TLR4基因多態(tài)性及細(xì)胞因子與牙周炎、COPD的相關(guān)性分析

張曉姣 于慧 林梅 桂楓 王左敏

牙周炎（Chronic Periodontitis）是由菌斑微生物引起的感染性疾病，臨床特征包括牙齦出血，牙周袋形成，進(jìn)行性附著喪失和牙槽骨吸收，是我國成人失牙的主要原因之一。慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征，發(fā)病機制尚不完全明了的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，患病率和病死率較高。近年來，越來越多的研究表明牙周炎是COPD的一個獨立危險因素。COPD患者的牙周組織炎癥比非COPD患者嚴(yán)重，重癥COPD患者的牙周程度也相對更重[1]。牙周狀況惡化是肺功能快速下降的危險因素[2～4]。

Toll樣受體 4（Toll-like recepotors）主要識別絕大多數(shù)革蘭陰性細(xì)菌的脂多糖（lipopolsaccharides，LPS），誘導(dǎo)產(chǎn)生過多的炎性因子如白細(xì)胞介素（IL-1β、IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α），引發(fā)過強炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致組織損傷。研究證實，TLR4 rs1927907、rs11536889基因多態(tài)性是慢性牙周炎發(fā)展的危險因素[5]。TLR4 rs1927907的牙周炎患者與健康者相比更加易感COPD[6]。本研究通過觀察TLR4 rs1927907、rs11536889 基因多態(tài)性與慢性牙周炎及COPD炎性通路中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平的相關(guān)性，為進(jìn)一步闡明慢性牙周炎與COPD的共同基因易感機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象2012年1月～2013年4月從首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院招募研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：漢族；口腔內(nèi)存留牙不少于15顆；受試前未接受牙周治療；無其他慢性疾??；入選前4周無感冒、發(fā)燒及其他部位炎癥性病變；近半年內(nèi)未使用抗生素、免疫抑制劑。簽署知情同意書。共納入210例，男141例，女69例，年齡62.75～72.21歲，慢性牙周炎患者81例，COPD患者27例，慢性牙周炎伴COPD患者76例，健康對照者26例。見表1。

表1 各組研究對象的一般情況[n（%）]

1.2 牙周健康狀況檢查檢查受試者口腔內(nèi)所有牙齒的牙周探診深度(probing depth，PD)，牙周附著喪失 (attachmentloss，AL)，齦溝出血指數(shù) (sulcubleeding index，SBI)，菌斑指數(shù) (plaque index，PLI)，松動度和骨吸收程度，所有檢查均由2名牙周專業(yè)醫(yī)生完成。

1.3 肺功能檢測呼吸健康狀況檢查：根據(jù)2011年GOLD和我國COPD診治指南（2013年修訂版）[7，8]，確定肺功能是診斷COPD的金標(biāo)準(zhǔn)，通過支氣管舒張劑吸入實驗測定受試者第1秒用力呼氣容積/用力肺活量比值(FEV1/FVC)。比值＜70%可診斷為COPD。

1.4 外周血收集和基因組DNA的提取抽取受試者前臂靜脈血4ml，EDTA抗凝，于-20℃凍存。靜脈血樣本冰上解凍，離心后取沉淀白細(xì)胞，加10%SDS、ES和蛋白酶混勻，37℃過夜。離心后取上清，氯仿離心抽提，無水乙醇析出DNA，70%乙醇洗滌DNA后，轉(zhuǎn)移到Ependoff管，晾干，加緩沖液于-80℃凍存。

1.5 基因型測定應(yīng)用美國ABI公司7900HT聚合酶鏈反應(yīng)儀，使用TaqMan MGB探針法對受試者進(jìn)行基因型測定。反應(yīng)體系:PCP總反應(yīng)體積25μl，DNA模板 0.5μl，2.5μl TaqMan universal PCR master mix 2×（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA），0.125μl 40×TaqMan genotyping assay mix，超純水 1.875μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min ，95℃變性15s，60℃退火 1min，共50個循環(huán)，然后使用SDS2.3分型軟件進(jìn)行基因型區(qū)分。對部分樣本進(jìn)行重復(fù)實驗以確保分型的準(zhǔn)確性，結(jié)果沒有差別。

1.6 IL-1β、IL-6、TNF-α的檢測抽取受試者前臂靜脈血，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆谩０凑誆LISA試劑盒（Human IL-1βELISA Kit， Human IL-6 ELISA Kit，Human TNF-αELISA Kit，CUSABIO 公司）說明書，受試前將血清及試劑盒放置室溫，采用雙抗體夾心法，操作按照說明書，分別檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。各組間基因型和等位基因的頻率分布用χ2檢驗。方差分析法、獨立樣本t檢驗分析各組基因型與炎性因子水平關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLR4基因型和等位基因頻率的分布四組中，TLR4多態(tài)性位點基因型和等位基因的頻率無顯著性差異（P＞0.05），見表2、3。

2.2 四組受試者血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平檢測四組受試者血清IL-1β、IL-6、TNF-α濃度如圖1所示，統(tǒng)計分析顯示健康組與其余三組炎性因子濃度之間均有顯著性差異(P＜0.01)。

