維生素E 對(duì)驢精液冷凍保存效果的影響

韓迎雪，高鵬，李楠，曾申明

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

精液冷凍保存技術(shù)使家畜優(yōu)秀種質(zhì)資源的傳播與保存不受限制。目前，精液冷凍保存技術(shù)在驢產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。大量研究表明，冷凍保存后的精子活力和存活率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于新鮮精子，在冷凍過(guò)程中除了受到冷休克、冰晶體的形成和滲透壓變化外，精子細(xì)胞在冷凍過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），過(guò)量的ROS 和不飽和脂肪酸產(chǎn)生過(guò)氧化反應(yīng)，破壞精子細(xì)胞膜，使精子在冷凍保存過(guò)程中易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)并產(chǎn)生過(guò)量ROS 造成其質(zhì)膜和DNA 完整性遭到破壞，易形成低溫打擊，導(dǎo)致解凍后的精子存活率低、人工授精受胎率不高，從而限制了驢精液冷凍保存技術(shù)的廣泛推廣應(yīng)用。在稀釋液中加入抗氧化劑能有效保護(hù)精子在冷凍保存過(guò)程受氧化損傷，保護(hù)精子并提高其活力。

維生素E 又稱(chēng)-生育酚，不濃于水，也不易被酸、堿破壞，是哺乳動(dòng)物中一種重要的抗氧化物質(zhì)。維生素E 能與細(xì)胞膜磷脂雙層膜結(jié)合減少膜的氧化損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化，還可調(diào)節(jié)精子內(nèi)ROS 濃度，進(jìn)而保護(hù)精子質(zhì)膜和線(xiàn)粒體的完整性。Bansal 等證實(shí)維生素E在冷凍牛精液中可以降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平。羅海玲等研究發(fā)現(xiàn)在綿羊精液稀液中添加維生素E 可有效保護(hù)精子頂體，減少頂體酶的泄露，從而提高精子活力，降低冷凍對(duì)精子的損傷，提高綿羊冷凍精液質(zhì)量。鄭自華等研究發(fā)現(xiàn)在馬精液稀釋液中添加維生素E 能提高冷凍后精子活力、頂體完整率和體外存活時(shí)間。但是在驢精液稀釋液中添加維生素E 的報(bào)道還相對(duì)較少，有必要進(jìn)一步研究在精液冷凍稀釋液中不同濃度維生素E 對(duì)驢精液冷凍保存效果的影響，為提高其在驢精液冷凍保存稀釋液中的廣泛應(yīng)用提供實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)公驢為6 頭3～7 歲有生育能力的德州黑驢，健康無(wú)疾病，體重在400 kg 左右。種公驢在國(guó)家黑毛驢繁育中心單舍飼養(yǎng)，自由采食、飲水，并每天在遛驢場(chǎng)至少運(yùn)動(dòng)30 min。實(shí)驗(yàn)?zāi)阁H為在國(guó)家黑毛驢繁育中心隨機(jī)挑選的40 頭健康成年有生育能力的空懷母驢，發(fā)情周期正常，無(wú)生殖疾病，年齡在2～5 歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 葡萄糖（G7021）、乳糖（L2643）、棉子糖（R0250）、檸檬酸鈉（C8532）、檸檬酸鉀（C3029）、HEPES 試劑（H0527）、-脯氨酸（V900338）、二甲基甲酰胺（D4551）、脫脂奶粉（LP0031）、維生素E（T3634）、FITC-PNA（L7381）均購(gòu)自默克集團(tuán)；青霉素（030012659）購(gòu)自河北遠(yuǎn)征藥品公司；鏈霉素（H20054140）購(gòu)自深圳華藥南方制藥公司；線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC-1（c2006）、鈣離子熒光探針（S1060）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HBSS（H1046）、精子DNA 染色試劑盒（A8120）均購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司。

