加減知柏地黃丸治療女童中樞性性早熟的療效與雌激素受體基因多態(tài)性的關系

張國強 張文金 李金柳 陳鳳媚 張暢斌 鄭淑華 劉嘉芬 呂栩再 盧雪銀

1廣東省婦幼保健院（廣州 511442）；2廣州中醫(yī)藥大學（廣州 510006）

性早熟（precocious puberty）是指男童在9 歲前、女童在8 歲前呈現(xiàn)第二性征［1］。兒童性早熟的總發(fā)病率估計為1∶5 000 至1∶10 000［2］，其中我國女童發(fā)病率約為男童的4.5 倍［3］，已成為社會日益關注的問題?！吨形麽t(yī)結合兒科學》根據(jù)發(fā)病機理和臨床表現(xiàn)，將性早熟分為中樞性性早熟（termed central precocious puberty，CPP）、外周性性早熟（idiopathic CPP，ICPP）和部分性早熟（peripheral precociouspuberty，PPP）［4］，其中中樞性性早熟約占女孩性早熟的80%。三種類型的發(fā)生都與雌激素水平的增加有關［5］，在體內(nèi)，雌激素的作用由雌激素受體介導［6］。雌激素受體（estrogenreceptor，ER）包括ERα、ERβ 兩種亞型，ERα 是位于6q25 染色體上的ERα 基因編碼，而ERβ 是14q23-24 染色體上的ERβ 基因編碼。雌激素受體（ER）基因序列分析發(fā)現(xiàn)，ERα 和ERβ 基因中存在相當數(shù)量的等位基因單核苷多態(tài)性，其中ERα 基因第1 內(nèi)含子Xba Ⅰ（rs2234693）和Pvu Ⅱ（rs9340799）以及ERβ基因第5 外顯子RsaI（rs1256049）和第8 外顯子AluI（rs4986938）酶切位點都是當前研究熱點［7-8］。多數(shù)研究證明，ERα 基因多態(tài)性與女童性早熟的發(fā)生存在聯(lián)系，但結果存在爭議［9-10］；而關于ERβ基因多態(tài)性與女童性早熟相關研究仍較缺乏［9，11］。

服用中藥知柏地黃丸治療女童性早熟早有報道，現(xiàn)有研究已證實其有效性［12-14］。其中，女童CPP 中醫(yī)辨證以陰虛火旺型最多，多采用加減知柏地黃丸進行治療，取得了明顯的效果［1］。但是，目前經(jīng)過中醫(yī)辨證施治的CPP 患者的治療效果仍然存在差異，有部分患者療效不佳或沒有效果。其原因很可能與機體基因多態(tài)性和遺傳背景的差異有關，但目前關于加減知柏地黃丸治療女童性早熟的療效與ER 基因多態(tài)性的關系的研究十分缺乏。因此，本研究檢測接受過中醫(yī)治療的CPP女童的ER 基因多態(tài)性，探討雌激素受體基因多態(tài)性與中醫(yī)治療女童性早熟療效的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年7月至2020年1月我院中醫(yī)科門診治療的中樞性性早熟女童（除性早熟外無其他疾?。?0 例納入研究，采用加減知柏地黃丸治療，在治療6 個月后進行療效評價。根據(jù)療效將患者分為有效組（治療顯效與有效）60 例和無效組（治療無效），20 例，對所有病例進行雌激素受體基因多態(tài)性檢測。所有患者年齡7～10 歲；有效組平均年齡（8.83±1.75）歲，病程（6.25±1.42）個月；無效組平均年齡（8.92 ± 1.58）歲，病程（6.17 ±1.68）個月。兩組患兒的年齡、病程、中醫(yī)證型差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。本研究經(jīng)廣東省婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會審查通過（編號：廣東省婦幼保健院醫(yī)倫第［201601036］號），所有參與研究患者均知情同意。

表1 兩組一般資料比較Tab.1 Comparison of general data between the two groups ±s

表1 兩組一般資料比較Tab.1 Comparison of general data between the two groups ±s

組別有效組無效組χ2/t 值P 值中醫(yī)證型（例）陰虛火旺證例數(shù)60 20年齡（歲）8.83±1.75 8.92±1.58 0.204＞0.05病程（月）6.25±1.42 6.17±1.68 0.208＞0.05 6 1肝郁氣滯證40 10脾虛痰濕證14 9 3.403 0.182

