山銀花和姜黃提取物對(duì)蛋雞輸卵管組織形態(tài)、抗氧化指標(biāo)和炎癥因子的影響

葛 昕，王元智，龍美貞，董玉慧，呂慧源，袁建敏，周向梅*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.北京生泰爾科技股份有限公司，北京 102206；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193)

近年來，隨著育種水平不斷提升，蛋雞的產(chǎn)蛋性能逐漸提高，產(chǎn)蛋周期也逐漸延長(zhǎng)，但生產(chǎn)中產(chǎn)蛋后期蛋殼品質(zhì)越來越差，暗斑蛋越來越多等現(xiàn)象逐漸突出。研究表明，蛋殼品質(zhì)取決于輸卵管的結(jié)構(gòu)和功能，由疾病或環(huán)境因素引起的輸卵管氧化損傷或炎癥是導(dǎo)致蛋殼品質(zhì)變差的主要原因。

植物提取物由山銀花提取物和姜黃提取物按一定的比例復(fù)配而成，主要成分是綠原酸和姜黃素。綠原酸和姜黃素具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化、抗過敏作用。研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加姜黃素可通過降低過氧化產(chǎn)物的堆積緩解免疫應(yīng)激對(duì)仔豬腸道的損傷，從而提高仔豬腸道消化吸收的能力。飼料中添加姜黃素能夠提高蛋雞的生產(chǎn)性能，增加經(jīng)濟(jì)效益。但飼料中添加綠原酸和姜黃素是否可以緩解蛋雞輸卵管炎、改善蛋殼品質(zhì)目前并不清楚。本試驗(yàn)通過在飼料中連續(xù)添加植物提取物，探求其對(duì)蛋雞輸卵管形態(tài)、抗氧化功能和炎癥的影響，為提高蛋雞后期蛋殼品質(zhì)提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用的植物提取物由北京生泰爾科技股份有限公司提供，主要成分為山銀花提取物和姜黃提取物，有效成分為綠原酸100 mg/kg、姜黃素20 mg/g?；A(chǔ)日糧和營(yíng)養(yǎng)成分：表觀代謝能10 883.2 KJ/kg，粗蛋白16.0%，賴氨酸0.76%，蛋氨酸+胱氨酸0.65%，鈣3.9%，有效磷0.26%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 選擇400 日齡左右的蛋雞約1 440 只，試驗(yàn)前雞群整體質(zhì)量良好，產(chǎn)蛋率不穩(wěn)定。預(yù)飼期產(chǎn)蛋率在88.9%左右，隨機(jī)分為4 個(gè)組，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60 只雞。采用單因子隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)基礎(chǔ)飼糧（不含植物提取物）（空白對(duì)照組）、植物提取物添加量分別為500、750 mg/kg 及1 000 mg/kg植物提取物處理組。預(yù)試期7 d，正試期42 d。

試驗(yàn)蛋雞飼養(yǎng)在全封閉式的蛋雞舍四階梯式金屬籠中間兩層，雞籠的每一層相連的15 個(gè)小籠作為1 個(gè)重復(fù)，各處理雞重復(fù)間的排列考慮位置效應(yīng)。機(jī)械通風(fēng)，光照時(shí)間在16 h/d，舍內(nèi)溫度18～23℃，相對(duì)濕度為40%～60%。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 產(chǎn)蛋性能 試驗(yàn)進(jìn)行過程中，每周測(cè)定蛋雞產(chǎn)蛋量、平均蛋重和產(chǎn)蛋率。每天記錄各個(gè)重復(fù)的雞只死淘率、畸形蛋率、臟蛋率、軟殼蛋率、水紋蛋率和破蛋率等（收集每個(gè)重復(fù)的全部雞蛋）。

