miR-338-3p通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡保護(hù)急性腦梗死腦損傷

翟文慧 馮聰 陶莉 路晶凱 祝丙華

(1解放軍第三零五醫(yī)院急診科，北京 100017；2解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心急診科；3解放軍第三零五醫(yī)院醫(yī)務(wù)部)

急性腦梗死是因顱內(nèi)動(dòng)脈血管堵塞引起腦組織供血不足所致的局部腦組織缺血性壞死，具有很高的致殘率和致死率〔1〕；近年來(lái)，急性腦梗死發(fā)病率有明顯升高的趨勢(shì)〔2〕，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康；溶栓治療是其有效的治療方法，但有一定的時(shí)間窗限制〔3〕；因此，尋找新的、有效的治療手段一直是醫(yī)學(xué)界研究熱點(diǎn)。目前，急性腦梗死所致的腦組織損傷發(fā)病機(jī)制尚不明確，但與缺血、缺氧所致的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)〔4,5〕。微小RNA(miRNA)是一類高度保守的非編碼小RNA，可通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因在細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔6,7〕。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p在急性腦梗死患者血漿中表達(dá)下調(diào)，且在長(zhǎng)鏈非編碼RNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MALAT)1上調(diào)炎癥因子超敏C反應(yīng)蛋白表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮著重要的抑制作用〔8〕，但其在急性腦梗死腦組織損傷中的作用機(jī)制并不清楚。本研究在構(gòu)建急性腦梗死大鼠模型基礎(chǔ)上側(cè)腦室注射miR-338-3p激動(dòng)劑，觀察miR-338-3p對(duì)急性腦梗死大鼠腦組織損傷的影響及作用機(jī)制，以期為改善急性腦梗死腦組織損傷提供新線索。

1 材料與方法

1.1主要材料 清潔級(jí)SD雄性大鼠〔許可證號(hào)：SCXK(京)2018-0002，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所〕。miR-338-3p激動(dòng)劑(貨號(hào)：Agomir，百奧邁科生物技術(shù)有限公司)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液、放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3活性測(cè)定試劑盒、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、全蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(貨號(hào)：G3004、R0010、BC3830、T2190、BC3710、PC0020、P1200，北京索萊寶)，細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(貨號(hào)：PI495，上海碧云天)，血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1 ELISA試劑盒(貨號(hào)：WT-E4314，上海蔚霆生物科技有限公司)，兔抗鼠B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(貨號(hào)：ab32124、ab32503、ab181602，英國(guó)Abcam)。

1.2大鼠模型構(gòu)建及分組處理 采用改良Longa線栓法建?！?〕：采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，置于操作臺(tái)上以仰臥式固定；在右側(cè)頸正中處切口使頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈暴露，在頸總動(dòng)脈分叉近心開口，以尼龍魚線插入頸內(nèi)動(dòng)脈使動(dòng)脈近端血流受阻20 min。根據(jù)Zea-Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔5〕，當(dāng)術(shù)后大鼠行走時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈、左傾斜、甚至無(wú)法直立行走等特征時(shí)說(shuō)明造模成功。將建模成功的36只大鼠分為模型組、miR-NC組和miR-338-3p組，每組12只；另外，將只暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，不做插入尼龍魚線處理的12只大鼠作為假手術(shù)組。其中，miR-NC組大鼠側(cè)腦室注射以生理鹽水溶解的濃度為20 μmol/L激動(dòng)劑陰性對(duì)照5 μl，miR-338-3p組大鼠側(cè)腦室注射以生理鹽水溶解的濃度為20 μmol/L miR-338-3p激動(dòng)劑5 μl，而假手術(shù)組和模型組大鼠給予等量的生理鹽水。

1.3大鼠神經(jīng)功能評(píng)估 在術(shù)后48 h，根據(jù)Zea-Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(不能自由行走甚至意識(shí)喪失計(jì)4分，行走時(shí)向左傾斜計(jì)3分，行走時(shí)向左轉(zhuǎn)圈2分，左側(cè)前爪未能完全伸展1分，未出現(xiàn)任何異常記0分)對(duì)各組大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)估。

1.4大鼠腦梗死體積檢測(cè) 上述實(shí)驗(yàn)完成后，各組隨機(jī)選取6只大鼠行麻醉處死；取腦組織制成厚度為2 mm冠狀切片；采用2%TTC室溫染色15 min后，以4%多聚甲醛進(jìn)行固定；其中，呈白色的為梗死組織，呈紅色的為正常組織；采用Image Pro Plus 6.0軟件根據(jù)公式：梗死體積(%)=100%×(切片厚度×梗死面積)/全腦體積，計(jì)算大鼠梗死體積。

