棉籽粕替代豆粕對(duì)瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

李金輝，陳佳欣，王里彥，田星哲，楊彩虹，張立申，嚴(yán)慧，高艷霞，劉月琴，紀(jì)守坤*，張英杰*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000；2.河北省保定市唐縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北保定 072350）

豆粕是我國畜禽主要的蛋白質(zhì)飼料，占蛋白質(zhì)飼料原料總量的67%，具有蛋白質(zhì)含量高、氨基酸平衡、生物學(xué)效價(jià)高等優(yōu)點(diǎn)，在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，但我國豆粕年產(chǎn)量低，大量依賴進(jìn)口，尋找豆粕的替代品對(duì)于我國畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。棉籽粕是棉籽脫殼后加工生成的副產(chǎn)品，蛋白質(zhì)品質(zhì)好，礦物質(zhì)和維生素含量豐富，年產(chǎn)量可達(dá)600 萬t。棉籽粕因含有抗?fàn)I養(yǎng)因子棉酚影響動(dòng)物生長發(fā)育，限制了其作為蛋白質(zhì)飼料在單胃動(dòng)物上的應(yīng)用。反芻動(dòng)物因特殊的消化道結(jié)構(gòu)以及消化方式可部分降解棉酚，具有一定耐受性，這為棉籽粕作為豆粕的替代品應(yīng)用于反芻動(dòng)物日糧中提供了可能性。Alagarsamy 等研究發(fā)現(xiàn)，6～7月齡羔羊日糧中添加40%棉籽粕對(duì)羔羊生產(chǎn)性能和血液指標(biāo)無不良影響；荊元強(qiáng)等研究表明，棉籽粕作為日糧中主要的蛋白質(zhì)來源并不會(huì)影響肉牛生長性能和屠宰性能，但棉籽粕替代豆粕的適宜比例尚不明確。瘤胃體外發(fā)酵是模擬反芻動(dòng)物瘤胃的體外發(fā)酵方式被廣泛應(yīng)用于預(yù)測和評(píng)定飼料營養(yǎng)價(jià)值。本試驗(yàn)擬采用瘤胃體外發(fā)酵的方式，研究棉籽粕替代豆粕對(duì)瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響，以期尋找出棉籽粕替代豆粕的適宜比例。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 精飼料包括豆粕（河北省石家莊市）、玉米（河北省張家口市）和棉籽粕（河北省滄州市），粗飼料為花生秧（河北省邢臺(tái)市），配制前先將原料在65℃烘48 h 制成風(fēng)干樣，過40 目篩，置于干燥環(huán)境密封保存。育肥羊預(yù)混料由河北吉農(nóng)久遠(yuǎn)生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按等能等氮原則，參照NRC（2001）育肥羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)以棉籽粕分別替代33%、66%、100% 豆粕來配制體重50 kg、日增重300 g 的育肥羊日糧，試驗(yàn)分為4 組，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2 個(gè)平行。試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 瘤胃體外發(fā)酵

1.3.1 瘤胃液采集和瘤胃緩沖液的配制 在河北省保定市唐縣振宏屠宰場采集新鮮屠宰的育肥羊瘤胃液，4 層紗布過濾后置于保溫瓶中密封，帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

瘤胃緩沖液參考Menke 等的方法配制，將400 mL蒸餾水、0.1 mL A 液（10 g MnCl·4HO、13.2 g CaCl·2HO、8 g FeCl·6HO、1 g CoCl·6HO 定容至100 mL）、200 mL B 液（4 g NHHCO、35 g NaHCO定容至100 mL）、300 mL C 液（5.7 g NaHPO、6.2 g KHPO、0.6 g MgSO·7HO 定容至1 000 mL）、1 mL 刃天青（100 mg 刃天青定容至100 mL）和40 mL 還原劑（0.16 g NaOH、0.625 g NaS·9HO 定容至100 mL）混合均勻。瘤胃緩沖液加入異抗壞血酸鈉代替?zhèn)鹘y(tǒng)通CO進(jìn)行除氧，并密封靜置保存，直至溶液顏色由紅色變?yōu)樽攸S色后置于39℃恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行恒溫。