2.3 TLR4 rs1927907、rs11536889基因多態(tài)性與血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的相關(guān)關(guān)系將受試者進(jìn)一步分組，rs11536889野生型(GG)、雜合突變體和純合突變體(GC+CC)。采用獨立樣本t檢驗，分析炎性因子水平的差異。牙周炎組，rs11536889 GG基因型患者血清中的TNF-α水平低于GC+CC基因型患者(P=0.038)。慢性牙周炎伴COPD組，rs11536889 GG基因型患者血清中的IL-6水平顯著高于GC+CC基因型患者(P=0.006)。其余各組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見圖 2、3。

表2 TLR4 rs1927907基因型和等位基因頻率[n（%）]

表3 TLR4 rs11536889基因型和等位基因頻率[n（%）]

圖1 四組人群血清IL-1β、IL-6、TNF-α濃度比較

圖2 四組人群rs1927907基因型與血清IL-1β、IL-6、TNF-α濃度比較

圖3 四組人群rs11536889基因型與血清IL-1β、IL-6、TNF-α濃度比較

3 討論

遺傳易感性在牙周炎和COPD的發(fā)病中均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，二者可能存在共同的基因易感機制。近年來對TLR單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)的研究越來越多，主要考慮因素是TLR SNP可能降低TLR配體的反應(yīng)效能，從而影響感染性疾病的易感性[9]。主要功能 性 SNP 包括 TLR4 Asp299gly、Thr399Ile12 和rs1927907、rs11536889 等[10]。其中，TLR4 rs1927907位于內(nèi)含子區(qū)。內(nèi)含子區(qū)多態(tài)性可能通過選擇性剪接調(diào)控基因的表達(dá)。TLR4 rs11536889位于3'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)，影響mRNA的轉(zhuǎn)錄或穩(wěn)定性，進(jìn)而可能影響氨基酸合成或蛋白表達(dá)。但是多篇文獻(xiàn)研究結(jié)果不盡相同，提示基因的分布規(guī)律與種族及地域的差異等有關(guān)。

在亞洲人群中，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)日本人群的 TLR2、TLR4 9個基因多 態(tài) 性 位點中，TLR4 rs11536889存有顯著差異，并且發(fā)現(xiàn)該位點的CC基因頻率在中、重度牙周炎患者中較高[11]。在中國人群中，TLR4 rs11536889、rs1927907基因多態(tài)性與多種全身系統(tǒng)疾病相關(guān)，如2型糖尿病、牙周炎、COPD 等[5，6，12]。前期課題團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中 TLR4 rs11536889 GG 基因型頻率在重度牙周炎組患者中顯著高于中度牙周炎組。說明攜帶GG基因型的患者更易發(fā)展成為重度牙周炎。單倍型 G-C-G rs1927907-rs11536889-rs7873784 是牙周炎的危險因素之一[5]。研究團(tuán)隊進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TLR4 rs1927907位點的基因型分布及等位基因頻率分布顯著不同（P=0.039），CP（AA：26，8.5%，AG：109，35.5%，GG：172，56.0%）和 CP 與 COPD（AA：41，12.0%，AG：143，41.7%，GG：159，46.4%）。調(diào)整年齡、性別、吸煙狀況和口腔衛(wèi)生習(xí)慣后，發(fā)現(xiàn)TLR4 rs1927907中攜帶AG基因型的CP患者比攜帶GG基因型的患者更容易罹患COPD（P=0.005，OR=1.94， 95%CI 1.22～3.03）。綜上所述，TLR4 基因多態(tài)性在CP和COPD的常見病理生理過程中發(fā)揮作用，表明攜帶TLR4 rs1927907基因多態(tài)性的CP患者可能更容易罹患COPD[6]。

前期研究結(jié)果是基于基因型的分析。本研究檢測了多態(tài)性對細(xì)胞因子分泌的作用。本研究結(jié)果顯示：四組中，沒有發(fā)現(xiàn)TLR4 SNP基因型和等位基因的頻率有顯著性差異，均為P＞0.05。四組受試者血清IL-1β、IL-6、TNF-α濃度有顯著性差異，均為P＜0.05，說明了疾病狀態(tài)對細(xì)胞因子的影響。牙周炎組中，rs11536889 GG組患者血清中TNF-α水平低于GC+CC組。慢性牙周炎伴COPD組中，rs11536889 GG基因型患者血清中IL-6水平顯著高于GC+CC組。提示在牙周炎組和慢性牙周炎伴COPD組中，TLR4 rs11536889基因型多態(tài)性與TNF-α、IL-6的表達(dá)有關(guān)，可能增強了機體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

本研究從細(xì)胞因子角度初步探討了TLR4基因多態(tài)性影響牙周炎及COPD易感性的發(fā)病機制。但是一方面納入的樣本量相對較少，另一方面由于病原體感染后人體內(nèi)免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，可能是多個基因位點相互關(guān)聯(lián)性調(diào)控，并且受微生物、環(huán)境、精神壓力等其他混雜因素協(xié)同作用影響。為了證明TLR4基因多態(tài)性是否影響炎癥通路中下游細(xì)胞因子的分泌，在蛋白水平研究其具體機制，還需要在體外實驗和大樣本量的病例對照研究中進(jìn)一步分析。