1.3.2 輸卵管組織學(xué)觀察 于正試期第42 天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取2 只蛋雞進(jìn)行剖殺，分離輸卵管，按膨大部、峽部子宮部按東南西北區(qū)分別取樣，樣品1cm×1cm 置于10% 中性福爾馬林固定24 h 以上，常規(guī)石蠟2 μm 切片，進(jìn)行HE 染色和PAS 染色，光鏡下觀察。PAS 染色后的組織切片，每組選擇3 只蛋雞，每只蛋雞選擇3張非連續(xù)切片，每張切片選擇10 個(gè)視野，在顯微照相系統(tǒng)（Olympus，DP72，日本）下拍照，獲得的照片在Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，美國(guó)）軟件下對(duì)每100 個(gè)輸卵管上皮細(xì)胞中糖原陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.3 輸卵管組織抗氧化指標(biāo) 于試驗(yàn)的第42 天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取2 只蛋雞進(jìn)行剖殺，分離輸卵管，按膨大部、峽部子宮部按東南西北區(qū)分別取樣，樣品0.5 cm×0.5cm經(jīng)液氮冷凍后-80℃中保存，用于測(cè)定蛋雞輸卵管組織中總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）含量?？偪寡趸芰υ噭┖小⒅|(zhì)氧化劑盒、總SOD 活性檢測(cè)試劑盒、總谷胱甘肽過氧化物酶檢測(cè)試劑盒、Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3.4 輸卵管炎癥因子mRNA 水平的測(cè)定

1.3.4.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中公布的雞，用Primer premiere 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，采用Primer blast 工具進(jìn)行檢索來驗(yàn)證其特異性，引物序列見表1。

表1 Real-time 引物序列

1.3.4.2 RNA 的提取和cDNA 的合成 RNA 的提取根據(jù)艾德萊生物科技有限公司EASYspin Plus 組織/ 細(xì)胞 RNA 快速提取試劑盒，cDNA 的合成根據(jù)南京諾唯贊生物科技有限公司HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書。

1.3.4.3 Real-time PCR 用核酸測(cè)定儀測(cè)定cDNA 濃度，將cDNA 稀釋成相同的濃度，作為real-time PCR 檢測(cè)的模板。使用南京諾唯贊生物科技有限公司AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 進(jìn)行q-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL：cDNA 2 μL，SYBR Green Reaction Mix 10μL，dd HO 7.2 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.4 μL。IL-2、IL-4、IL-1、TNF-的反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s；60℃ 30 s；72℃30 s；40 個(gè)循環(huán)，設(shè)定收集熒光。IL-6、IL-10、-actin、IFN-的反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s；40 個(gè)循環(huán)，設(shè)定收集熒光。以-actin 作為內(nèi)參基因，2法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)豐度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 抗氧化指標(biāo)和炎癥因子含量使用GraphPad Prism8.0 軟件進(jìn)行分析，分析結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異使用Unpaired t-test 進(jìn)行分析，“*”代表差異顯著（<0.05）；“**”代表<0.01，“***”代表<0.001，差異極顯著；“ns”代表差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 植物提取物對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)的影響 由表2可知，在1～6 周，添加500、750 mg/kg 及1 000 mg/kg植物提取物組的產(chǎn)蛋率較對(duì)照組分別提高2.88%、2.36%、3.39%（>0.05），平均蛋重略低于對(duì)照組（>0.05）。無殼蛋率方面，添加植物提取物組均低于對(duì)照組（<0.05）。750 mg/kg 植物提取物組的沙皮蛋率低于對(duì)照組，和500 mg/kg 組差異不顯著。臟蛋率方面，添加植物提取物組均低于對(duì)照組（>0.05）。添加植物提取物組的日產(chǎn)蛋量均高于對(duì)照組（>0.05）。

表2 植物提取物對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)的影響

2.2 輸卵管組織學(xué)形態(tài)觀察

2.1.1 HE 染色 HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組蛋雞輸卵管膨大部在低倍鏡下可見黏膜上皮層和固有層分布大小不一、藍(lán)染的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)灶；添加植物提取物組黏膜上皮層和固有層結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病變；高倍鏡下可見對(duì)照組浸潤(rùn)的炎性灶主要由圓形、核質(zhì)比高、嗜堿性藍(lán)染的淋巴細(xì)胞構(gòu)成。添加植物提取物組與對(duì)照組蛋雞輸卵管峽部組織學(xué)無明顯差異。與對(duì)照組相比，添加植物提取物750 mg/kg 和1000 mg/kg 導(dǎo)致蛋雞輸卵管子宮部（東、南、西、北）固有層血管擴(kuò)張淤血。

