湖羊瘤胃微生物葡聚糖酶基因IDSGluc5-31 的克隆、表達(dá)與性質(zhì)研究

李 锘，高德英，曹佳雯，孫小寶，何波,3，王佳堃，王謙*

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院奶業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310058；2.浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波 315100；3.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240)

-葡聚糖是一類由--葡萄糖殘基通過-1，3 和-1，4-糖苷鍵連接形成的線性多聚糖。作為一類非淀粉多糖（Non-Starch Polysaccharide，NSP），-葡聚糖是植物性飼料中一種重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，它粘稠性高且難降解，難以被單胃動物消化吸收利用，導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能降低及飼料利用率下降。-葡聚糖酶是指能降解-葡聚糖的一大類糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs），可作為飼料添加劑、多糖改性增溶劑等應(yīng)用于飼料和食品工業(yè)。-葡聚糖酶能夠消除-葡聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，同時，-葡聚糖的降解產(chǎn)物主要是聚合度為2～5 的低聚纖維寡糖，這些功能性寡糖能作為益生元促進(jìn)消化道有益微生物的增殖，維持動物和人體健康。

目前，-葡聚糖酶主要從環(huán)境微生物中分離純化或克隆后異源表達(dá)獲取。瘤胃微生物能夠產(chǎn)生包括-葡聚糖酶在內(nèi)的碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZymes）。由于長期適應(yīng)于瘤胃特殊的生長環(huán)境，絕大多數(shù)瘤胃微生物不能被純培養(yǎng)，因此采用常規(guī)方法難以直接從中獲取-葡聚糖酶。課題組前期采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)從湖羊瘤胃微生物中發(fā)現(xiàn)436 個GH5 家族編碼基因。本研究進(jìn)一步擴(kuò)增并異源表達(dá)-葡聚糖酶基因，分析重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)、動力學(xué)參數(shù)和水解產(chǎn)物，為高效降解植物性飼料和飼用酶制劑研發(fā)建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 表達(dá)載體pET-28a（+）購自Novagen 公司；Super Pfx 聚合酶購自康為世紀(jì)公司；ClonExpressII One step Cloning Kit 購自Vazyme 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、割膠回收試劑盒購自上海生工公司；大麥葡聚糖、苔蘚地衣多糖和纖維寡糖購自Megazyme 公司；核酸與蛋白Marker、Ni-NTA agarose、卡那霉素（kanamycin，Kan）和異丙基---硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）購自上海生工公司；湖羊瘤胃內(nèi)容物樣品和原核表達(dá)宿主Escherichia coli BL21（DE3）為本實驗室保存。

1.2 重組工程菌構(gòu)建與蛋白表達(dá) 參照何波的方法提取湖羊瘤胃內(nèi)容物總RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用IDSGluc5-31-HI（5'ACAGCAAATGGGTCGCGGAT CCATGCAGCGTATCAAAATCTTAGCG3'）和IDSGluc5-31-I（5'CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTAT GCCGCAGGCGCTTCC3'）引物（下劃線為表達(dá)載體同源臂序列）和Super Pfx 聚合酶擴(kuò)增cDNA 樣品。純化后的PCR 產(chǎn)品與經(jīng)H I 和RI 雙酶切的pET-28a（+）充分混合 后，利用ClonExpressII One step Cloning Kit 進(jìn)行同源重組，BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞用于反應(yīng)產(chǎn)物的熱激轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化完成后涂布含50 μg/mL Kan 的LB 平板。37℃培養(yǎng)16～20 h 后，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR 擴(kuò)增，并提取質(zhì)粒送至上海生工公司測序。

利用1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)工程菌BL21/pET28a/表達(dá)重組葡聚糖酶，在16℃，100 r/min下孵育16 h 后，收集菌體。按本課題組前期建立的方法，進(jìn)行均質(zhì)破碎獲得粗酶液。

