 d時的神經(jīng)功能缺損評分中，通脈舒絡(luò)各劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。在3、7、14 d的神經(jīng)功能缺損評分中，通脈舒絡(luò)各劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；其中通脈舒絡(luò)中劑量組在各時間點的評分最低，與通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。

表1 各時間點各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(分)

2.3 各組大鼠缺血腦組織病理形態(tài)變化 各個時間點觀察到的假手術(shù)組大鼠腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，細胞排列層次分明，未見缺血或炎癥細胞損傷現(xiàn)象，細胞密度大，細胞核呈類圓形，核膜清晰，核仁明顯。

再灌注1 d時模型組及通脈舒絡(luò)各劑量組海馬CA1區(qū)表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)紊亂，呈現(xiàn)出區(qū)域性溶解、腫脹等壞死特征，空泡樣改變明顯，炎癥細胞浸潤現(xiàn)象明顯(圖1)。再灌注3 d時病理變化較1 d明顯，而通脈舒絡(luò)中劑量組的病理改變最少(圖2)。再灌注7 d時通脈舒絡(luò)各劑量組缺血海馬區(qū)正常神經(jīng)細胞數(shù)目明顯減少，核固縮、溶解，胞間可見大小不等空泡；再灌注14 d時通脈舒絡(luò)各劑量組海馬CA1區(qū)空泡數(shù)量驟增，壞死組織已被清除。再灌注7、14 d時，通脈舒絡(luò)各劑量組缺血區(qū)病理改變較模型組輕，炎癥細胞損傷現(xiàn)象有所緩解，細胞排列較整齊，間質(zhì)水腫程度減輕，細胞皺縮畸形、胞核固縮深染等表現(xiàn)明顯減輕，其中通脈舒絡(luò)中劑量組改善較為顯著(圖3、4)。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：通脈舒絡(luò)低劑量組；D：通脈舒絡(luò)中劑量組；E：通脈舒絡(luò)高劑量組圖1 各組大鼠再灌注1 d海馬CA1區(qū)病理學形態(tài)(HE染色，×400)

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：通脈舒絡(luò)低劑量組；D：通脈舒絡(luò)中劑量組；E：通脈舒絡(luò)高劑量組圖2 各組大鼠再灌注3 d海馬CA1區(qū)病理學形態(tài)(HE染色，×400)

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：通脈舒絡(luò)低劑量組；D：通脈舒絡(luò)中劑量組；E：通脈舒絡(luò)高劑量組圖3 各組大鼠再灌注7 d海馬CA1區(qū)病理學形態(tài)(HE染色，×400)

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：通脈舒絡(luò)低劑量組；D：通脈舒絡(luò)中劑量組；E：通脈舒絡(luò)高劑量組圖4 各組大鼠再灌注14 d海馬CA1區(qū)病理學形態(tài)(HE染色，×400)

2.4 各組大鼠海馬組織勻漿中RORγt、IL-17含量比較 見表2、3。各組大鼠造模后海馬組織RORγt、IL-17含量均高于假手術(shù)組，再灌注1 d時模型組、通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)中劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組海馬組織RORγt、IL-17含量均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。再灌注3 d時造模大鼠海馬組織RORγt、IL-17含量升至高峰。再灌注7、14 d模型組、通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)中劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組海馬組織RORγt、IL-17含量均有所下降，且通脈舒絡(luò)中劑量組大鼠海馬內(nèi)RORγt、IL-17含量最低，與通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。

表2 各組大鼠海馬組織RORγt含量比較(ng/ml)

表3 各組大鼠海馬組織IL-17含量比較(pg/ml)

2.5 各組大鼠脾臟組織勻漿中RORγt、IL-17含量比較 見表4、5。與假手術(shù)組比較，造模成功大鼠的脾臟RORγt、IL-17含量均較高。再灌注1、3、7、14 d模型組、通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)中劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組脾臟RORγt、IL-17含量均高于假手術(shù)組脾臟RORγt、IL-17含量(均P<0.01)；其中再灌注3 d時含量達高峰。通脈舒絡(luò)中劑量組大鼠脾臟中RORγt、IL-17含量最低，與通脈舒絡(luò)低劑量組、通脈舒絡(luò)高劑量組大鼠脾臟中RORγt、IL-17含量比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。

表4 各組大鼠脾臟組織RORγt含量比較(ng/ml)

表5 各組大鼠脾臟組織IL-17含量變化(pg/ml)

