腹瀉仔豬的糞便微生物代謝組學分析

周心晨，王蘭，張雨琛，韓新燕*

（1.海南浙江大學研究院，浙江大學動物科學學院，農業(yè)農村部華東動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，浙江杭州 310058；2.海南農墾草畜豬業(yè)有限公司，海南?？?570100）

仔豬腹瀉是養(yǎng)豬生產的一大難題，仔豬腹瀉不僅會嚴重影響其成活率，還會持續(xù)影響后續(xù)的增重。在飼料全面禁抗的背景下，采用非藥物手段維護仔豬腸道健康顯得尤為重要。腸道菌群在動物的腸道健康中發(fā)揮著不可或缺的作用，它們能夠影響宿主腸道發(fā)育、協(xié)同機體調節(jié)能量代謝。腸道菌群的代謝產物在腸道上皮細胞、腸道菌群和腸道免疫細胞組成的復雜系統(tǒng)中作為重要信號物質參與調節(jié)腸上皮屏障的功能的正常運行。腹瀉仔豬的菌群代謝變化鮮有報道。因此，本研究旨在探討腹瀉仔豬糞便菌群結構及代謝差異，為進一步探究菌群與仔豬腸道之間的互作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗設計與飼養(yǎng)管理 動物和實驗設計經浙江大學動物保護和使用委員會批準。本實驗隨機選取胎次相同的10 日齡左右的哺乳仔豬作為研究對象，按照豬場的正常免疫措施和管理模式進行飼養(yǎng)，分別隨機采集腹瀉（D）與非腹瀉仔豬（H）的糞便作樣本保存。

1.2 腸道菌群16S rRNA 測序 利用Thermo NanoDrop 2000 紫外微量分光光度計和1% 瓊脂糖凝膠電泳進行總DNA 質檢。提取出的腸道食糜微生物DNA 的16S rRNA 擴增選擇區(qū)域為V3-V4 區(qū)，使用的通用引物為341F 和806R。在通用引物的5' 端加上適合Illumina Miseq PE250 測序的index 序列和接頭序列，完成特異性引物的設計。Forward Primer（5'-3'）：CCTACGGGRSGCAGCAG（341F）；Reverse Primer（5'-3'）：GGACTACVVGGGTATCTAATC（806R）。以稀釋后的基因組DNA 為模板，使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR kit 高保真酶進行PCR，確保擴增的準確性和高效性。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR 產物?；厥蘸?，利用Thermo NanoDrop 2000 紫外微量分光光度計和2%瓊脂糖凝膠電泳進行文庫質檢。文庫質檢合格后，使用Qubit 進行文庫定量，并根據每個樣品的數(shù)據量要求，進行相應比例的混合。使用Illumina Miseq PE250 上機測序。

1.3 糞便LC-MS 代謝組學分析 取糞便樣品100 mg 左右，加入10 倍體積的預冷90% 甲醇（即100 mg 樣本加入1 mL 90%甲醇），勻漿，干燥。乙腈水溶液處理后取上清液進樣分析。用Agilent 1290 Infinity LC 系統(tǒng)進行色譜分析，全程4℃自動進樣。采用正、負離子雙模式進行質譜鑒定。原始數(shù)據經ProteoWizard 轉換成mzML 格式，然后經XCMS 和SIMCA-P 14.1 軟件處理得到數(shù)據，數(shù)據經Pareto-scaling 預處理后，分別進行單維和多維統(tǒng)計分析。在 KEGG 數(shù)據庫中匹配和聚類分析并用Java TreeView 軟件繪圖。Fisher 精確檢驗（Fisher's Exact Test）用于比較各通路在代謝物集合中的分布，評價通路代謝物富集的顯著性。

1.4 統(tǒng)計分析 所有結果數(shù)據均用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件處理，以平均數(shù)± 方差表示，以<0.05 為差異顯著。各組間數(shù)據采用Duncan's 多重比較進行差異顯著性檢驗。對微生物組數(shù)據進行Student's t 檢驗，使用Pearson 相關性分析生成腸道差異物種與耐藥基因之間的相關矩陣，并利用Graphpad prism 作圖。

2 結果

2.1 腹瀉仔豬與非腹瀉仔豬糞便菌群組成差異

2.1.1 腹瀉與非腹瀉組糞便菌群結構分析 如圖1-A 所示，在門水平上，2 組所含主要菌門一致，擬桿菌門是腹瀉豬和非腹瀉豬中數(shù)量最多的，分別占比54.83%和54.36%，其次是厚壁菌門（在2 組中分別占42.78%和41.67%）。值得一提的是，梭桿菌門只有在腹瀉組中被檢測到但未在非腹瀉組檢測到。在屬水平上（圖1-B），普氏菌屬（）是最豐富的菌屬，在非腹瀉組和腹瀉組中分別占比54.57%和50.44%；其次是巨型球形菌屬（），在非腹瀉組和腹瀉組中分別占13.08%和9.56%；第三為乳桿菌屬（），在非腹瀉組和腹瀉組中分別占比為4.05%、7.84%。