1.3 蛋白純化與電泳分析 將親和Ni-NTA agarose 填料按1:100 與上述粗酶液混合，加入終濃度為20 mmol/L的咪唑，冰上緩慢震蕩孵育1 h。接著利用含20～500 mmol/L 咪唑的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫目標(biāo)蛋白。之后，利用Millipore AmiconUltra 超濾柱（3 ku）去除殘余咪唑獲得純化蛋白，用于SDS-PAGE 電泳和酶譜分析。

酶譜分析是在聚丙烯酰胺凝膠中加入終濃度為0.5% 的葡聚糖或地衣多糖底物，在最適反應(yīng)條件下測 定IDSGLUC5-31 對底物的 降解活性。將20 μL IDSGLUC5-31 純化酶液與5 μL 5×SDS 上樣緩沖液充分混勻，于4℃下放置20 min。蛋白上樣量為10 μL，以BSA 為陰性對照。90 V 恒壓電泳40 min，120 V 恒壓電泳2 h。電泳結(jié)束后，將凝膠置于25%異丙醇中復(fù)性3 次，每次10 min。復(fù)性后的凝膠置于1×PBS 緩沖液中，37℃反應(yīng)過夜。用0.1%剛果紅染色20 min，之后用1 mol/L NaCl 溶液中至脫色完全。

1.4 酶學(xué)性質(zhì)分析 采用3，5 二硝基水楊酸（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS）法測定葡聚糖酶活性，采用Bradford 法測定蛋白濃度，操作方法：將20 μL IDSGLUC5-31 純化酶液（約13 μg，下同）與50 μL 0.5%葡聚糖底物充分混合，在相應(yīng)溫度或pH 條件下反應(yīng)15 min 后，加入70 μL DNS 試劑，99℃保溫10 min。冷卻至室溫后，使用SpectraMax M3 酶標(biāo)儀（Molecular Devices）測定OD，同時設(shè)置熱處理失活的酶為對照和3 組平行試驗。

1.4.1 最適溫度和熱穩(wěn)定性 測定IDSGLUC5-31 在pH6.0，20～90℃范圍內(nèi)的反應(yīng)活性，以最高活性時的溫度為最適溫度，計算各溫度條件下相對活性。熱穩(wěn)定性分析是在pH6.0 條件下，將酶液分別在40～60℃下保 溫60 min。在0、5、10、20、30、40 和60 min 取樣，pH6.0，40℃下測定葡聚糖酶活性。以反應(yīng)起始點為100%，計算各試驗組的殘余酶活。

1.4.2 最適pH 和pH 穩(wěn)定性 測定IDSGLUC5-31 在40℃，pH 2.2～10.6 緩沖液（檸檬酸/磷酸緩沖液pH 2.2～8.0；碳酸鈉/ 碳酸氫鈉緩沖液pH 8.9～10.6）范圍內(nèi)的反應(yīng)活性，以最高活性時的pH 為最適pH，計算各pH 條件下相對活性。pH 穩(wěn)定性分析是在40℃下，將酶液分別在4℃ pH 2.2～10.6 緩沖液中孵育30 min，在pH 6.0，40℃下測定葡聚糖酶活性。以反應(yīng)起始點為100%，計算各實驗組的殘余酶活。

1.4.3 金屬離子及化學(xué)試劑耐受能力 將IDSGLUC5-31 與0.1～10 mmol/L 的金屬離子（Na、Ca、Mg或Cu）或其他化學(xué)試劑（SDS 或EDTA）在4℃下保溫30 min，在pH 6.0，40℃下測定葡聚糖酶活性。以反應(yīng)起始點為100%，計算殘余酶活。

1.4.4 動力學(xué)參數(shù) 將IDSGLUC5-31 分別與0.5～10 mg/mL的葡聚糖、地衣多糖、羧甲基纖維素、微晶纖維素、磷酸溶脹纖維素、糊精或木聚糖底物充分混合，在pH 6.0，40℃下測定葡聚糖酶活性。利用GraphPad Prism 8 軟件（San Diego，CA）計算和。

