小尾寒羊JAZF1 基因多態(tài)性g.68263669G>A位點及其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

王鳳艷，王翔宇，賀小云，劉秋月，馬琳，儲明星，狄冉

（中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193）

作為一種重要的家養(yǎng)動物，綿羊為人類提供了優(yōu)質(zhì)肉、毛、皮、奶等必需品，在畜牧業(yè)發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。然而，目前我國綿羊產(chǎn)業(yè)存在發(fā)展不平衡、生產(chǎn)效率低下的問題，因此，提高綿羊的繁殖效率和肉用生產(chǎn)性能勢在必行。綿羊產(chǎn)羔數(shù)作為一個低遺傳力性狀，受到遺傳和環(huán)境等多種因素的共同控制，其中遺傳因素尤其重要。利用傳統(tǒng)的育種技術(shù)提高綿羊的繁殖效率不僅耗時長，效果也不明顯，而通過標記輔助選擇可以加快遺傳進展。目前，鑒定到的綿羊多羔主效基因包括和等，其中基因是中國綿羊多羔主效基因，和是歐洲綿羊多羔主效基因。

本團隊前期對國內(nèi)單羔綿羊品種和多羔綿羊品種進行了全基因組重測序，篩選到了與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因——基因（JAZF Zinc Finger 1）及其多態(tài)位點（Oar_v3.1 中4 號染色體68263669 bp 位點），該位點的值為0.63?；蚴且环N新型的轉(zhuǎn)錄輔助因子，具有抑制乳頭狀甲狀腺癌細胞增殖、促進細胞凋亡、調(diào)節(jié)糖脂代謝、促進心肌微血管內(nèi)皮細胞增殖和血管生成的作用，對脂肪細胞內(nèi)脂肪素的表達也有一定的調(diào)節(jié)作用。研究表明，敲除會使人類精原干細胞周圍蛋白A2 的合成減少，這對男性不育癥的分子治療提供了新的見解。此外，研究發(fā)現(xiàn)，基因?qū)ε５漠a(chǎn)奶量、繁殖、體型、毛色等性狀產(chǎn)生一定的影響。但目前未見基因與綿羊多羔性狀有關(guān)的報道。

小尾寒羊具有性早熟、常年發(fā)情、多羔等優(yōu)異繁殖性狀，其適應性強，常被用來作為母本雜交改良其他品種。之前研究報道，與野生型相比，攜帶突變的小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)隨突變拷貝數(shù)的增加而增加。然而，在小尾寒羊群體中發(fā)現(xiàn)不攜帶突變的個體仍然有產(chǎn)多羔的現(xiàn)象，這說明在小尾寒羊中很可能存在其他多羔主效基因或突變，進一步挖掘其他的多羔基因及其突變，分析基因間的協(xié)同效應，將有助于發(fā)現(xiàn)新的分子標記。本研究首先分析了基因和基因在小尾寒羊中的多態(tài)性以及對小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的影響，接著分析了上述2 個基因?qū)π∥埠蚨喔岬膮f(xié)同效應，以期為綿羊多羔性狀的遺傳標記開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 于山東省鄆城縣誠聯(lián)小尾寒羊種羊場選擇飼養(yǎng)管理條件一致、3 歲、健康、經(jīng)產(chǎn)的小尾寒羊母羊362 只進行實驗。

1.2 樣品的采集與DNA 的提取 對362 只小尾寒羊頸靜脈采血3 mL，采集后的血液樣品用EDTA 進行抗凝處理，并于-20℃冰箱儲存。使用天根血液基因組提取試劑盒（天根生物科技有限公司，北京）進行血液DNA 的提取，對提取的DNA 樣品用Nano Drop 2000進行濃度檢測，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量評估，選擇合格的樣品進行后續(xù)的實驗分析。

1.3 基因分型 采用Sequenom MassARRAYSNP 分型技術(shù)對綿羊4 號染色體基因68263669 bp（Oar_v3.1）位點進行分型。PCR 擴增及延伸引物序列如表1所示，所有引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。采用TaqMan 探針分型技術(shù)對綿羊6 號染色體位點分型，探針及引物序列如表2 所示。熒光定量反應體系為：ddHO 1.1 μL，2×Master Mix 3.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，2 種探針引物（10 μmol/L）各0.15 μL。熒光定量PCR 反應條件為：95℃10 min（孵育），95℃30 s（解鏈），60℃1 min（延長），共40個循環(huán)。