2.1.2 PAS 染色 PAS 染色結(jié)果顯示，蛋雞輸卵管黏膜上皮層分泌細(xì)胞及固有層管狀腺細(xì)胞內(nèi)可見PAS 陽(yáng)性信號(hào)，在高倍鏡下可見均質(zhì)、紫紅色、圓形的糖原顆粒。輸卵管不同部位陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)弱不同。對(duì)照組與添加植物提取物組膨大部黏膜上皮層及固有層均呈陽(yáng)性；峽部黏膜上皮及固有層均呈強(qiáng)陽(yáng)性；對(duì)照組子宮部東黏膜上皮呈陽(yáng)性，添加植物提取物組子宮部東黏膜上皮均呈陰性；對(duì)照組與添加植物提取物組子宮部南黏膜上皮及固有層均呈陰性；與對(duì)照組相比，750 mg/kg 組子宮部西黏膜上皮呈陽(yáng)性，其他添加植物提取物組均呈陰性；對(duì)照組與添加植物提取物組子宮部北黏膜上皮及固有層均呈陰性。與對(duì)照組相比，飼料中添加750 mg/kg 與1 000 mg/kg 植物提取物的蛋雞輸卵管峽部輸卵管上皮糖原陽(yáng)性細(xì)胞增加了23%（<0.01）。

2.2 飼料中添加植物提取物能提高蛋雞輸卵管抗氧化能力 由圖4 可知，添加500 mg/kg 植物提取物能提高輸卵管膨大部、峽部的T-AOC（<0.05 或<0.01），但對(duì)子宮部（東、南、西、北）的T-AOC 無顯著影響；添加500 mg/kg 植物提取物能降低輸卵管峽部的MDA含量（<0.01），對(duì)膨大部、子宮部（東、南、西、北）無顯著影響；添加500 mg/kg 植物提取物提高輸卵管膨大部、峽部的SOD 含量（<0.01），對(duì)膨大部、子宮部（東、南、西、北）無顯著影響；添加500 mg/kg 植物提取物提高輸卵管膨大部、峽部的GSH-Px 含量，對(duì)膨大部、子宮部（東、南、西、北）無顯著影響。

圖4 植物提取物對(duì)蛋雞輸卵管各部位抗氧化指標(biāo)的影響

圖1 植物提取物對(duì)蛋雞輸卵管各部位組織學(xué)形態(tài)的影響（HE 染色）

圖2 植物提取物對(duì)蛋雞輸卵管各部位糖原陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)（PAS 染色）

圖3 植物提取物對(duì)蛋雞輸卵管各部位糖原表達(dá)的影響

2.3 飼料中添加植物提取物顯著降低蛋雞輸卵管細(xì)胞因子mRNA 水平 由圖5 可知，添加500 mg/kg 植物提取物降低輸卵管膨大部、峽部、子宮部（東、西）IL-4、IL-10、IL-2、IL-6、IFN-mRNA 水平的相 對(duì)表達(dá)量（<0.05 或<0.01），降低子宮部南IL-10、IL-2、IL-6、IFN-mRNA 水平的相對(duì)表達(dá)（<0.05或<0.01），子宮部北與對(duì)照組差異不顯著；添加500 mg/kg 植物提取物降低輸卵管膨大部IL-1mRNA 水平的相對(duì)表達(dá)（<0.01），提高子宮部西IL-1mRNA 水平的相對(duì)表達(dá)（<0.01），峽部、子宮部（東、南、北）與對(duì)照組差異不顯著；添加500 mg/kg 植物提取物降低輸卵管膨大部、峽部、子宮部（東、南、西、北）TNF-mRNA 水平的相對(duì)表達(dá)（<0.01）。

圖5 植物提取物對(duì)蛋雞輸卵管各部位細(xì)胞因子mRNA 水平的影響

3 討 論

3.1 飼料中添加植物提取物對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響 植物提取物的有效成分綠原酸和姜黃素具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化、抗過敏以及免疫調(diào)節(jié)的作用，這些作用有助于維持機(jī)體的抗氧化還原平衡以及腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，減少環(huán)境應(yīng)激，從而提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。黃濤等研究表明，日糧中添加綠原酸可改善肉雞生產(chǎn)性能，提高肉雞血清免疫指標(biāo)及肉品質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加500 mg/kg 的植物提取物能明顯提高蛋雞后期產(chǎn)蛋率、產(chǎn)蛋量、平均蛋重以及改善蛋殼品質(zhì)，這種改善作用可能是通過、減輕輸卵管膨大部組織學(xué)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)輸卵管上皮細(xì)胞的糖原合成和貯存功能來實(shí)現(xiàn)的。