1.3 精液預(yù)處理及冷凍精液的制作 用假陰道法采集公驢精液，采集到精液后立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行初步鏡檢，選擇無(wú)異味、精子形態(tài)正常和活率≥80%的精液，緩慢加入精液稀釋液中，稀釋液抗凍保護(hù)劑為5% 的DMF，另外分別添加0%、1%、2%、4% 和6% 的維生素E，輕輕上下顛倒幾次使精子與稀釋液充分混合。稀釋后的精液被分裝0.5 mL 細(xì)管中，每根細(xì)管約含有2.5×10個(gè)精子，移至4℃平衡柜中平衡2 h。取出平衡后的凍精細(xì)管，放到精子程序化冷凍儀中，設(shè)置好降溫曲線(xiàn)，進(jìn)行精液冷凍。解凍時(shí)將凍精細(xì)管至于38℃水浴鍋30 s 以上，使用計(jì)算機(jī)輔助精子活力分析分別觀察和記錄每組精子的精子總運(yùn)動(dòng)率（TM）、直線(xiàn)前進(jìn)運(yùn)動(dòng)率（PM）、曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)速度（VCL）、平均路徑速度（VAP）、直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)速度（VSL）等運(yùn)動(dòng)參數(shù)，至少觀察5 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)平均值。其中，冷凍基礎(chǔ)稀釋液A 液：16 g 脫脂奶粉溶解于200 mL 超純水中。B 液：葡萄糖10 g、乳糖0.6 g、棉子糖0.6 g、檸檬酸鈉0.12 g、檸檬酸鉀0.164 g、HEPES 2.984 g、脯氨酸0.921 04 g；滅菌超純水定容至200 mL。將制備好的A 液和B 液混合后充分混勻，在115℃高壓滅菌15 min，室溫冷卻后加入0.017 5 g青霉素和0.021 g 鏈霉素，放置于4℃冰箱保存。

1.4 畸形率 將顯微鏡放大倍數(shù)調(diào)至200×，恒溫臺(tái)溫度調(diào)至37℃，打開(kāi)計(jì)算機(jī)輔助精子活力分析儀，用移液槍取7 μL 精液滴放在預(yù)熱載玻片上，蓋好載玻片，使精子均分分布。將載玻片放在連接精子活力分析儀的顯微鏡下，記錄正常精子數(shù)、畸形數(shù)，更換視野重新統(tǒng)計(jì)，每個(gè)樣品統(tǒng)計(jì)至少5 個(gè)以上視野，統(tǒng)計(jì)平均值。

1.5 質(zhì)膜完整性 采用低滲試驗(yàn)檢測(cè)膜完整性和精子活力強(qiáng)弱。低滲濃液成分含有枸櫞酸鈉、-果糖和超純水。取出凍精細(xì)管，把其中的精液注入離心管中，在38℃水浴鍋中放置10 min，待活力恢復(fù)后檢測(cè)。觀察和記錄卷尾精子數(shù)和總精子數(shù)，每個(gè)視野精子數(shù)不少于200個(gè)，至少連續(xù)觀察5 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)平均值。

1.6 頂體完整性 使用花生凝集素異硫氰酸熒光素雙染色來(lái)評(píng)估頂體完整性。將DMEM 培養(yǎng)液和冷凍精液在38℃水浴鍋中預(yù)熱，取FITC-PNA 加入DMEM 培養(yǎng)液充分混勻，避光操作。將精液加入DMEM 培養(yǎng)液顛倒混勻，1500 r/min 離心4 min，棄除上清。在沉淀精子中加入工作液，避光孵育15 min，最后，1 500 r/min離心4 min，棄除上清。加入預(yù)熱的DMEM 培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻后，1 500 r/min 離心4 min，棄除上清。重復(fù)上一步操作一次，最終加入洗滌液待測(cè)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，X 軸通道ECG（紅光），Y 軸通道FITC（綠光），頂體完整精子的頭前部則發(fā)出明亮綠光，頂體損傷精子的頭前部發(fā)光區(qū)域不完整或不發(fā)光。

1.7 線(xiàn)粒體膜電位 本試驗(yàn)采用線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)精子線(xiàn)粒體膜電位，根據(jù)說(shuō)明書(shū)詳細(xì)操作步驟進(jìn)行操作。

1.8 DNA 完整性 本試驗(yàn)用吖啶橙法檢測(cè)DNA 完整性，試劑盒為索萊寶公司提供，根據(jù)說(shuō)明書(shū)詳細(xì)操作步驟進(jìn)行操作。

1.9 線(xiàn)粒體鈣含量 采用鈣離子熒光探針檢測(cè)線(xiàn)粒體鈣含量，具體步驟為：將精液樣品并加入HBSS 溶液顛倒混勻，1 500 r/min 離心4 min，棄除上清；加入工作液，輕輕吹打，避光孵育，1 500 r/min 離心4 min，棄除上清；加入HBSS 溶液，輕輕吹打，1 500 r/min 離心4 min，棄除上清；重復(fù)上步操作一次，最終加入HBSS 溶液，調(diào)節(jié)精子密度至1×10/mL，室溫孵育待測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)luo-4 可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm 左右，發(fā)射波長(zhǎng)為512～520 nm。流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度,檢測(cè)細(xì)胞數(shù)不少于10 000 個(gè)，以平均熒光強(qiáng)度值表示線(xiàn)粒體中Ca濃度。

