杞明眼保膠囊質量標準提升研究

劉文煒 龍?zhí)烀?白維薇

1.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；2.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002

杞明眼保膠囊由丹參、墨旱蓮、決明子等十五味中藥制成，內容物為黃棕色的粉末，味微苦。具有清肝養(yǎng)肝、滋腎明目的功效，能促進視網(wǎng)膜的修復，對近視[1]、視疲勞、眼底血管病變、眼底視網(wǎng)膜病變有很好的療效[2]。對其質量標準進行提升，使得用藥安全、有效。在中醫(yī)學理論中，人體是一個有機的整體，無論在結構上還是在功能上，機體內部臟腑與形體官竅之間，都是相互聯(lián)系且不可分割的[3-4]?！吨T病源候論》曰 ： “ 勞傷臟腑，肝氣不足，兼受風邪，是精華之氣衰弱，故不能遠視?！薄秾徱暚幒吩唬?“ 肝經(jīng)不足腎經(jīng)病，光華咫尺視模糊?！?肝腎兩虛，或過用目力，耗氣傷血均可致目中神光不能發(fā)越于遠處，故見近視。

杞明眼保膠囊中的墨旱蓮屬于補虛藥[5]。臨床用于肝腎陰虛，牙齒松動，虛發(fā)早白，眩暈耳鳴[6]。中醫(yī)中辨證論治，近視屬于肝腎兩虧證，可滋補肝腎以治療，墨旱蓮主入肝腎，善能滋補肝腎之陰，可與女貞子同用[7]。女貞子(補虛藥)，甘、苦、涼，歸肝、腎經(jīng)，具補肝腎陰、退虛熱、明目的功效,用于肝腎陰虛證、陰虛內熱證、目疾。女貞子中的大量成分屬于三萜類，其中含量最高的是齊墩果酸，市場上齊墩果酸的主要來源也來自于女貞子[8]。丹參屬活血化瘀藥，苦、微寒，歸心、肝經(jīng)，有活血祛瘀、涼血消癰、除煩安神、調經(jīng)止帶[9]的功效,用于瘀血證、瘡瘍癰腫、熱入營血心煩不眠。

1 儀器與材料

1.1 儀器 JY20002天平(上海良平儀器儀表有限公司)，2F-2三用紫外分析儀(上海市安亭電子儀器廠)，KQ-500DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)，Waters E 2695 高效液相色譜儀(美國waters公司)，MS105DU十萬分之一分析天平(梅特勒托利多儀器上海有限公司)。

1.2 材料 石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、甲酸、氯仿、苯、正己烷、丙酮皆為國產(chǎn)分析純；丹酚酸B對照品(批號： 111562-200504)，乙腈(色譜純)。

2 方法與結果

2.1 墨旱蓮藥材的TLC鑒別 取3個批次的杞明眼保寶膠囊內容物，研細，各取5 g，加甲醇30 mL超聲(功率140 w，頻率42 KHz )處理30 min，放冷，過濾，濾液水浴揮干，殘渣加0.1%鹽酸溶液2 mL超聲使溶解完全，轉移至具塞試管中，加1 mL乙酸乙酯充分振搖，靜至分層，取乙酸乙酯層為供試品。另取缺墨旱蓮陰性樣品，照供試品制備方法即得缺墨旱蓮陰性樣品。另取墨旱蓮對照藥材0.3 g于具塞試管，加甲醇1 mL超聲處理30 min，上清液即為對照藥材溶液。按照2015 年版《中國藥典》(四部)中 TLC 法[9]，吸取上述溶液 5～8μL，分別點于同一硅膠 G 薄層板上，以展開劑氯仿∶丙酮∶乙酸乙酯∶甲酸(10∶2∶2∶0.5),展開，取出，晾干，于紫外燈365 nm下檢視，供試品和墨旱蓮對照藥材相應位置處顯相同的熒光斑點，且陰性樣品無干擾。如圖1所示。

1.缺墨旱蓮陰性；2.杞明眼保膠囊供試品(20181101)；3.杞明眼保膠囊供試品(20181102)；4.杞明眼保膠囊供試品(20181103)；5.墨旱蓮對照藥材圖1 墨旱蓮TLC圖譜

2.2 丹參藥材的TLC鑒別 取3個批次的杞明眼保寶膠囊內容物，研細，各取1 g，加甲醇30 mL超聲(功率140 w，頻率42 KHz )處理30 min，放冷，過濾，濾液水浴揮干，殘渣加0.1%鹽酸溶液2 mL超聲使溶解完全，轉移至具塞試管中，加1 mL乙酸乙酯充分振搖，靜至分層，取乙酸乙酯層為供試品。另取缺丹參陰性樣品，照供試品制備方法即得缺丹參陰性樣品。另取丹參對照藥材0.1 g于具塞試管，加甲醇1 mL超聲處理30 min，上清液即為對照藥材溶液。以展開劑氯仿∶丙酮∶乙酸乙酯∶甲酸(10∶7∶5∶1),展開，取出，晾干，于氨蒸汽缸中顯色5 min，立即紫外燈365 nm檢視，供試品和對照藥材相應位置處顯相同的熒光斑點，且陰性樣品無干擾。如圖2所示。

注： 1.缺丹參陰性；2.杞明眼保膠囊供試品(20181101)；3.杞明眼保膠囊供試品(20181102)；4.杞明眼保膠囊供試品(20181103)；5.丹參對照藥材圖2 丹參TLC圖譜