1.3.2 瘤胃體外發(fā)酵和樣品采集 試驗(yàn)前，將瘤胃液在0～4℃冰水浴中解凍后預(yù)熱至39℃，將瘤胃液和瘤胃緩沖液按1:2 比例混勻制成人工瘤胃培養(yǎng)液；準(zhǔn)確稱取1.5 g 日糧裝入纖維濾袋中使用脈沖熱封機(jī)封口，下端使用尼龍繩固定1 個(gè)打孔玻璃珠便于纖維濾袋沉入人工瘤胃培養(yǎng)液中，將2 個(gè)固定有打孔玻璃珠的纖維濾袋放到發(fā)酵吸嘴袋中，斜口使用硅膠塞密封，開口處使用平面袋真空包裝機(jī)除氧密封；使用注射器將200 mL 混合好的人工瘤胃培養(yǎng)液經(jīng)斜口注射到發(fā)酵吸嘴袋中并置于39℃恒溫水浴振蕩器中，打開震蕩開關(guān)進(jìn)行體外發(fā)酵；恒溫水浴振蕩器搖床頻率為45 r/min，發(fā)酵時(shí)間為48 h。

在體外發(fā)酵2、4、6、8、10、12、24、36、48 h時(shí)使用注射器經(jīng)吸嘴袋斜口抽出氣體并記錄產(chǎn)氣量。待48 h 發(fā)酵結(jié)束后，迅速將發(fā)酵吸嘴袋放入冰水浴中終止發(fā)酵。使用EL20 型酸度計(jì)測定人工瘤胃培養(yǎng)液pH，取10 mL 人工瘤胃培養(yǎng)液置于15 mL 離心管中，-20℃冷凍保存，用于后續(xù)測定氨態(tài)氮（NH-N）和菌體蛋白（MCP）濃度。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 常規(guī)營養(yǎng)成分 日糧和發(fā)酵殘?jiān)懈晌镔|(zhì)（DM）、總能（GE）和CP 參照AOAC（2000）的方法測定。NDF 和ADF 含量采用Van Soest 等的方法測定。

1.4.2 體外發(fā)酵參數(shù) 樣品解凍后采用考馬斯亮藍(lán)法測定MCP 濃度，采用靛酚比色法測定NH-N 濃度，采用氣相色譜分析法測定揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度。發(fā)酵結(jié)束后將裝有發(fā)酵殘?jiān)睦w維濾袋用蒸餾水沖洗3次，105℃烘4 h 至恒重，采用Bodas 等的方法測定DM、GE、CP、NDF 和ADF 的消化率。

養(yǎng)分消化率=[（日糧中養(yǎng)分含量– 發(fā)酵殘?jiān)叙B(yǎng)分含量）/日糧中養(yǎng)分含量]×100%

1.4.3 產(chǎn)氣參數(shù) 將各組2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 時(shí)的產(chǎn)氣量代入產(chǎn)氣量模型計(jì)算產(chǎn)氣參數(shù)，產(chǎn)氣量模型：

GP=a+b（1-e）

其中，t 表示發(fā)酵時(shí)間（h），GP 表示t 時(shí)刻時(shí)的產(chǎn)氣量（mL），a 表示快速降解部分產(chǎn)氣量（mL），b 表示慢速降解部分產(chǎn)氣量（mL），c 表示b 的產(chǎn)氣速率（%/h），a+b 表示理論總產(chǎn)氣量（mL）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和初步整理，使用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，以<0.05作為數(shù)據(jù)顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 棉籽粕替代豆粕對(duì)產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)的影響 由表2 可知，隨發(fā)酵時(shí)間延長，各組產(chǎn)氣量增加，發(fā)酵初期產(chǎn)氣速率較快。發(fā)酵6 h 時(shí)，對(duì)照組、33%組產(chǎn)氣量高于66% 組（<0.05）；發(fā)酵8 h 時(shí)，100% 組產(chǎn)氣量高于66% 組（<0.05）；發(fā)酵10、12、48 h 時(shí)，33% 組產(chǎn)氣量高于100% 組（<0.05）。體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)結(jié)果表明，33% 組快速降解部分產(chǎn)氣量高于100% 組（<0.05）；33%組慢速降解部分產(chǎn)氣量、理論總產(chǎn)氣量高于對(duì)照組、100% 組（<0.05）；33% 組、66% 組慢速降解部分產(chǎn)氣速率高于100%組（<0.05）。

表2 棉籽粕替代豆粕對(duì)產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)的影響

2.2 棉籽粕替代豆粕對(duì)養(yǎng)分消化率的影響 由表3 可知，各組間DM 消化率無顯著差異；對(duì)照組CP 消化率高于試驗(yàn)組（<0.05）；33%組、66%組的GE 消化率高于對(duì)照組、100% 組（<0.05）；33% 組NDF、ADF 消化率高于對(duì)照組、66%組和100%組（<0.05）。