3.2 飼料中添加植物提取物對(duì)蛋雞輸卵管組織學(xué)形態(tài)的影響 輸卵管炎是蛋雞養(yǎng)殖中的一種常見病，多發(fā)于初產(chǎn)雞和高產(chǎn)雞，常見病原菌是沙門氏菌和大腸桿菌，臨床癥狀表現(xiàn)為出血性輸卵管炎、產(chǎn)蛋異常、卵巢炎和腹膜炎，造成產(chǎn)蛋減少，嚴(yán)重者可引起蛋雞死亡。Varmuzova 等研究表明，在飼料中添加姜黃和黃芩提取物可有效降低由熱或腸炎沙門菌雞的腸道炎癥，減少盲腸中腸炎鏈球菌數(shù)量，提高生產(chǎn)性能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加植物提取物能減少蛋雞輸卵管膨大部的炎性灶，并顯著提高輸卵管峽部的糖原合成和貯存功能。因此，植物提取物可能有利于產(chǎn)蛋后期蛋雞輸卵管炎的防控。

3.3 飼料中添加植物提取物對(duì)蛋雞輸卵管各部位抗氧化能力的影響 氧自由基是機(jī)體正常代謝時(shí)產(chǎn)生的有極強(qiáng)氧化能力的活性原子或基團(tuán)。機(jī)體不正常的代謝會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，過量自由基會(huì)對(duì)動(dòng)物造成氧化應(yīng)激，氧自由基攻擊膜結(jié)構(gòu)會(huì)使細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和功能均遭到破壞。飼料中添加綠原酸能改善斷奶仔豬機(jī)體清除自由基能力，保護(hù)了細(xì)胞膜的完整性，增加機(jī)體抗氧化的能力，促進(jìn)養(yǎng)分的吸收和利用。

本試驗(yàn)中，在基礎(chǔ)日糧中添加植物提取物可有效提高蛋雞輸卵管膨大部和峽部T-AOC、SOD 和GSH-Px水平，顯著降低MDA 的含量，從而提高機(jī)體抗氧化能力。這與在母豬、肉雞、大鼠上的研究一致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，植物提取物可以通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化物酶活性、抑制機(jī)體氧化酶活性來緩解氧化應(yīng)激，使動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力得到提升。

3.4 飼料中添加植物提取物對(duì)蛋雞輸卵管各部位細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響 Zhang 等首次證明，綠原酸能通過抑制促炎細(xì)胞因子IFN-、IFN-、IL-1、IL-17A、IL-22 和TNF-的mRNA 表達(dá)減輕感染A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌的雞回腸炎癥反應(yīng)，抑制小腸結(jié)構(gòu)損傷，有效改善感染雞的生長(zhǎng)性能。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加植物提取物能顯著降低輸卵管膨大部、峽部、子宮部促炎細(xì)胞因子IL-2、IL-1、IL-6、TNF-、IFN-mRNA 表達(dá)水平，同時(shí)抑炎因子IL-4、IL-10 mRNA 水平顯著降低。在正常情況下，機(jī)體炎癥因子的表達(dá)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體受到病原體的入侵時(shí)，促炎因子的表達(dá)相對(duì)提高而抑炎因子的表達(dá)相對(duì)降低，使機(jī)體處于免疫應(yīng)答狀態(tài)。金銀花屬于清熱解毒藥物，其發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制是抑制炎癥相關(guān)因子的表達(dá)或產(chǎn)生。本試驗(yàn)選擇產(chǎn)蛋后期的蛋雞為研究對(duì)象，飼料中添加植物提取物后使輸卵管促炎因子水平降低，機(jī)體為了維持相對(duì)平衡狀態(tài)，抑炎因子的水平也相應(yīng)降低。其中，膨大部和峽部細(xì)胞因子mRNA水平的表達(dá)下降倍數(shù)均高于子宮部，說明植物提取物對(duì)蛋雞輸卵管膨大部和峽部的炎癥改善作用更顯著。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，基礎(chǔ)飼料中添加植物提取物可以改善蛋品質(zhì)，降低無殼蛋率，其中500 mg/kg 添加量性價(jià)比最優(yōu)。除生產(chǎn)性能外，基礎(chǔ)飼料中添加植物提取物能減輕蛋雞輸卵管組織學(xué)病變，提高蛋雞輸卵管抗氧化能力以及降低蛋雞輸卵管炎癥因子的表達(dá)，其中對(duì)蛋雞輸卵管膨大部和峽部炎癥改善作用更顯著。因此，飼料中添加植物提取物可能通過提高輸卵管抗氧化能力和降低炎癥因子的表達(dá)，改善蛋雞產(chǎn)蛋后期蛋品質(zhì)。