植物中滯綠基因的研究進(jìn)展

郭 恒 葉廣繼 納添倉 王 艦 周 云 *

（1青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海西寧 810016；2青藏高原生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016）

顏色的變化通常為判斷果實(shí)成熟的標(biāo)準(zhǔn)，綠色植物衰老和果實(shí)成熟的顯著標(biāo)志是葉綠素降解和葉綠體轉(zhuǎn)化為色質(zhì)體。然而，有些植株在生長(zhǎng)末期還保持原有的綠色，未出現(xiàn)黃化或者出現(xiàn)很少的黃化現(xiàn)象，這是由于葉綠素降解很少。這種葉片或果實(shí)在成熟期仍然保持綠色的現(xiàn)象稱之為“滯綠”[1]。滯綠蛋白（stay-green proteins，SGR）作為核基因編碼葉綠體的靶蛋白，結(jié)構(gòu)高度保守，其表達(dá)在葉綠素降解和器官衰老方面至關(guān)重要[2]。到目前為止，很多研究人員已經(jīng)在多種植物中發(fā)現(xiàn)了滯綠突變體，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）[3]、水稻（Oryza sativa）[4]、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）[5]、草甸羊茅（Festuca pratensis）[6]、高粱（Sorghum bicolor）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、番茄（Solanum lycopersicum）[7-8]、辣椒（Capsicum annuum）[9]、 煙 草 （Nicotiana tabacum）、 香 蕉 （Musa AAA group）[10-11]、大豆（Glycine max）[12]等。Thomas等[13]通過葉綠素含量和光合速率的變化，將滯綠突變分為5種類型。延遲葉片衰老時(shí)間的A型，如玉米突變體fs855[13]；減緩葉綠素降解速率的B型，如高粱突變體R16[14]；抑制葉綠素降解的C型，如番茄gf突變體；受到自然或非自然影響后植物組織遭到破壞而葉綠素不發(fā)生降解的D型，如風(fēng)干的標(biāo)本及有病蟲害的農(nóng)作物；植物雖然衰老但是葉綠素還能保持很長(zhǎng)時(shí)間的E型。以上5種類型可以分為兩類，A型和B型屬于功能型滯綠突變，它們?cè)谒ダ蠒r(shí)期葉綠素未發(fā)生降解，葉片保持綠色，能進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的光合作用，因而被認(rèn)為有可能提高作物產(chǎn)量；C型、D型和E型屬于非功能型滯綠突變，它們?cè)诰S持滯綠性狀的同時(shí)，光合能力的下降速率和野生型相同，只是葉綠素降解受到影響。除了D型是由于外界刺激造成的以外，其他4種都有可能與其內(nèi)源性基因調(diào)控有關(guān)。

在水稻滯綠突變體中分離出NYC1和NYC1-LIKE蛋白后[15-16]，在其他突變體中分離出了葉綠素降解的相關(guān)基因[16-20]。葉綠素降解途徑被阻斷或者抑制，使得葉綠素降解途徑不能繼續(xù)而發(fā)生滯綠。此外，部分茄科植物已經(jīng)成功克隆分離了SGR基因，并且在實(shí)踐生產(chǎn)中應(yīng)用良好，但是在馬鈴薯中對(duì)于SGR的研究還較少。本文主要梳理和總結(jié)近年來SGR基因的研究進(jìn)展，探討SGR在馬鈴薯上的應(yīng)用前景和未來發(fā)展。