1.5 底物水解分析

1.5.1 薄層色譜法（Thin-Layer Chromatography，TLC）采用TLC 法分析IDSGLUC5-31 催化葡聚糖底物的水解產(chǎn)物。將5 mg/mL 的大麥葡聚糖或地衣多糖底物置于40℃下預(yù)熱5 min，加入1 μg IDSGLUC5-31，40℃，pH 6.0 反應(yīng)0.5 h 和20 h 后分別取樣1 mL，95℃孵育30 min 終止反應(yīng)。4℃，13 000 r/min 離心30 min，取0.3 μL 反應(yīng)液或1.0 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品混合液（含葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和纖維五糖）輕輕點在薄層板（Merck 公司）上，重復(fù)上樣5 次。流動相為正丁醇:乙酸:水體積比為2:1:1，展開到距薄層板頂端1 cm 處取出，置于通風(fēng)櫥待平板充分干燥后，置入展層液中二次展開，再干燥后放入顯色液（硫酸：甲醇=5:95，v/v；0.5%-萘酚，w/v）反應(yīng)2 min，100℃ 10 min高溫顯色。

1.5.2 高效液相色譜法（High Performance Liquid Chrom atography，HPLC） 進(jìn)一步采用HPLC法分析IDSGLUC5-31催化葡聚糖底物的水解產(chǎn)物。取2 mL IDSGLUC5-31純化酶液（約120 μg）分別與5 mL 0.5%葡聚糖或0.5%地衣多糖底物混合，在最適反應(yīng)條件下孵育20 h，分別于8 h 和20 h 取樣。于95℃保溫30 min，13 000 r/min離心15 min，取上清，設(shè)置3 組重復(fù)試驗。利用Asahipak NH2P-50 4E 色譜柱（Shodex 公司）和LC-1200 高效液相色譜儀（Agilent 公司），流動相為乙腈:水=65:35，柱溫40℃，流速0.8 mL/min，采用RID-20A 時差折光檢測器分析底物水解樣品。

1.6 統(tǒng)計分析 圖片繪制和動力學(xué)分析用Graphpad Prism 8 完成，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Student's-test。* 表示差異顯著（<0.05）；**表示差異極顯著（<0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡聚糖酶序列分析 本試驗成功地從湖羊瘤胃未培養(yǎng)微生物cDNA 中擴(kuò)增得到1 個葡聚糖酶基因，其開放閱讀框長度為1 245 bp，編碼415 個氨基酸。該蛋白理論等電點為4.89，理論分子量為46.6 ku（https://web.expasy.org/compute_pi/）。SingalP 5.1和Pfam 分析顯示，IDSGLUC5-31 蛋白包含一段24個氨基酸的信號肽（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），成熟肽中包含1 個GH5 家族催化結(jié)構(gòu)域（http://pfam.xfam.org/）。同源建模分析顯示（圖1），該蛋白包含（/）桶狀催化結(jié)構(gòu)域，呈現(xiàn)GH5 家族的典型結(jié)構(gòu)特征（https://www.swissmodel.expasy.org/interactive）。

圖1 IDSGLUC5-31 蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹和BLAST 分析表明，IDSGLUC5-31與梭菌目細(xì)菌（GenBank No:SNT95308.1）來源的GH5 家族蛋白聚成一簇（圖2），氨基酸序列相似性分別為78.27%，該蛋白的功能與性質(zhì)未被研究。通過序列比對分析IDSGLUC5-31 的成熟肽與QTE70932.1、MEB6847130.1、MBD5081498.1、WP051109229.1 等具有保守的氨基酸序列，其中保守催化殘基區(qū)域E198和E332 與已報道的GH5 家族內(nèi)切葡聚糖酶的保守序列的規(guī)律一致（圖3）。

圖2 IDSGLUC5-31 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖3 葡聚糖酶氨基酸序列比對