表1 Sequenom MassARRAY?SNP 分型引物序列信息

表2 FecB-TaqMan 探針及引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)分析 使用Microsoft Excel 2019 軟件計算小尾寒羊基因68263669 bp（Oar_v3.1）位點和突變位點的基因型頻率、等位基因頻率、雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)量（Ne）等參數(shù)，并用卡方檢驗檢測這2 個位點在該群體中的Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。>0.05 時認為處于Hardy-Weinberg 平衡。采用最小二乘法分析基因68263669 bp 位點和突變位點的基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性，其線性模型為y=+G+G+GG+e。該模型中y 代表產(chǎn)羔數(shù)的表型值；表示群體均值；G表示基因68263669 bp 位點的基因型效應；G表示突變位點的基因型效應；GG代表基因68263669 bp 位點和突變位點之間的協(xié)同效應；e表示隨機誤差。數(shù)據(jù)分析由SPSS 20.0 完成，所有結(jié)果用“平均值±標準誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小尾寒羊基因g.68263669G>A 位點多態(tài)性分析 通過基因分型發(fā)現(xiàn)，基因g.68263669G>A位點在小尾寒羊群體中存在3 種基因型：AA 型（165只）、AG 型（191 只）和GG 型（6 只），如圖1 所示。對小尾寒羊進行群體遺傳學分析，結(jié)果如表3 所示：基因g.68263669G>A 位點和突變位點均為中度多態(tài)（0.250.05），但是基因g.68263669G>A 位點處于不平衡狀態(tài)（<0.05）。

表3 小尾寒羊JAZF1 基因g.68263669G>A 位點和FecB 突變位點的群體遺傳分析

圖1 小尾寒羊JAZF1 基因g.68263669G>A 位點分型結(jié)果

2.2基因g.68263669G>A 位點和突變位點與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析 由表4 可知，對于g.68263669G>A 位點，GG 型個體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA型和AG 型個體。對于突變位點，產(chǎn)羔數(shù)隨突變拷貝數(shù)的增加而顯著增加。

表4 JAZF1 基因g.68263669G>A 位點和FecB 位點不同基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值及標準誤

2.3基因g.68263669G>A 位點與突變對小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的協(xié)同效應分析 由表5 可知，同時攜帶和g.68263669G>A 純合突變的小尾寒羊母羊（GGGG 型）產(chǎn)羔數(shù)顯著高于單獨攜帶任一突變的母羊產(chǎn)羔數(shù)。

表5 g.68263669G>A 與FecB 位點對小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的協(xié)同效應

3 討 論

JAZF1 是一種鋅指蛋白，是細胞中代謝應激的主要介質(zhì)，能增加細胞對凋亡的敏感性。是孤兒核受體TAK1 的共阻遏物，而大多數(shù)孤兒核受體家族成員參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，因此，可能與糖脂代謝和脂代謝密切相關(guān)。目前對基因的研究主要集中在癌癥、糖尿病等疾病上。與（PHD Finger Protein 1）基因的融合還與子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤的發(fā)生有關(guān)，子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤導致雌激素和孕激素受體陽性率較高，對女性生殖有一定的影響?；蚓幋a包含3 個假定的鋅指基序的27 kd 核蛋白，其在肝臟、脂肪和睪丸等組織中廣泛表達。Ma 等研究表明基因可作為與性腺發(fā)育相關(guān)的差異表達的miRNA 和lncRNA 的靶基因。Fu 等研究表明基因沉默會抑制人類精原干細胞（SSC）增殖和DNA 合成，并促進SSC 的凋亡，該基因的敲低導致人類SSC 中細胞周期蛋白A2 的減少，因此對治療男性不育癥具有重要意義。上述研究表明該基因?qū)游锏姆敝尘哂幸欢ǖ恼{(diào)控作用。而基因在綿羊繁殖方面的研究鮮有報道。

本文對基因多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)進行研究，發(fā)現(xiàn)基因g.68263669G>A 位點與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)，該突變可以顯著提高小尾寒羊的產(chǎn)羔數(shù)（<0.05），是一個有利突變，暗示該突變可能參與了綿羊的繁殖調(diào)控，但其具體的作用機制還有待于進一步研究。

突變可引起B(yǎng)MPR1B 信號減弱，導致FSHR和LHR 分泌增加，提高對FSH 和LH 的敏感性，減少顆粒細胞凋亡以增加綿羊排卵率，從而提高綿羊的產(chǎn)羔數(shù)。突變顯著增加了小尾寒羊和湖羊的產(chǎn)羔數(shù)，是導致這2 個品種多羔的關(guān)鍵基因。本研究中產(chǎn)羔數(shù)隨突變拷貝數(shù)的增加而顯著增加的結(jié)果與上述發(fā)現(xiàn)一致。另外，對同時攜帶和g.68263669G>A突變母羊的產(chǎn)羔數(shù)分析發(fā)現(xiàn)同時攜帶2 個突變的小尾寒羊母羊產(chǎn)羔數(shù)顯著高于單獨攜帶任一突變的母羊產(chǎn)羔數(shù)，表明和g.68263669G>A 突變對小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)存在一定的協(xié)同效應。之前Chu 等研究結(jié)果表明，同時攜帶和突變的小尾寒羊母羊產(chǎn)羔數(shù)要顯著高于攜帶一個突變的個體。Hanrahan 等研究發(fā)現(xiàn)同時攜帶和突變的母羊具有更高的排卵率。另外，同時攜帶、以及基因突變的母羊排卵率較高，并且這些基因?qū)ε怕褦?shù)也顯示出協(xié)同作用。

4 結(jié) 論

綿羊基因g.68263669G>A 位點可能是提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)的潛在的有效標記。該位點和突變對產(chǎn)羔數(shù)有一定的協(xié)同效應。