1 植物滯綠突變

植物的成熟、衰老是自然界中的普遍規(guī)律，葉綠素是植物光合作用的重要工具，其降解受到抑制后，葉片、種子等器官會(huì)出現(xiàn)滯綠現(xiàn)象。孟德爾經(jīng)典實(shí)驗(yàn)中把控制豌豆子葉顏色（黃色/綠色）的位點(diǎn)命名為I，該位點(diǎn)突變后不僅在種子成熟過程中子葉保持綠色，在衰老過程中葉片也保持綠色。1962年，Steinbuch等提出，蠶豆的持綠性對(duì)其成熟的程度和多樣性有作用，進(jìn)而影響蠶豆最終產(chǎn)量、等級(jí)和品質(zhì)。隨著對(duì)滯綠性狀的研究，滯綠性也成為評(píng)價(jià)玉米產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)的重要指標(biāo)和商業(yè)營(yíng)銷手段。Robson等[21]將玉米衰老增強(qiáng)啟動(dòng)子和IPT基因（IPT基因編碼細(xì)胞分裂素合成的一個(gè)限速酶）轉(zhuǎn)入玉米中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在衰老期合成大量細(xì)胞分裂素而表現(xiàn)出常綠性狀。同時(shí)，將來源于擬南芥的衰老特異啟動(dòng)子SAG12和IPT基因連接，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草也能觀察到滯綠現(xiàn)象[22]。通過RNA干擾技術(shù)將擬南芥SGR基因沉默后，擬南芥植株會(huì)出現(xiàn)不同程度的滯綠現(xiàn)象。此外，在水稻、高粱等多種植物中均發(fā)現(xiàn)了葉片滯綠突變體[6]，在番茄、大豆等植物中也同時(shí)發(fā)現(xiàn)了果實(shí)和種子表現(xiàn)滯綠性狀的突變體。這些突變體在葉片衰老期或果實(shí)、種子成熟過程中仍然保留著較多的葉綠素，使器官呈現(xiàn)出區(qū)別于野生型的顏色。

目前，對(duì)于植物滯綠的研究主要圍繞著葉綠素新陳代謝路徑和其相關(guān)基因?qū)τ谥参餃G性的影響、葉片發(fā)育過程中光合作用和氮元素轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于葉片滯綠性的影響以及逆境條件對(duì)于植物滯綠性狀的影響等。影響植物滯綠性的因素很多，其中外因主要包括光周期現(xiàn)象、各種環(huán)境脅迫等，內(nèi)因主要包括生理上滯綠現(xiàn)象和葉綠素的合成降解、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、植物激素調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子及microRNA調(diào)控等。滯綠突變體的形成原因是多方面的，外界特定環(huán)境的影響是一個(gè)不可忽視的因素，但表型不能遺傳，所以對(duì)植物本身可遺傳因素的研究更加重要。一方面，葉綠素降解代謝過程是由多個(gè)酶促反應(yīng)完成的，代謝途徑中任何一種酶的活性受到抑制或相關(guān)基因發(fā)生變異，都會(huì)引起葉綠素降解受阻而出現(xiàn)滯綠現(xiàn)象。例如，在草甸羊茅滯綠突變體中，脫鎂葉綠素a加氧酶PAO的活性顯著低于野生型，被認(rèn)為是其表現(xiàn)滯綠性狀的主要原因。另外，PAO酶活性減弱也已被證明是多數(shù)C型突變體（如豌豆、菜豆等）滯綠的關(guān)鍵因素。除PAO以外，葉綠素b還原酶、羥甲基葉綠素a還原酶活性降低或缺失也會(huì)導(dǎo)致葉綠素降解受阻引起滯綠[23-24]。另一方面，Efrati等[25]在研究中發(fā)現(xiàn)辣椒cl滯綠突變體和番茄gf滯綠突變體，2個(gè)同源基因突變可能是二者滯綠表型形成的原因；進(jìn)一步分析認(rèn)為，突變基因并非葉綠素降解代謝途徑中關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)基因，而可能是調(diào)控基因。Kerr通過對(duì)番茄滯綠突變體gf遺傳連鎖關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，滯綠性狀是由單一隱性核基因控制，該基因被定位于番茄的第8號(hào)染色體上。通過分析大豆的雜交后代，確定了大豆種子滯綠的4個(gè)突變位點(diǎn)D1、D2、G和cytG，其中：隱性遺傳基因D1和D2雙基因突變會(huì)導(dǎo)致種子滯綠；D1和G連鎖突變則會(huì)引起種皮滯綠；cytG是細(xì)胞質(zhì)遺傳基因位點(diǎn)，該基因位點(diǎn)突變會(huì)使大豆衰老葉片的葉綠素含量穩(wěn)定，不易轉(zhuǎn)化為葉綠素a，阻礙葉綠素降解代謝的發(fā)生。