表3 棉籽粕替代豆粕對(duì)養(yǎng)分消化率的影響 %

2.3 棉籽粕替代豆粕對(duì)人工瘤胃培養(yǎng)液pH、NH-N、MCP 濃度的影響 由表4 可知，對(duì)照組MCP 濃度低于試驗(yàn)組（<0.05）；對(duì)照組、33%組pH 無顯著差異，100% 組高于其他各組（<0.05）；100% 組NH-N 濃度高于其他3 組（<0.05）。

表4 棉籽粕替代豆粕對(duì)人工瘤胃培養(yǎng)液NH3-N、MCP 含量及pH 的影響

2.4 棉籽粕替代豆粕對(duì)人工瘤胃培養(yǎng)液VFA 濃度的影響 由表5 可知，對(duì)照組乙酸和丙酸濃度高于100%組（<0.05）；對(duì)照組、33% 組總VFA 濃度高于100%組（<0.05）；33% 組丁酸、戊酸濃度高于對(duì)照組和100% 組（<0.05）；33% 組乙酸/ 丙酸低于對(duì)照組、66%組和100%組（<0.05）。

表5 棉籽粕替代豆粕對(duì)人工瘤胃培養(yǎng)液VFA 濃度的影響

3 討 論

3.1 棉籽粕替代豆粕對(duì)產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)的影響 產(chǎn)氣量可反映瘤胃微生物總體變化趨勢(shì)和有機(jī)物的消化率，其與日糧中可消化營養(yǎng)成分和微生物活性正相關(guān)。飼料可發(fā)酵程度越高，微生物活性越強(qiáng)，產(chǎn)氣量越多。本試驗(yàn)結(jié)果表明，棉籽粕替代日糧中33% 的豆粕時(shí)產(chǎn)氣量最高，此后隨替代比例增加產(chǎn)氣量減少，這可能是由于棉籽粕含有抗?fàn)I養(yǎng)因子棉酚，替代比例較低時(shí)瘤胃細(xì)菌對(duì)棉酚具有較強(qiáng)的耐受性，且低濃度棉酚促進(jìn)瘤胃細(xì)菌的生長繁殖，進(jìn)而增強(qiáng)了瘤胃細(xì)菌對(duì)日糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化導(dǎo)致產(chǎn)氣量增多，替代比例達(dá)100%時(shí)由于棉酚的抑制作用導(dǎo)致瘤胃細(xì)菌活性降低、產(chǎn)氣量減少。

產(chǎn)氣參數(shù)可反映瘤胃微生物對(duì)飼料中不同成分的發(fā)酵效果?？焖俳到獠糠之a(chǎn)氣量主要反映葡萄糖、蛋白質(zhì)等可溶性成分的消化程度；慢速降解部分產(chǎn)氣量主要反映纖維素、半纖維素等非可溶性成分的消化程度；產(chǎn)氣速率與日糧的營養(yǎng)特性和微生物發(fā)酵能力有關(guān)；理論總產(chǎn)氣量與非纖維性碳水化合物含量正相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)氣參數(shù)均以替代比例為33% 時(shí)最高，說明棉籽粕可一定程度促進(jìn)瘤胃微生物的發(fā)酵能力，增強(qiáng)對(duì)日糧中可溶性成分、非可溶性成分等消化，有利于微生物的生長繁殖，替代比例為100%時(shí)，可能由于棉酚的毒害作用導(dǎo)致微生物活性下降，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化不利。Zhang 等研究發(fā)現(xiàn)，日糧中可即時(shí)降解的有機(jī)物含量不足或瘤胃微生物定植延遲會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)氣滯后。本試驗(yàn)中，快速降解部分產(chǎn)氣量各組均為負(fù)值，這可能是由于冷凍引起瘤胃微生物定植延遲所致。

3.2 棉籽粕替代豆粕對(duì)養(yǎng)分消化率的影響 養(yǎng)分消化率可反映飼料在瘤胃中被微生物消化的程度，是評(píng)價(jià)飼料營養(yǎng)價(jià)值和瘤胃發(fā)酵特性的重要參數(shù)。DM 消化率越高表明飼料可消化程度越高，瘤胃內(nèi)環(huán)境更適合微生物生長和繁殖，有利于提高飼料營養(yǎng)物質(zhì)利用率；王海榮等研究發(fā)現(xiàn)，棉粕組DM、CP 消化率與豆粕組無顯著差異，但棉粕組NDF、ADF 消化率高，纖維降解菌和厭氧真菌數(shù)也多于豆粕組。本試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果類似，但試驗(yàn)組CP 消化率低于對(duì)照組，替代比例達(dá)100% 時(shí)NDF、ADF 消化率降低，這可能是日糧的組成和替代比例不同所致，替代比例較低時(shí)纖維降解菌對(duì)棉酚具有較強(qiáng)的耐受性，且一定濃度棉酚可促進(jìn)纖維降解菌大量繁殖，進(jìn)而增強(qiáng)了對(duì)纖維的消化能力，替代比例達(dá)100%時(shí)由于棉酚的毒害作用導(dǎo)致微生物消化能力下降。