圖1 腹瀉與非腹瀉組糞便菌群結構分析

2.1.2 腹瀉與非腹瀉組糞便差異菌群及網絡分析LEfSe 分析進一步檢測出非腹瀉組特有的3 個類群與腹瀉組特有的22 個類群。如圖2-A 所示，在科水平上，乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）、紅桿菌科（Rhodoba cteraceae）和 Erysipelotrichaceae 在腹瀉組菌群中的豐度顯著低于非腹瀉組。梭狀芽孢桿菌（）乳酸桿菌（）、擬桿菌（）、等菌屬的豐度也低于非腹瀉組（<0.05）。而腹瀉組中韋榮球氏菌（）、月形單胞菌（）和的豐度高于非腹瀉組（<0.05）。為進一步探討不同菌屬間的相關性，通過計算各屬間的Spearman 相關系數(shù)，對菌群進行相關性分析。從圖2-B 中可以看出，非腹瀉組的菌群相互作用程度較高，相關度最高的2 個屬分別是梭狀芽孢桿菌（）和（0.75）。韋榮球氏菌（）和呈負相關。由此可見，腹瀉仔豬微生物群落之間的聯(lián)系減弱，并且腹瀉后顯著增多的韋榮球氏菌（）可能和正常情況下的存在競爭關系。

圖2 腹瀉與非腹瀉組糞便菌群結構分析

2.1.3 菌群功能分析 為探究腹瀉組與非腹瀉組菌群的功能變化，采用PICRUSt 法分析各樣品中的微生物群，根據以上所獲得的基因序列在KEGG 途徑第3 層級預測菌群功能。結果如圖3 所示，腹瀉組脂多糖生物合成等途徑的相關基因豐度比例升高（<0.05），精氨酸、組氨酸代謝等途徑相關基因的相對豐度降低（<0.05）。

圖3 腹瀉與非腹瀉組糞便菌群功能分析

2.2 腹瀉仔豬與非腹瀉仔豬糞便代謝組學差異

2.2.1 代謝數(shù)據質量評價 如圖4-A、4-B 所示，2 組樣本能夠明顯區(qū)分，反映組內樣品聚類良好，組間樣品分離良好。為避免建模過程中監(jiān)督模型的過擬合，采用替代檢驗對模型進行檢驗，以保證模型的有效性。如圖4-C和4-D 所示，隨機模型的和Q隨著替換保留量的逐漸減少而逐漸減小，說明原模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)健性良好。

圖4 代謝數(shù)據質量評價

2.2.2 差異代謝物生物信息學分析 以VI>1 和<0.05為條件，對鑒定的代謝物進行篩選，得到26 種差異代謝物（圖5-A、5-B）。腹瀉組相較非腹瀉組來說，硫胺素（Thiamine）、吡哆醇（Pyridoxine）、糖精（Saccha rin）、Norharmane、Indole-2-Carboxylic Acid、N,N-Dimethylsphingosine、11（Z）,14（Z）-Eicosadienoic Acid、2-Oxoadipic Acid 共8 種代謝物顯著上調；二甲基砜（Dimethyl SULFOne）、油酸（Oleic Acid）、壬二酸（Azelaic acid）、3-甲基二酸（3-Methyladipic acid）、石膽酸（Lithocholic acid）、肉豆蔻酸（Myristic acid）、MG（18:2（9Z,12Z）/0:0/0:0）[rac]、L-Palmitoylcarnitine、alpha-Tochopheryl Acetate、4-Hexen-1-ol,（E）、N-Palm itoylsphingosine、Cer（d18:1/18:1（9Z））、1-Palmitoylsn-Glycero-3-Phosphocholine、Tridecanoic Acid、4-Pyr idoxic Acid、3b-Hydroxy-5-Cholenoic Acid、20-HETE、Heptadecanoic Acid 共18 種代謝物顯著下調，這些差異代謝物主要屬于酮酸、脂肪?；⑦拎?、類固醇、磺胺、長鏈脂肪酸、脂質和類脂分子等。相關分析有助于測量代謝物之間代謝親和力的程度，從而進一步理解代謝物在腹瀉引起的生物狀態(tài)變化過程中的調控關系。代謝物的網絡關系如圖5-C、5-D 所示，Tridecanoic Acid 等脂質和類脂分子間具有明顯的正相關性，硫胺素與大多數(shù)差異代謝物呈負相關（如二甲基砜），有機酸2-Oxoadipic Acid 與大多數(shù)差異代謝物呈負相關（如Tridecanoic Acid）。

圖5 差異代謝物生物信息學分析

2.2.3 代謝通路分析 對差異顯著的代謝物的KEGG 通路注釋結果如表1 所示，涉及到維生素B代謝、脂肪酸生物合成、硫傳遞系統(tǒng)、血管平滑肌收縮、硫胺代謝、味覺傳導、硫代謝、維生素消化吸收、脂肪酸降解、賴氨酸降解、不飽和脂肪酸生物合成、花生四烯酸代謝、色氨酸代謝、膽汁分泌、脂肪酸代謝、氨基酸生物合成、2-氧羰基酸代謝、ABC 轉運體、代謝途徑共19 條代謝通路，差異顯著的代謝途徑主要與維生素B代謝、脂肪酸生物合成和硫傳遞系統(tǒng)有關。