2 植物滯綠相關(guān)基因

SGR基因是葉綠素降解調(diào)控研究中的一個(gè)里程碑，在葉綠素降解的最初階段表達(dá)，調(diào)節(jié)與衰老相關(guān)的色素降解。葉綠素降解早期反應(yīng)過程主要是在由NYC/NOL和HCAR基因的產(chǎn)物催化下葉綠素b通過兩步酶還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化為葉綠素a，這些基因的突變會(huì)造成出現(xiàn)修飾性的滯綠。然而，在擬南芥中SGR、NYC1、PPH和ACD2等基因都是通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)?？傊琒GR基因可通過調(diào)控葉綠素降解與合成相關(guān)基因在葉綠素合成和降解代謝途徑中的表達(dá)，從而控制葉片滯綠表型。

目前，已在多種植物中鑒定得到NYE1的直系同源基因，如NYC1、CRN1、NYC3等基因在植物體內(nèi)高度保守，當(dāng)植物成熟和衰老時(shí)這些基因發(fā)生表達(dá)導(dǎo)致葉片或果實(shí)滯綠的表型特征，研究者們將這些基因統(tǒng)稱為衰老誘導(dǎo)的葉綠體滯綠相關(guān)蛋白基因。自擬南芥基因組測(cè)序完成之后，人們通過快中子誘變突變體篩選得到一個(gè)滯綠突變體nye1-1，并通過圖位克隆獲得了一個(gè)葉綠素降解代謝的關(guān)鍵調(diào)控基因NYE1。從2006到2007年，至少5個(gè)獨(dú)立的研究小組在不同物種中成功鑒定到NYE1的直系同源基因。通過基因滲入法，將bf993的y基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到黑麥草屬物種中[26]，利用圖位克隆技術(shù)，y基因位點(diǎn)首先被粗定到5號(hào)染色體中一個(gè)10 cM遺傳距離區(qū)域。通過對(duì)TIGR數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，該遺傳區(qū)域包含30個(gè)基因，其中一個(gè)基因Os09g36200和擬南芥衰老相關(guān)基因At4g22920高度同源。分析2個(gè)不同的水稻sgr突變體和擬南芥nye1-1突變體后發(fā)現(xiàn)，造成這些突變體滯綠表型的是同一個(gè)基因。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，有更多滯綠突變體的遺傳缺失都是由這個(gè)滯綠基因（NYE1/SGR）失活造成的。

滯綠基因主要來源于非功能滯綠突變體，作為葉綠素分解的啟動(dòng)因素，主要調(diào)控PsⅡ捕光-葉綠素（LHCⅡ-Chl）復(fù)合體的拆卸。滯綠基因如果缺失會(huì)造成在衰老過程中葉綠素降解受到抑制，但是葉綠體類囊體膜和葉綠素蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)保持完整，光合能力也隨之下降。目前，關(guān)于SGR基因調(diào)控葉綠素降解的作用機(jī)制研究仍處于起步階段。對(duì)于衰老葉片和成熟種子或果實(shí)中葉綠素的降解，有研究認(rèn)為，SGR1/NYE1可以與光捕獲復(fù)合物Ⅱ （LHCⅡ）結(jié)合，制約了sgr突變體中葉綠素和LHC蛋白的降解。此外，SGR1/NYE1蛋白也可與葉綠素降解關(guān)鍵酶CCEs形成互作關(guān)系。對(duì)于種子成熟過程中的葉綠素降解，最新研究發(fā)現(xiàn)，ABI3通過與SGR1/NYE1和SGR2/NYE2的啟動(dòng)子結(jié)合正向調(diào)控基因表達(dá)，從而促進(jìn)種子成熟過程中葉綠素的降解[27-28]。