3.3 棉籽粕替代豆粕對(duì)人工瘤胃培養(yǎng)液pH、NH-N、MCP 濃度的影響 pH 是反映瘤胃內(nèi)環(huán)境的重要指標(biāo)，其與飼料類型、唾液分泌和瘤胃代謝等密切相關(guān)。瘤胃pH 過高或過低均不利于微生物生長繁殖，會(huì)導(dǎo)致微生物活性降低甚至消失，瘤胃pH 正常波動(dòng)范圍為5.5～7.5。本試驗(yàn)中，各組人工瘤胃培養(yǎng)液pH 均在正常范圍內(nèi)，且隨替代比例增加pH 升高，說明棉籽粕抑制了瘤胃微生物對(duì)碳水化合物等成分的消化，導(dǎo)致VFA 生成量減少、pH 升高。

NH-N 可用于合成MCP，是瘤胃微生物分解含氮物質(zhì)的終產(chǎn)物，適宜的NH-N 濃度對(duì)瘤胃微生物生長繁殖具有重要意義。NH-N 濃度與瘤胃微生物合成MCP 和利用飼料蛋白質(zhì)合成NH-N 的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)，因此可間接反映瘤胃氮代謝狀態(tài)，瘤胃NH-N 最佳濃度范圍為2.37～27.3 mg/dL。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，人工瘤胃培養(yǎng)液NH-N 濃度均高于27.3 mg/dL，是由于體外發(fā)酵過程中的NH-N 一部分被微生物利用合成MCP，另一部分溶解在人工瘤胃培養(yǎng)液中，人工瘤胃不具備對(duì)NH-N 的吸收和排出能力，進(jìn)而導(dǎo)致NH-N 濃度升高。此外，隨棉籽粕替代比例增加NH-N 濃度升高，這可能是棉酚導(dǎo)致瘤胃微生物降解含氮物質(zhì)的速率超過其利用NH-N 的速率所致。

MCP 是反芻動(dòng)物最主要的氮源，可為其提供蛋白質(zhì)需要量的40%～80%，瘤胃中MCP 濃度與微生物利用NH-N 的能力有關(guān)，也可間接反映瘤胃微生物的種群數(shù)量。郎朝麗研究發(fā)現(xiàn)，相較于豆粕，棉籽粕會(huì)促使肉牛瘤胃微生物合成更多的MCP，與本試驗(yàn)結(jié)果一致；本試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，MCP 濃度并未隨棉籽粕替代比例增加而改變，提示棉籽粕雖能促進(jìn)瘤胃微生物合成更多的MCP，但替代比例并不會(huì)增強(qiáng)微生物合成MCP 的效率。

3.4 棉籽粕替代豆粕對(duì)人工瘤胃培養(yǎng)液VFA 濃度的影響VFA 是由反芻動(dòng)物發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生，主要為乙酸、丙酸和丁酸，是反芻動(dòng)物重要的能量來源之一，可為其提供吸收能量的60%～80%，VFA 也是合成乳脂和體脂的主要原料。VFA 的產(chǎn)量及比例可反映反芻動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、利用能力，對(duì)于生產(chǎn)性能的充分發(fā)揮具有顯著影響。王海榮等研究發(fā)現(xiàn)，豆粕較棉籽粕能產(chǎn)生更多的VFA，且乙酸/丙酸無顯著差別。本試驗(yàn)也得出類似的結(jié)論，但33%組乙酸/丙酸顯著低于對(duì)照組，這可能是由于替代比例不同。本試驗(yàn)結(jié)果提示，與豆粕相比，棉籽粕不利于瘤胃VFA 的合成。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，棉籽粕替代豆粕可提高日糧GE、NDF、ADF 消化率以及人工瘤胃培養(yǎng)液NH-N 和MCP 的濃度，但存在降低日糧CP 消化率以及人工瘤胃培養(yǎng)液pH 和總VFA 濃度的風(fēng)險(xiǎn)；本試驗(yàn)條件下棉籽粕替代日糧中33%的豆粕效果較優(yōu)。