1.2 病例納入標準根據(jù)2010年《性早熟診療指南（試行）》中關于中樞性性早熟的診斷標準并按研究要求制定，并同時具備以下條件：（1）確診為特發(fā)性中樞性性早熟（發(fā)病年齡≤8 歲）；（2）既往未接受過任何西藥或中藥治療；（3）無中樞神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性病變，如下丘腦、垂體腫瘤或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。

1.3 治療方法中醫(yī)根據(jù)患兒體質(zhì)采用加減知柏地黃丸治療。方藥為：生地黃15 g，澤瀉10 g，牡丹皮10 g，山茱萸10 g，山藥15 g，茯苓15 g，知母10 g，黃柏10 g，甘草6 g。每日一劑，水煎服，連續(xù)服藥半年。對入選病例按《小兒中醫(yī)體質(zhì)及健康狀況自填式問卷》進行體質(zhì)辨識，分為三個證型：陰虛火旺證、肝郁氣滯證、脾虛痰濕證。陰虛火旺證加鱉甲10 g，肝郁氣滯證則加柴胡8 g、郁金10 g、白芍10 g，脾虛痰濕證則加陳皮5 g、砂仁5 g、白術10 g等，如乳房硬結明顯則加浙貝母10 g、橘核6 g。

1.4 療效評定根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導原則》評分標準，自擬“中樞性性早熟分級量化表”，顯效：乳房縮小至青春前期，陰道分泌物消失，中醫(yī)證候?qū)W評分減少≥70%，卵泡直徑恢復正常，子宮和卵巢容積明顯縮小，骨齡增長低于年齡增長；有效：乳房明顯縮小，由Ⅲ期縮小至Ⅱ期或由Ⅳ期縮小至Ⅲ期，陰道分泌物減少或消失，中醫(yī)證候?qū)W評分減少≥50%，卵泡直徑、子宮和卵巢容積縮小，骨齡增長等同年齡增長；無效：乳房繼續(xù)發(fā)育，以上觀察指標無改善。

1.5 基因多態(tài)性檢測

1.5.1 全血基因組DNA 抽提取抗凝血2 mL，按promegaA1120 說明書操作，抽取全血基因組DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆?。用超微量分光光度計測定各樣本濃度OD260/OD280 紫外線吸收值1.75～1.80。

1.5.2 ERα 基因多態(tài)性檢測參考相關文獻設計ERα 引物，上游引物：5'-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCACC-3'，下游引物：5'-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3'，由上海百賽生物技術有限公司合成。ERαPCR體系為25 μL，其中2*MasterMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、Template 1 μL（20～100 ng）、滅菌蒸餾水9.5 μL，程序如下：預變性95 ℃3 min，94 ℃變性30 s，68 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35 個循環(huán)，循環(huán)結束后再72 ℃延伸15 min。1 個包含PvuⅡ和XbaⅠ多態(tài)性的1.3 kb 的片段被擴增。擴增完后分別行ERα基因PvuⅡ位點和XbaⅠ位點多態(tài)性分析。

1.5.3 ERβ 基因多態(tài)性檢測參考相關文獻設計ERβ 引物，ERβ RsaI 上游引物：5'-TCTTGCTTTCCCCAGGCTTT-3'，ERβ RsaI 下游引物：5'-ACCTGTCCAGAACAAGATCT-3'；ERβ AluI 上游引物：5'-TTTTTGTCCCCATAGTAACA-3'，ERβ AluI 下游引物：5'-AATGAGGGACCACAGCA-3'，由上海百賽生物技術有限公司合成。ERβ RsaI PCR 體系為25 μL，其中2*MasterMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、Template 1 μL（20～100 ng）、DMSO 0.5 μL、滅菌蒸餾水9 μL，程序如下：預變性95 ℃3 min，98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共35 個循環(huán)，循環(huán)結束后再72 ℃延伸15 min。ERβRsaI 擴增的片段為156 bp。ERβ AluI PCR 體系為25 μL，其中2×MasterMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、Template 1 μL（20～100 ng）、DMSO 0.5 μL、滅菌蒸餾水9 μL，程序如下：預變性95 ℃3 min，98 ℃變性10 s，68 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)，循環(huán)結束后再72 ℃延伸15 min。ERβ AluI 擴增的片段為307 bp。擴增完后分別行ERβ 基因RsaI 和AluI 位點多態(tài)性分析。