SGR基因家族中的突變已經(jīng)被指定為C型滯綠突變體，其缺乏葉綠素分解能力，但具有其他正常的衰老模式。C型滯綠突變體的一個(gè)特征是光捕獲葉綠素結(jié)合蛋白（LHCP）在葉和果實(shí)中持續(xù)，而其他衰老過程如正常一樣繼續(xù)，這表明色素蛋白復(fù)合物的去穩(wěn)定化是葉綠素降解所必需的。水稻SGR已被證明在體內(nèi)和體外結(jié)合LHCPⅡ蛋白，這表明它可能會(huì)使色素-蛋白相互作用不穩(wěn)定，因而允許蛋白酶和分解代謝酶的作用分別降解LHCP和葉綠素。在SGR中，單個(gè)氨基酸取代的可用性將有助于更詳細(xì)地研究該蛋白的結(jié)構(gòu)功能。導(dǎo)致強(qiáng)表型效應(yīng)的4個(gè)氨基酸的取代現(xiàn)已在水稻、番茄和辣椒中的SGR直系同源物中鑒定。這些取代中，3個(gè)發(fā)生在跨物種邊界的所有SGR家族成員內(nèi)不變的氨基酸殘基中，第4個(gè)SGR V99M發(fā)生在以大約相等的頻率表征Val或Ile的殘基處。水稻SGR中的V99M替代不破壞與LHCPⅡ的結(jié)合，表明該氨基酸對(duì)于SGR功能的一些其他方面可能是重要的，例如未知的催化活性或三級(jí)結(jié)構(gòu)[29]。在水稻和擬南芥中，SGR的過表達(dá)產(chǎn)生了具有蒼白表型的葉或組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)移后死亡的植物。擬南芥NYE1（At4g22920）的低水平過表達(dá)導(dǎo)致正常植物表型，而高水平表達(dá)導(dǎo)致葉片黃化，表明NYE1/SGR表達(dá)水平與葉綠素?fù)p失之間存在直接相關(guān)性。SGR基因在其他高等綠色植物中也相繼被克隆出來，研究表明：SGR基因由核基因編碼，翻譯261～269個(gè)氨基酸；SGR蛋白都包含一個(gè)高度保守的C末端結(jié)構(gòu)域（C-X3-C-X-C2-F-P-X5-P），這段保守結(jié)構(gòu)域被從SGR蛋白高度保守的核心區(qū)分隔開，位于相似性較低的區(qū)域[30]；在N-端通常含有一個(gè)葉綠體的信號(hào)肽，其常在衰老誘導(dǎo)條件下完成特異表達(dá)，但它們?nèi)绾伟l(fā)揮功能調(diào)控葉綠素的降解，目前還不清楚。

3 SGR的功能

歷史上，SGR的缺陷與減少的PAO活性或表達(dá)相關(guān)。被歸因于SGR的許多滯綠突變體表現(xiàn)出低水平的PAO活性，而其他分解代謝酶（特別是葉綠素酶和RCCR）的活性不受影響。PAO最近的分子克隆和PAO抗體的可用性允許詳細(xì)分析滯綠突變體中PAO表達(dá)和蛋白質(zhì)豐度。PAO活性的差異與用于測(cè)定的提取物中的PAO豐度相關(guān)，表明突變體和野生型之間的差異是僅由PAO的不均等效提取引起的假象。

SGR突變體的共同特征是在衰老過程中保留光合器官的葉綠素結(jié)合蛋白。特別地，LHCⅡ亞基在迄今為止分析的所有SGR缺陷型突變體中高度穩(wěn)定。歷史上，這已經(jīng)通過與同時(shí)保留的葉綠素的連接來解釋，即認(rèn)為有缺陷的葉綠素降解在SGR突變體中被認(rèn)為是葉綠素結(jié)合蛋白降解的前提條件。bf993顯示累積了一個(gè)沒有其N末端基質(zhì)區(qū)域的LHCⅡ亞基的特定蛋白水解片段。這進(jìn)一步指出了對(duì)LHC蛋白完全降解的葉綠素降解要求。