2.2 葡聚糖酶IDSGLUC5-31 異源表達(dá)與電泳分析 利用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)重組工程菌BL21/pET28a/，粗蛋白質(zhì)經(jīng)Ni-NTA agarose 親和層析后，獲得分子量約為48 ku 的IDSGLUC5-31 蛋白（圖4-A）。進(jìn)一步通過酶譜分析發(fā)現(xiàn)，IDSGLUC5-31 能有效降解大麥葡聚糖和苔蘚地衣多糖（圖4-B 和4-C）。

圖4 IDSGLUC5-31 SDS-PAGE 和酶譜分析

2.3 IDSGLUC5-31 的酶學(xué)性質(zhì) 酶學(xué)性質(zhì)分析顯示，IDSGLUC5-31 的最適反應(yīng)溫度和pH 分別為40℃和6.0（圖5-A 和5-B）。在40℃以下較為穩(wěn)定，處理1 h 后，仍能保持79.95%的殘余活性。當(dāng)溫度上升至50℃以上，該蛋白迅速失活。50℃下處理5 min，蛋白幾乎完全失活（圖5-C）。IDSGLUC5-31 在pH 5.0～7.0 較為穩(wěn)定，處理30 min 后仍能保持70%以上活性（圖5-D）。

圖5 IDSGLUC5-31 的酶學(xué)性質(zhì)

2.4 IDSGLUC5-31 的動力學(xué)參數(shù) 活性底物譜分析顯示，IDSGLUC5-31 能高效催化大麥葡聚糖和苔蘚地衣多 糖，分別為508.7 和240.1 μmol/（min·mg）。且底物親和力較強(qiáng)，分別為1.725 和2.628 mg/mL（表1）。然而，該蛋白不能降解羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、磷酸溶脹纖維素、糊精或木聚糖。

表1 IDSGLUC5-31 動力學(xué)參數(shù)

2.5 金屬離子和化學(xué)試劑對IDSGLUC5-31 活性的影響 不同類型和不同濃度金屬離子和化學(xué)試劑對IDSGLUC5-31 活性的影響如圖6 所示，該蛋白對Na的耐受能力較強(qiáng)，經(jīng)0.1～10 mmol/L Na處理30 min后，活性幾乎沒有改變；低濃度（0.1 mmol/L）Ca、Mg或SDS 不影響IDSGLUC5-31 的催化活性。當(dāng)濃度提高至10 mmol/L 時，蛋白活性下降（<0.01）；IDSGLUC5-31 在EDTA 和Cu存在的環(huán)境中穩(wěn)定性較差，經(jīng)孵育30 min 后活性迅速下降，甚至完全失活（<0.01），且伴有蛋白析出。

圖6 金屬離子和化學(xué)試劑對IDSGLUC5-31 活性的影響

2.6 IDSGLUC5-31 水解多聚糖的產(chǎn)物分析 采用TLC法分析IDSGLUC5-31 水解地衣多糖和大麥葡聚糖的產(chǎn)物可以發(fā)現(xiàn)，IDSGLUC5-31 水解地衣多糖和大麥葡聚糖的主要產(chǎn)物為纖維二糖至纖維五糖，其中纖維三糖含量最高（圖7-A）。進(jìn)一步利用HPLC 分析IDSGLUC5-31 催化大麥葡聚糖和苔蘚地衣多糖的水解產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)：經(jīng)IDSGLUC5-31 處理20 h 后，大麥葡聚糖的水解產(chǎn)物為纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和纖維五糖，產(chǎn)量分別為0.912、0.94、0.56 和0.24 mg/mL（圖7-B）；苔蘚地衣多糖的水解產(chǎn)物也為纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和纖維五糖，產(chǎn)量分別為0.10、0.87、0.23 和0.1 mg/mL（圖7-C）。2 種底物的主要水解產(chǎn)物均為纖維三糖和纖維四糖，推測IDSGLUC5-31 是一種內(nèi)切-葡聚糖酶。