1.10 人工授精 人工授精試驗(yàn)分為鮮精組和凍精組，分別對(duì)70 頭和40 頭母驢進(jìn)行同期發(fā)情處理。試驗(yàn)當(dāng)天（第0）每頭母驢注射1 mL 促性腺激素釋放激素（Gonadotrophin Releasing Hormone，GnRH）類(lèi)似物；在第2 天，將陰道栓埋植在陰道穹窿內(nèi)；在第8 天，每頭母驢肌肉注射4 mL 前列腺素（Prostaglandin，PG）；在第11 天，取出陰道栓，同時(shí)每頭母驢肌肉注射4 mL PG，撤栓后第5 天內(nèi)，每天08:00—10:00 用B 超隔直腸壁檢測(cè)和記錄卵泡發(fā)育情況，當(dāng)母驢優(yōu)勢(shì)卵泡直徑>30 mm 時(shí)被視為進(jìn)入發(fā)情期。當(dāng)母驢優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)到30 mm 以上時(shí)肌肉注射GnRH 類(lèi)似物1 mL，22 h 后檢查卵泡排卵情況，對(duì)已經(jīng)排卵的母驢輸入鮮精或冷凍精液4 支，每支含有約1.2 億有效精子，而沒(méi)有排卵母驢在GnRH 類(lèi)似物注射后34 h 輸精4 支。輸精結(jié)束后每頭母驢注射2 mL 的縮宮素，加速子宮蠕動(dòng)，促進(jìn)精子運(yùn)行。母驢輸精后15 d 用直腸超聲波檢查妊娠狀態(tài)，如果子宮內(nèi)出現(xiàn)胚泡，則統(tǒng)計(jì)為妊娠，否則統(tǒng)計(jì)為空懷。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPASS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)后，用單因素方差分析（ANOVA）比較組間差異，當(dāng)<0.05 時(shí)，表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 在稀釋液中添加不同濃度維生素E 對(duì)精子解凍后運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響 由表1 可知，當(dāng)添加1% 維生素E 時(shí)，與對(duì)照組相比精子的TM 和PM 有一定的增加（>0.05）；當(dāng)添加2% 維生素E 時(shí)，PM、TM、VCL、VAP、VSL均顯著高于其他組；當(dāng)維生素E 濃度升為4%和6%時(shí)，PM 和TM 逐漸下降，但較對(duì)照組仍有一定提高（>0.05）。

表1 稀釋液中添加不同濃度維生素E 對(duì)驢精子冷凍解凍后運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響

2.2 在稀釋液中添加不同濃度維生素E 對(duì)驢精子解凍后各功能參數(shù)的影響 由表2 可知，稀釋液中添加維生素E 可降低驢冷凍解凍后精子的畸形率，提高了冷凍解凍后的頂體完整率、DNA 完整率、線(xiàn)粒體膜電位和鈣離子含量，其中2%維生素E 組效果明顯，與其他組差異性顯著（<0.05）。但當(dāng)維生素E 濃度繼續(xù)增加時(shí)，畸形率開(kāi)始升高，頂體完整率、DNA 完整率、線(xiàn)粒體膜電位、鈣離子含量則開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但是與對(duì)照組相比仍有差異。在稀釋液中添加不同濃度維生素E 時(shí)對(duì)冷凍解凍后精子質(zhì)膜完整率的影響不顯著。

表2 稀釋液中添加不同濃度維生素E 對(duì)驢精子冷凍解凍后各功能參數(shù)的影響

2.3 驢冷凍精液輸精后的妊娠結(jié)果 根據(jù)以上結(jié)果，分別用鮮精和添加2% 維生素E 組冷凍精液進(jìn)行人工授精試驗(yàn)。鮮精組70 頭母驢經(jīng)同期發(fā)情處理后，在第12～16 天用超聲波觀察母驢卵泡發(fā)育情況。結(jié)果如表3所示，5 d 內(nèi)發(fā)情母驢頭數(shù)為60 頭，發(fā)情率為85.7%。發(fā)情母驢按照設(shè)計(jì)方案進(jìn)行人工授精，共輸精60 頭，在授精后15 d 用超聲波檢查妊娠狀態(tài)，其中11 頭妊娠，妊娠率為45%。冷凍精液組40 頭母驢經(jīng)同期發(fā)情處理后，在第12～16 天用超聲波觀察母驢卵泡發(fā)育情況，結(jié)果顯示，5d 內(nèi)發(fā)情母驢頭數(shù)為32 頭，發(fā)情率為80.0%。發(fā)情母驢按照設(shè)計(jì)方案進(jìn)行人工授精，共輸精32 頭，在授精后15 天用超聲波檢查妊娠狀態(tài)，其中11頭妊娠，妊娠率為34.4%。結(jié)果顯示，冷凍精液組受胎率較鮮精組相比差距不大。