但是，這種觀點(diǎn)可能是錯(cuò)誤的。如上所述，迄今分析的PAO和所有其他分解代謝酶在SGR突變體中不受影響。SGR蛋白的鑒定并不表示可能的功能，因?yàn)镾GR不包含任何已知的結(jié)構(gòu)域。此外，葉綠素分解代謝步驟的酶活性，如葉綠素酶去飽和[30-31]不能歸因于SGRs。從葉綠素蛋白復(fù)合物中提取葉綠素并與載體蛋白結(jié)合被認(rèn)為是適當(dāng)?shù)娜~綠素和（可能）脫蛋白降解的要求。然而，與已知的葉綠素結(jié)合蛋白相比，水溶性葉綠素結(jié)合蛋白、SGR在體外不能結(jié)合葉綠素。因此，假設(shè)SGR根本不是酶，這是合理的。最近的共免疫沉淀試驗(yàn)表明，OsSGR能夠在體內(nèi)特異性結(jié)合LHCⅡ亞基，但不與LHCⅠ亞基或葉綠素結(jié)合的核心復(fù)合物亞基（如D1）相互作用。這種結(jié)合也發(fā)生在OsSGR的V99M突變中，表明突變不影響結(jié)合。有人提出突變可能影響（未知）酶活性或可能破壞其他調(diào)節(jié)因子的結(jié)合，需要對(duì)其他SGR點(diǎn)突變進(jìn)行功能分析來證實(shí)這一點(diǎn)。

總之，SGRs可能是參與LHCⅡ拆解的蛋白質(zhì)因子的候選者，SGR在衰老過程中不間斷地使葉綠素保持在穩(wěn)定的脫輔基蛋白內(nèi)。在這方面，SGR表達(dá)將是葉綠素分解的先決條件，但不是分解代謝因子本身。在NYC1和NOL突變體中，還保留了葉綠素和葉綠素結(jié)合蛋白。因此，似乎可能的是，2個(gè)因子同樣重要，以誘導(dǎo)葉綠素蛋白復(fù)合物的不穩(wěn)定性。此外，在PAO突變體衰老過程中，AtSGR1的mRNA水平降低，表明存在反饋機(jī)制。這種調(diào)節(jié)機(jī)制可以被看作是安全控制，以確保葉綠素降解僅在葉綠素分解代謝過程中才會(huì)發(fā)生。因此，除了分解代謝酶活性或表達(dá)的調(diào)節(jié)之外，通過SGR調(diào)節(jié)載脂蛋白拆解可以被認(rèn)為是啟動(dòng)葉綠素分解所需的主開關(guān)。

4 茄科植物滯綠機(jī)理及其作用

人們長(zhǎng)期研究的茄科植物有馬鈴薯、辣椒、番茄、煙草等。其中，煙草和番茄作為茄科植物的模式植物被深入研究。番茄和辣椒的綠色果肉（gf）和葉綠素保留（cl）的突變分別是在成熟期間抑制其降解葉綠素的能力，葉綠素和類胡蘿卜素累積導(dǎo)致產(chǎn)生成熟果實(shí)，在顏色上變?yōu)樽厣f和cl的表達(dá)在果實(shí)成熟開始時(shí)被高度誘導(dǎo)，與葉綠素的下降相關(guān)。由于番茄紅素的積累和缺乏葉綠素降解，果實(shí)和葉片變?yōu)樽厣由先~綠素的保留，類囊體顆粒、LHCP、Rubisco小亞基和33 kD氧化轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)也在突變果實(shí)和葉片中繼續(xù)存在（圖1）。因此，gf被分類為番茄的C型滯綠突變體。隨著對(duì)gf和cl基因的不斷研究，已在水稻中發(fā)現(xiàn)gf基因的點(diǎn)突變，導(dǎo)致水稻的SGR番茄同系物中一個(gè)不變殘基的氨基酸被取代。同樣也發(fā)現(xiàn)，cl的突變也在SGR的辣椒同系物中有不變殘基的氨基酸的取代。同時(shí)，在草甸羊茅、豌豆、水稻和擬南芥中也鑒定出C型突變體降低了葉綠體中的PAO活性和色素蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定性[31]。最新研究得出，這些基因可能編碼新的葉綠體靶向蛋白，促進(jìn)葉綠素在類囊體膜中色素蛋白復(fù)合物的不穩(wěn)定性降解。gf和cl突變基因的分子基礎(chǔ)研究為番茄和辣椒的商業(yè)育種提供了早期選擇性狀的重要依據(jù)。