3 討 論

缺血性腦卒中屬于中醫(yī)學“中風”范疇，病位在腦，與氣血密切相關(guān)[8]。中醫(yī)認為氣血是大腦生長發(fā)育及功能活動的物質(zhì)基礎(chǔ)[9]，腦為元神之府，血液是神志活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，大腦必須通過氣血的溫煦、濡養(yǎng)，才能發(fā)揮正常的生理功能，所以缺血性中風的基本病機是氣血失調(diào)。清代醫(yī)家王清任創(chuàng)立“氣虛血瘀”理論，開益氣活血化瘀法治療中風病之先河，其創(chuàng)立的補陽還五湯，成為治療中風氣虛血瘀證的經(jīng)典名方[10]。國醫(yī)大師張學文認為因虛致瘀，瘀阻脈絡(luò)是中風發(fā)病的根本，瘀血貫穿中風之始終，并根據(jù)缺血性中風的發(fā)病機制及長期臨床實踐提出氣虛血瘀證是缺血性中風的常見證型[11-12]。其課題組經(jīng)過多年的研究和探索制訂了益氣養(yǎng)血、活血化瘀、通脈舒絡(luò)的治則，并在此基礎(chǔ)上，擬定了黃芪、丹參、赤芍、川芎、地龍、紅花、當歸、水蛭為成分的通脈舒絡(luò)方，由該方制成的通脈舒絡(luò)膠囊是陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院的協(xié)定處方制劑，在治療缺血性中風氣虛血瘀證中取得了較好療效。中醫(yī)理論認為氣行則血行，氣滯則血瘀，方中用大劑量黃芪補中益氣，為君藥；丹參活血祛瘀，赤芍清熱涼血、散瘀止痛，川芎活血行氣、祛風止痛，地龍清熱、通絡(luò)，水蛭破血通經(jīng)、逐瘀消癥，紅花活血化瘀，通脈舒絡(luò)共為臣藥；佐以當歸補血活血，改善缺血性中風血虛癥狀；全方共奏益氣養(yǎng)血、活血化瘀、通脈舒絡(luò)之功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，黃芪主要成分黃芪甲苷[13]、丹參提取物丹酚酸A[14-15]、當歸[16-17]等的有效成分對機體有抗炎、抗氧化、抗興奮性毒性和免疫調(diào)節(jié)作用，可活化T淋巴細胞，加速脾細胞分裂，使T細胞功能增強。

T淋巴細胞通過參與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)影響缺血性卒中發(fā)生，具有調(diào)節(jié)免疫的作用，可分為CD8+細胞毒性T細胞和CD4+輔助性T(Th)細胞，其中Th17主要通過表達促炎細胞因子來介導腦缺血后炎癥反應(yīng)[18]。Th17細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子是RORγt，可誘導和編碼IL-17A和IL-17F的基因表達。Th17通過產(chǎn)生多種細胞因子發(fā)揮作用，IL-17是其最重要的效應(yīng)因子。張立堂等[19]研究表明，急性腦梗死患者外周血中Th17細胞及IL-17水平均高于正常，說明Th17細胞可能參與腦梗死的發(fā)病過程。劉貴香等[20]發(fā)現(xiàn)腦梗死患者外周血中存在 IL-17A、IL-23、 IL-6、RORγt、Th17 的增高，說明Th17細胞參與了缺血性腦卒中的病理生理過程。脾臟作為主要的外周免疫器官，在腦缺血誘導的免疫反應(yīng)中也起著重要作用[21]。

本研究中以通脈舒絡(luò)膠囊為給藥組，觀察大鼠神經(jīng)功能缺損評分變化、腦組織病理改變，并檢測腦、脾臟RORγt、IL-17指標含量的變化。通脈舒絡(luò)膠囊治療3 d以后，各給藥組大鼠神經(jīng)功能缺損評分較模型組開始降低，其中通脈舒絡(luò)中劑量組評分降低最為明顯，說明通脈舒絡(luò)膠囊可以減緩缺血性中風大鼠神經(jīng)功能缺損程度，具有神經(jīng)保護作用。缺血性腦卒中后，腦組織內(nèi)的神經(jīng)細胞逐步發(fā)生變性、壞死、腫脹及溶解，最終導致腦組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)破壞。給藥7 d后，各劑量組腦組織缺血區(qū)病理改變較模型組減輕，炎癥細胞損傷現(xiàn)象有所緩解，細胞排列較整齊，間質(zhì)水腫程度減輕，細胞皺縮畸形、胞核固縮深染等表現(xiàn)明顯減輕。由此可知，通脈舒絡(luò)膠囊能改善缺血腦組織神經(jīng)細胞的炎性損傷。模型組腦及脾臟RORγt、IL-17含量在造模后逐漸升高，于3 d后達到頂峰，7、14 d的含量較假手術(shù)組仍有升高，說明Th17不僅參與了缺血性腦卒中發(fā)展過程，且隨著再灌注時間延長Th17比例也在發(fā)生變化，腦缺血損傷的同時，局部及外周免疫炎癥反應(yīng)也被激活，而當給予通脈舒絡(luò)膠囊治療后，各時間點缺血大鼠腦及脾臟內(nèi)RORγt、IL-17含量較模型組降低，其中通脈舒絡(luò)中劑量組改變最為明顯，進一步說明通脈舒絡(luò)膠囊能降低大鼠缺血腦組織局部及外周免疫器官脾臟內(nèi)的Th17細胞比例，改善缺血性腦卒中引起的Th17細胞亞群功能的失衡狀態(tài)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，通脈舒絡(luò)膠囊通過抑制腦缺血后局部及外周的炎癥反應(yīng)，抑制炎癥細胞因子產(chǎn)生，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究旨在探究Th17細胞在缺血性中風發(fā)展過程中的變化，但實驗觀察的時間點不夠細化，在接下來的研究中擬增加更多的時間點，并進行通脈舒絡(luò)膠囊對抗炎因子影響的觀察。