表3 母驢同期發(fā)情和人工輸精結(jié)果

3 討 論

新鮮精液中富含豐富的抗氧化酶可以抵抗冷凍保存初期的氧化作用，但是隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，這些抗氧化酶會(huì)逐漸失效，因此需要額外添加抗氧化劑緩解精子的過(guò)氧化，從而提高保存效果。本研究發(fā)現(xiàn)在凍精稀釋液中添加不同濃度維生素E 能顯著提高精子解凍后活力、線(xiàn)粒體膜電位、頂體完整率、DNA 完整率，降低畸形率，與對(duì)照組相比差異顯著。隨著維生素E 濃度的提高，精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)逐漸升高后降低，添加2%維生素E 時(shí)效果最佳，表明維生素E 的添加對(duì)驢精液冷凍保存有一定保護(hù)作用。

維生素E 主要通過(guò)抗氧化作用提高精子的冷凍保存效果。精子質(zhì)膜富含多不飽和脂肪酸，在精子冷凍過(guò)程中，精子本身和精清中產(chǎn)生的活性氧自由基被激活，與精子質(zhì)膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，使得膜上脂質(zhì)的過(guò)氧化和脂肪酸雙鍵丟失，膜完整性喪失、精子活力下降，最終導(dǎo)致精子畸形率上升，質(zhì)膜完整率和頂體完整率下降。另外ROS 含量過(guò)高會(huì)造成精子DNA 雙鏈斷裂，DNA 出現(xiàn)碎片化，DNA 完整率降低。精子對(duì)低溫比較敏感，冷凍過(guò)程中精子獲能和運(yùn)動(dòng)時(shí)容易發(fā)生線(xiàn)粒體功能障礙，從而引起線(xiàn)粒體膜電位和鈣離子含量的下降，供能（ATP）不足。上述精子功能指標(biāo)均會(huì)影響精子質(zhì)量，最終影響受胎率。維生素E 作為多酚類(lèi)化合物，其分子中含有多個(gè)活性羥基和羧基，能提供氫自由基來(lái)有效消除ROS 和羥基自由基，從而避免發(fā)生氧化反應(yīng)，有效減少精子的氧化損傷，維持精子結(jié)構(gòu)和功能完整性；另一方面維生素E 的抗氧化性可能通過(guò)清除氫、氧自由基來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，在冷凍稀釋液中添加 2%的維生素E 可顯著提高精子的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)和功能參數(shù)，表明維生素E 可能通過(guò)抑制氧自由基的形成阻止誘發(fā)膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，從而對(duì)精子起到保護(hù)作用。另外本實(shí)驗(yàn)在精液稀釋液中添加DMF 作為冷凍保護(hù)劑，DMF 是一種無(wú)色透明的液體，可作為抗凍保護(hù)劑用于精液冷凍保存。同時(shí)DMF 是一種低分子量化合物，可以更頻繁地通過(guò)精子質(zhì)膜，減少精子暴露于高滲環(huán)境的時(shí)間，從而減少氧化應(yīng)激。

本實(shí)驗(yàn)中維生素E 對(duì)精子的冷凍保護(hù)效果并沒(méi)隨著添加濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，濃度超過(guò)2%后，凍后精子各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均有所下降，這可能與過(guò)量添加維生素E 會(huì)降低冷凍稀釋液的滲透性有關(guān)。當(dāng)精液滲透壓超過(guò)一定范圍，精子會(huì)出現(xiàn)脫水、腫脹等現(xiàn)象，發(fā)生不同程度的損傷，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和頂體完整性等會(huì)遭到破壞，降低精液品質(zhì)。本研究中，2%維生素E 添加對(duì)冷凍精子的保護(hù)效果最佳，可能同該添加濃度下精液滲透壓最適宜相關(guān)，也說(shuō)明研究精液冷凍保護(hù)劑時(shí)需要仔細(xì)考慮不同劑量對(duì)上述因素的影響。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在德州驢精液冷凍過(guò)程中，稀釋液中添加維生素E 能有效提高冷凍解凍后的精子運(yùn)動(dòng)學(xué)參數(shù)，改善畸形率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線(xiàn)粒體膜電位等功能參數(shù)，并且輸精后可以獲得理想的受胎率，其中維生素E 濃度2%為最佳，之后隨著維生素E 濃度的提高，效果逐漸下降，但仍高于對(duì)照組。