圖7 IDSGLUC5-31 水解產(chǎn)物分析

3 討 論

微生物純培養(yǎng)與無菌技術(shù)長期以來是微生物學(xué)研究的基石，但由于難以滿足來自瘤胃等極端環(huán)境微生物的生長需求，瘤胃微生物的純培養(yǎng)和相關(guān)功能基因的研究較為困難。宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄學(xué)技術(shù)改變了傳統(tǒng)純培養(yǎng)的理念，以樣本總DNA 或RNA 為研究對象，分析總微生物的功能基因與蛋白信息。Wang 等利用宏基因組學(xué)技術(shù)構(gòu)建了娟珊牛瘤胃微生物的14 000 個fosmid 文庫，獲得120 個對碳水化合物底物具有水解活性的克隆，其中降解纖維素、木聚糖、淀粉和七葉苷底物的fosmid 克隆分別有34、52、1 和33 個，共編碼575 個潛在CAZymes 或與底物轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)運(yùn)及信號傳導(dǎo)相關(guān)的功能基因。He 等利用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)從湖羊瘤胃微生物中發(fā)現(xiàn)的238 萬多個unigenes 中2.65%為糖苷水解酶，其中與纖維素降解相關(guān)的功能基因主要分布于GH3、5 和9 家族。這些研究表明，瘤胃微生物基因資源非常豐富，利用多組學(xué)技術(shù)能有效篩選、獲取CAZymes。

本研究從湖羊瘤胃微生物cDNA 中獲得的葡聚糖酶IDSGLUC5-31 的底物特異性好，對大麥葡聚糖酶、地衣多糖的催化活性和底物親和力均較高，然而，該蛋白的熱穩(wěn)定性不佳，在40?C 以上孵育后迅速失活。由于反芻動物瘤胃溫度通常為38～41?C，推測IDSGLUC5-31 的反應(yīng)溫度可能是與消化道環(huán)境溫度相適應(yīng)的結(jié)果。為便于運(yùn)輸、提高適口性和飼料轉(zhuǎn)化率，飼用酶制劑在工業(yè)化生產(chǎn)中需要進(jìn)行飼料制粒。根據(jù)制粒對象和工藝的不同，制粒溫度需達(dá)到80～90?C 甚至130?C 以上。而IDSGLUC5-31 在50℃下處理后就快速失活，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此，后續(xù)可以通過定向進(jìn)化、分子環(huán)化等酶工程手段進(jìn)一步提升其熱穩(wěn)定性。

植物性飼料經(jīng)糖苷水解酶處理后，可以降解細(xì)胞壁中的NSPs，消除其抗?fàn)I養(yǎng)作用，對肉雞、豬等單胃動物甚至奶牛、綿羊等反芻動物均具有促生長或提高生產(chǎn)性能的作用。本研究中，IDSGLUC5-31 可以催化大麥葡聚糖和苔蘚地衣多糖生成纖維三糖和纖維四糖，提示是一種內(nèi)切-葡聚糖酶。IDSGLUC5-31 一方面消除植物性飼料中葡聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，另一方面產(chǎn)生的低聚寡糖可以作為益生元促進(jìn)動物消化道中雙歧桿菌和乳酸菌等有益菌的定植，進(jìn)而維持動物機(jī)體健康。

4 結(jié) 論

本研究將湖羊瘤胃微生物來源的葡聚糖酶基因進(jìn)行異源表達(dá)獲得重組蛋白IDSGLUC5-31。該蛋白的最適反應(yīng)溫度和pH 分別為40℃和6.0，且在40℃以下或pH5.0～7.0 內(nèi)較為穩(wěn)定，對0.1～10 mmol/L Na、0.1～1 mmol/L Ca或Mg表現(xiàn)較強(qiáng)耐受能力。此外，IDSGLUC5-31 能催化大麥葡聚糖或苔蘚地衣多糖生成纖維三糖和纖維四糖。本研究的結(jié)果為從瘤胃微生物中挖掘新型CAZymes 提供參考，并為研發(fā)飼用酶制劑和制備功能性寡糖建立基礎(chǔ)。