2.3 丹參藥材中丹酚酸B的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱： Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相： 0.03 moL/L磷酸二氫鉀-乙腈(70∶30)；流速： 1.0 mL·min-1，檢測波長： 364 nm，柱溫： 20 ℃，進樣量20 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 稱取丹酚酸B對照品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇-水(8∶2)溶液溶解并定容至刻度，制成748 μg/mL溶液，精密吸取1 mL于5 mL量瓶內，加甲醇-水(8∶2)定容至刻度，即得149.6 μg/mL的對照品溶液。分別制備不同濃度的丹酚酸B對照品溶液37.4 μg/mL、4.8 μg/mL、149.6 μg/mL、299.2 μg/mL、374.0 μg/mL。

2.3.3 供試品溶液的制備 取杞明眼保膠囊內容物，研細，取約0.2 g，精密稱定，置具塞瓶內，精密加入甲醇-水(8∶2)溶液20 mL，稱定重量，超聲(功率140 w，頻率42 KHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇-水(8∶2)補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得供試品溶液。

2.3.4 陰性樣品溶液的制備 取處方量的1/10，按照杞明眼保膠囊處方工藝，制備缺丹參藥材的陰性樣品，再按照“ 2.3.3”項下方法制成陰性樣品溶液。

2.3.5 專屬性考察 分別取對照品溶液(149.6 μg/mL)、供試品溶液(批號： 20181101)和陰性樣品溶液，按照“ 2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，陰性樣品對丹酚酸B的含量測定無干擾，理論板數(shù)按丹酚酸B峰計不低于3000。如圖3所示。

圖3 高效液相色譜圖

2.3.6 線性關系考察 精密吸取“ 2.3.2”項下的系列對照品溶液，按照“ 2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。各樣品平行進樣2次。以峰面積的平均值為縱坐標(y)、進樣量為橫坐標(x，ng)進行回歸分析，得回歸方程為y=4945.8x- 39483。結果顯示，丹酚酸B檢測進樣量的線性范圍為37.4～374.0 μg/mL，相關系數(shù)r=0.9999。

2.3.7 精密度試驗 分別精密吸取質量濃度為149.6 μg/mL的對照品溶液，按照“ 2.3.1”項下色譜條件重復測定峰面積6次。結果，峰面積的 RSD為0.55%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.3.8 重復性試驗 精密稱取杞明眼保膠囊0.2g(批號： 20181101)，共 6 份，按照“ 2.3.3”項下方法制成供試品溶液，再按照“ 2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量。結果，丹酚酸B的平均含量為 3.6690mg/g，RSD 為 1.17%(n=6)，表明該方法的重復性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗 取“ 2.3.8”項下的供試品溶液(批號： 20181101)，分別于室溫下放置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h時按照“ 2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，丹酚酸B峰面積的RSD為0.46%(n=5)，表明該溶液在8 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗 精密稱取杞明眼保膠囊粉末0.2 g(批號： 20181101)，共6份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入丹酚酸B對照品(90.3 μg/mL)25 mL，然后按照“ 2.3.3”項下方法制成供試品溶液，再按照“ 2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

2.3.11 含量限度 精密稱取批號為20181101-20181110的杞明眼保膠囊0.2g，共20份(每個批次2份)，按照“ 2.3.3”項下方法制成供試品溶液，再按照“ 2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量。再按照2015年版藥典丹參藥材項下丹酚酸B的含量測定方法，測定丹參藥材的含量，計算平均轉移率為44.73%，得出杞明眼保膠囊中丹酚酸B含量限度為4.3452 mg/g，即每粒(一個處方量制成1000粒膠囊，0.4 g/粒，)含丹參以丹酚酸B(C36H30O16)計不得少于1.74 mg。

3 討論

3.1 TLC鑒別條件的選擇 提取方法的選擇： 選用過甲醇、乙醇、乙酸乙酯為溶劑直接進行提取，斑點復雜，無法分離，最后采用醇提，再用水溶后萃取的方式，斑點清晰，雜質較少。

展開劑的選擇： 曾選用苯-正己烷-石油醚(60-90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸=2.5∶2.5∶1∶3.5∶1，苯-正己烷-石油醚(60-90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸=2.5∶2.5∶1∶3.5∶1，氯仿-丙酮-乙酸乙酯-甲酸=10∶2∶2∶0.5等展開劑，最終確定墨旱蓮開展劑為氯仿-丙酮-乙酸乙酯-甲酸=10∶2∶2∶0.5，丹參展開劑為氯仿-丙酮-乙酸乙酯-甲酸=10∶7∶5∶1。

3.2 丹酚酸B的限度確定 丹參中丹酚酸B是水溶性成分[10]，按2015版《中國藥典》規(guī)定，干燥丹參中丹酚酸B的含量不得少于3.0%。丹酚酸B為一分子咖啡酸與三分子丹參素縮合而成，是丹參中含量最高的酚酸類成分[11]，有抗脂質過氧化、消除自由基和抗血栓的作用[12]。本品采用藥典條件進行丹酚酸B的含量測定條件。

分別收集了10個不同產(chǎn)地和批次的丹參藥材，分別按照工藝方法制備成10個批次的杞明眼保膠囊，在測定含量，計算平均轉移率，在初步計算含量限度，后期會進一步探索研究更多批次樣品的含量測定，從而保證限度制定的合理性。

本研究成功建立了杞明眼保膠囊中墨旱蓮、丹參藥材的鑒別方法和丹參藥材中丹酚酸B的含量測定方法。該品含丹參以丹酚酸B(C36H30O16)計不得少于1.74 mg/粒。

本研究建立了杞明眼保膠囊中丹參、墨旱蓮的TLC鑒別方法，并對所建方法進行了較全面的方法學考察，同時也對杞明眼保膠囊中丹酚酸B的含量測定進行了研究，為本品的質量標準提升提供了依據(jù)，有利于本品的質量控制。