表1 KEGG 注釋到的代謝通路

3 討 論

同人類兒童的情況類似，腹瀉等胃腸道疾病是導致新生仔豬和斷奶仔豬高發(fā)病率和高死亡率的主要原因之一，因此腹瀉仔豬也被用作胃腸道細菌、真菌、原生生物或病毒感染的模型動物。通常認為，腸道微生物組失調是腹瀉患者和腹瀉動物的特征，病原體感染是腹瀉表型的主要病因。合適的仔豬飼糧添加劑可以改善仔豬感染性腹瀉，如仔豬飼料中添加鼠李糖乳桿菌可以調節(jié)腸道微生物菌群平衡，調控腸道免疫穩(wěn)態(tài)，調節(jié)宿主營養(yǎng)物質代謝，改善仔豬腹瀉，而芽孢桿菌混合物在治療仔豬腹瀉、幫助重建有益菌群方面極為有效，但其相關代謝組學和具體機制尚未得到充分研究。

梭桿菌門豐度顯著升高是德國、俄羅斯、中國等各國急性闌尾炎患者的共同特征，胃腸道功能紊亂是闌尾炎的誘因之一；用大豆寡糖作為膳食補充劑添加到飼料中增加了仔豬腸道菌群多樣性，并且顯著降低了梭桿菌門的豐度。本實驗中，梭桿菌門只有在腹瀉組中被檢測到，提示梭桿菌門數(shù)量增多與腸道功能紊亂有關。LEfSe 能判別物種對組間差異的影響程度。本實驗LEfSe 分析顯示，腹瀉組等一些屬的細菌數(shù)量增多。顯著增加與PEDV感染仔豬糞便菌群生態(tài)失衡有關。與腹瀉有關，當腹瀉評分升高時，數(shù)量增加。本實驗中這些和腹瀉緊密聯(lián)系的菌屬增加提示腹瀉仔豬的菌群存在生態(tài)失衡。研究表明乳酸桿菌能抑制病原弧菌等致病菌的生長，本研究中，腹瀉組乳酸桿菌豐度降低，提示對病原菌的抑制作用減弱。之前的一項研究表明，梭狀芽胞桿菌屬在IBS 癥狀嚴重程度中起關鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)梭狀芽胞桿菌是腹瀉與非腹瀉組之間的一個差異菌屬且其數(shù)量與和呈負相關，表明腹瀉仔豬的糞便微生物網絡發(fā)生改變。脂多糖（LPS）的生物合成過程是細菌引起機體發(fā)病的機制的一個進程，在功能預測結果中發(fā)現(xiàn)，LPS 生物合成的升高可能與上述潛在致病菌的增加有關。

微生物組及其代謝物能夠參與機體發(fā)育，影響宿主的免疫、代謝等多方面活動，因此又被稱為機體的“第二基因組”。代謝組學能鑒定出細胞表達的分子物質并通過對其濃度的分析發(fā)現(xiàn)其對于環(huán)境變化的響應，如乳桿菌能通過在小鼠體內產生芳基烴受體配體來改善代謝綜合征的特征。本實驗在正負離子模式下總共檢測到有機酸及其衍生物等 360 種代謝物，并篩選得到26 種具有顯著差異的差異代謝物。硫胺素（維生素B），水溶性必需維生素，其缺乏會導致一系列疾病的發(fā)生。但是硫胺素過量會引起低活性精神錯亂，導致營養(yǎng)依賴癥，危重糖尿病患者的硫胺缺乏癥與高乳糖血癥之間也存在一定的關聯(lián)。吡哆醇是維生素B的一種存在形式，參與能量代謝，維持免疫系統(tǒng)正常運轉。吡哆醇過量也會引起一系列疾病，如加劇神經損傷、擾亂腸道屏障等。油酸已被證明可以刺激脂肪酸吸收、脂溶解和氧化，并促進食物攝入控制。與未處理的小鼠相比，雙歧桿菌提高了小鼠膽汁中的石膽酸和熊去氧膽酸（UDCA），從而上調了回腸緊密連接蛋白的表達并降低了內毒素血癥，從而降低了體重增加、高血糖和肝臟脂肪變性。在本實驗中，腹瀉組硫胺素、吡哆醇等物質含量上調，提示代謝紊亂，油酸、石膽酸等分子的下調也與腸道健康有著不可分割的關系。

4 結 論

本研究結果表明，腹瀉仔豬糞便中乳酸桿菌科、紅桿菌科、梭狀芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬等的豐度顯著降低，韋榮球氏菌屬、月形單胞菌屬等的豐度顯著增加；硫胺素、吡哆醇等差異代謝物上調，油酸、石膽酸等差異代謝物下調；富集到與維生素B、脂肪酸生物合成和硫傳遞系統(tǒng)代謝等相關的3 條差異代謝通路。提示，腹瀉與腸道微生態(tài)失衡和菌群代謝紊亂息息相關。