1.6 統(tǒng)計學方法應用R 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料表示為均數(shù)±標準差，比較用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料表示為例（%），比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ERα 基因酶切結果ERα-PvuⅡ位點酶切處理可分出3 種基因型，PvuⅡ基因型分別為PP、Pp和pp（PP 型：1 300 bp；Pp 型：1 300、850 和450 bp 三條帶；pp 型：850 和450 bp 兩條帶），見圖1。ERα-XbaI 位點酶切可分出3 種基因型，XbaⅠ的基因型分別為XX、Xx 和xx（XX 型：1 300 bp；Xx 型：1 300、910 和390 bp 三條帶；xx 型：910 和390 bp 兩條帶），見圖2。

圖1 ERα-PvuⅡ酶切結果Fig.1 Enzyme digestion results of ERα-PvuⅡ

圖2 ERα-XbaⅠ酶切結果Fig.2 Enzyme digestion results of ERα-XbaⅠ

2.2 ERβ 基因酶切結果Erβ RsaI 位點酶切處理可分出3 種基因型，RR 型：156 bp；Rr 型：156、125和31 bp 三條帶；rr 型：125 和31 bp 兩條帶，見圖3。Erβ AluⅠ位點酶切處理可分出3 種基因型，AA型：307 bp；Aa 型：307、240 和67 bp 三條帶；aa 型：240 和67 bp 兩條帶，見圖4。

圖3 ERβ RsaⅠ基因酶切結果Fig.3 Enzyme digestion results of ERβ RsaⅠ

圖4 ERβ AluⅠ基因酶切結果Fig.4 Enzyme digestion results of ERβ AluⅠ

2.3 性早熟女童治療效果與ERα-PvuⅡ的基因多態(tài)性分析性早熟女童有效組與無效組ERα-PvuⅡ基因型頻率分布與等位基因頻率分布比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 性早熟女童治療效果與ERα-PvuⅡ基因多態(tài)性分析Tab.2 Analysis of therapeutic effect of precocious puberty in girls and ERα-PvuⅡpolymorphism例（%）

2.4 性早熟女童治療效果與ERα-XbaⅠ的基因多態(tài)性分析性早熟女童有效組與無效組ERα-XbaⅠ基因型頻率分布與等位基因頻率分布比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 性早熟女童治療效果與ERα-XbaⅠ基因多態(tài)性分析Tab.3 Analysis of therapeutic effect of precocious puberty in girls and ERα-XbaⅠpolymorphism 例（%）

2.5 性早熟女童治療效果與ERβ RsaⅠ的基因多態(tài)性分析性早熟女童有效組與無效組ERβ RsaⅠ基因型頻率分布與等位基因頻率分布比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 性早熟女童治療效果與ERβ RsaⅠ基因多態(tài)性分析Tab.4 Analysis of therapeutic effect of precocious puberty in girls and ERβ RsaⅠpolymorphism 例（%）

2.6 性早熟女童治療效果與ERβ AluⅠ的基因多態(tài)性分析性早熟女童有效組與無效組ERβ AluⅠ基因型頻率分布與等位基因頻率分布比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表5。

表5 性早熟女童治療效果與ERβ AluⅠ基因多態(tài)性分析Tab.5 Analysis of therapeutic effect of precocious puberty in girls and ERβ AluⅠpolymorphism 例（%）

3 討論

兒童性早熟發(fā)生率呈現(xiàn)上升趨勢，兒童性征過早出現(xiàn)可導致其身體和心理發(fā)育障礙及引發(fā)各種社會問題，引發(fā)廣泛關注［1］。西醫(yī)主要采用促性腺激素釋放激素類似物（GnRHa）進行治療，這也是當前主要的治療選擇，但因其價格昂貴，一般家庭難以堅持。也有相關報道認為此類藥物不良反應多，每日注射容易導致多種過敏反應發(fā)生［1，15］。相對而言，中藥作為天然藥物，從胃腸消化吸收，符合人的生理狀態(tài)，具有價格便宜、藥源充足和副作用小的優(yōu)點。