5 展望

馬鈴薯是僅次于水稻、小麥、玉米的第四大糧食作物，全球種植面積約為1 870萬～1 920萬hm2，總產(chǎn)量為3.2億～3.4億t[32]。我國馬鈴薯種植面積與產(chǎn)量均居世界第一，且產(chǎn)量達(dá)到世界的20%左右[33]，提高單產(chǎn)是我國馬鈴薯育種的主要目標(biāo)。馬鈴薯在育種過程中主要采用常規(guī)育種，而育種過程中主要是以抗病、抗旱為基礎(chǔ)。在滯綠突變延長(zhǎng)光合作用時(shí)間方面的深入研究為人們?cè)隈R鈴薯增產(chǎn)育種方面提供了新的思路和方向。由于不同作物存在相同的滯綠表型，但是基因型卻不同，如同一滯綠性狀可能受不同基因控制，同一基因功能缺損的程度不同也可能會(huì)造成不一樣的滯綠類型[34]。因此，研究不同類型滯綠基因并進(jìn)行克隆及功能性驗(yàn)證，明確其對(duì)于延緩作物衰老的作用及機(jī)理，降低葉綠素分解速率，延長(zhǎng)光合作用時(shí)間，對(duì)提高作物產(chǎn)量有重要意義。

目前，育種學(xué)家通過雜交育種的標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)，滯綠突變體在莖稈抗逆能力（抗病、抗干旱、抗倒伏等）方面具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，可作為遺傳改良的育種材料[35-36]。參與葉綠素降解過程的滯綠基因SGR/SGRL可 以 同 多 種 CCEs（NYC1、NYE、PPH、PAO、HCAR、RCCR）和LCHⅡ發(fā)生互作，形成SGR-CCE-LHCⅡ大分子復(fù)合物，該大分子復(fù)合物可以降低葉綠素降解產(chǎn)物pFCC對(duì)細(xì)胞的毒害作用[28]。伴隨著現(xiàn)代分子育種學(xué)的深入研究發(fā)現(xiàn)，SGR/SGRL基因普遍存在于高等植物中。但是，SGR/SGRL基因啟動(dòng)子順式作用元件及其調(diào)控活性的研究報(bào)道還很少，與SGR/SGRL基因互作的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子能否引起植物滯綠表型等諸多問題尚待解開。

目前，對(duì)于青海省主導(dǎo)品種青薯9號(hào)的深入研究發(fā)現(xiàn)，該品種生育期較長(zhǎng)，在生長(zhǎng)后期一直保持綠色狀態(tài)。因此，筆者以該品種為研究對(duì)象，克隆該品種的SGR基因，發(fā)現(xiàn)該基因的開放閱讀框819 bp，編碼272個(gè)氨基酸。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，其包含了SGR的典型結(jié)構(gòu)域；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，其與擬南芥、番茄和辣椒等SGR基因具有較高的同源性。對(duì)馬鈴薯SGR基因功能進(jìn)行深入研究，可為其在馬鈴薯生產(chǎn)實(shí)踐中提供更廣闊的應(yīng)用前景。