中醫(yī)認為性早熟主要病機為腎陰不足，水不涵木，肝郁化火，陰虛火旺，陰不潛陽，相火妄動，病位主要在肝、腎二臟，但“見肝之病，知肝傳脾”，郁火化痰。徐雯等［16］利用加減知柏地黃丸治療CPP，結果發(fā)現(xiàn)在消除患兒胃熱熾盛、虛火上炎證候的同時，亦使提前出現(xiàn)的第二性征如增大的乳房明顯回縮，并能降低患兒提前升高的血清生殖激素，控制骨齡的繼續(xù)發(fā)育，使提前發(fā)育的卵巢和子宮有縮小的趨勢，尤其對卵巢的影響更為明顯。我院中醫(yī)科根據(jù)患兒體質(zhì)采用加減知柏地黃丸治療女童性早熟，取得了不錯效果，但治療效果仍然存在差異，有部分患者療效不佳。

本研究的結果顯示，采用加減知柏地黃丸治療女童性早熟，其療效與ERα-PvuⅡ與ERα-XbaⅠ的基因多態(tài)性沒有關系，而與ERβ RsaⅠ與ERβ AluⅠ的基因多態(tài)性有關，含RsaⅠR 基因位點與AluⅠa 基因位點性早熟女童的治療效果明顯優(yōu)于不含上述等位基因的患者?，F(xiàn)有研究［9］已證實雌激素與ER 在女童性早熟中的作用。中樞性性早熟主要是由于下丘腦一垂體一性腺軸的提前啟動引起，雌激素是該軸的靶激素。雌激素的最終效應不僅取決于雌激素本身的分泌與代謝，還與ERα、ERβ 基因突變或多態(tài)性引起的ER 敏感性增高有關［17］。雌激素與子宮、卵巢的ER 形成復合物，從而使子宮、卵巢增大，雌激素水平到峰值引發(fā)青春期的來臨，滋陰瀉火中藥可下調(diào)子宮、卵巢上ERmRNA 及蛋白表達起到治療作用［18］，這是知柏地黃丸可能的作用機制。

李明珠等［19］研究認為，ERα 基因PvuⅡ基因型、XbaⅠ基因多態(tài)性與CPP 相關。柯江維等［20］研究結果顯示，ERβ 基因的AluI 基因與性早熟差異無統(tǒng)計學意義，而RsaⅠ基因型與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。吳小華等［21］研究認為，雌激素受體α 基因XbaⅠ位點多態(tài)性與CPP 存在一定相關性，Xx 基因型最易患病，ERα 基因PvuⅡ位點多態(tài)性與CPP 的發(fā)生無明顯關聯(lián)?；虻亩鄳B(tài)性可能導致ER 的差異，影響ER 與熱休克蛋白的結合、在轉(zhuǎn)錄過程中的作用及對GnRH 的敏感性，從而導致了知柏地黃丸在不同個體的療效差異。這是本次研究結果的可能解釋，同時也從生理、生化的角度證實了中醫(yī)采用加減知柏地黃丸治療女童CPP的療效可能與ER 基因多態(tài)性有關的猜想。

本研究分析加減知柏地黃丸對女童性早熟的療效與ER 基因多態(tài)性的關系，為個體化治療女童CPP 提供了分子水平的實驗基礎和新的研究方向，同時也為進一步推廣中醫(yī)治療提供了理論支持。本研究仍存在不足：一方面，研究對象數(shù)量較少，可能使結果出現(xiàn)偏差。但相對現(xiàn)有的性早熟相關研究，本研究樣本量已多于多數(shù)研究。另一方面，本研究樣本來自我院治療的性早熟女童患者，大多數(shù)患者來自廣東地區(qū)，研究結果具有一定的地域局限性。本研究中，ERα 基因多態(tài)性不影響治療效果，但對于ERα 基因與ERβ 基因不同的多態(tài)性組合在治療效果影響中是否會有差異，目前未看到相關文獻報道，可在未來的研究中擴大標本量加以了解。本研究的資料顯示不同中醫(yī)證型性早熟女童的治療效果沒有差異，但與ER 基因多態(tài)性之間是否關系，需進一步研究。

本研究為加減知柏地黃丸治療女童性早熟療效與ER 基因多態(tài)性關系的探究提供了基礎，并為中醫(yī)治療的推廣提供了參考。為進一步驗證加減知柏地黃丸療效與基因多態(tài)性的關系，還需要前瞻性實驗對大樣本量、來自我國不同地區(qū)的性早熟女童進行研究。