1.5大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 將各組剩余的6只大鼠麻醉處死后，留取腦組織；取適量腦組織樣品制成4 μm厚度切片后，根據(jù)TUNEL試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。

1.6大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3活性檢測(cè) 取腦組織標(biāo)本，加入裂解液充分裂解后，1 000 r/min離心15 min，收集上清液并參照Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3活性。

1.7大鼠腦組織中凋亡蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)水平檢測(cè) 取腦組織標(biāo)本，加入裂解液充分裂解后，參照全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取組織總蛋白；采用BCA法對(duì)蛋白樣品定量后，將變性蛋白行SDS-PAGE分離；電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上；以含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h后，置于一抗(1∶1 000)中室溫結(jié)合反應(yīng)2 h；封閉液洗膜后，置于辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)中室溫結(jié)合反應(yīng)2 h；以化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析大鼠腦組織中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平，其中GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行校正。

1.8大鼠腦組織中miR-338-3p表達(dá)檢測(cè) 取適量腦組織充分研磨后，采用Trizol法提取組織總RNA；采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA；以cDNA為模板根據(jù)上海生工生物工程股份有限公司合成的引物行實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，2-△△Ct法計(jì)算miR-338-3p表達(dá)水平。其中，擴(kuò)增條件為：94℃ 3 min；95℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 30 s，循環(huán)40次；引物序列為：miR-338-3p上游：5′-TGCGGTCCAGCATCAGTGAT-3′，下游：5′-CCAGTG-CAGGGTCCGAGGT-3′；內(nèi)參U6上游：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.9大鼠腦組織中炎癥因子VCAM-1和ICAM-1表達(dá)檢測(cè) 將適量腦組織標(biāo)本與9倍體積的生理鹽水混合制成10%腦組織勻漿，以1 000 r/min離心15 min，收集上清液并參照ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠腦組織VCAM-1和ICAM-1含量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能和腦梗死體積比較 模型組神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)，而miR-NC組與模型組神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組和miR-NC組比較，miR-338-3p組神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積均明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分比較

2.2轉(zhuǎn)染后各組腦組織中miR-338-3p表達(dá)水平 模型組腦組織中miR-338-3p表達(dá)水平(0.25±0.03)較假手術(shù)組(0.95±0.07)明顯降低(P<0.05)，而miR-NC組腦組織中miR-338-3p表達(dá)水平(0.23±0.02)和模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但miR-338-3p組腦組織中miR-338-3p表達(dá)水平(1.37±0.11)較模型組和miR-NC組明顯升高(P<0.05)。

2.3miR-338-3p對(duì)大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡和Caspase-3水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和Caspase-3水平均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，miR-NC組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和Caspase-3水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與miR-NC組和模型組比較，miR-338-3p組腦組織神經(jīng)凋亡率和Caspase-3水平均明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.4miR-338-3p對(duì)大鼠腦組織中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，而Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，miR-NC組腦組織中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組和miR-NC組比較，miR-338-3p組腦組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高，而Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見圖1、表3。

表2 各組腦組織細(xì)胞凋亡率和Caspase-3水平比較

1～4：假手術(shù)組，模型組，miR-NC組，miR-338-3p組圖1 Western印跡檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

表3 各組腦組織中Bcl-2和Bax蛋白水平比較

2.5miR-338-3p對(duì)大鼠腦組織中炎癥因子VCAM-1和ICAM-1表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織中炎癥因子VCAM-1和ICAM-1水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，miR-NC組腦組織中VCAM-1和ICAM-1水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組和miR-NC組比較，miR-338-3p組VCAM-1和ICAM-1水平均明顯降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組腦組織中VCAM-1和ICAM-1水平比較

3 討 論

miRNAs是一類在機(jī)體內(nèi)廣泛分布的非編碼RNA，可通過(guò)與靶基因特異性互補(bǔ)配對(duì)而發(fā)揮重要的基因調(diào)控作用，其異常表達(dá)與腦血管疾病、癲癇和腫瘤形成等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔9〕。在急性腦梗死患者中存在異常表達(dá)的miRNAs〔10,11〕，而部分miRNAs可通過(guò)調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等參與腦組織損傷〔12，13〕。miR-338-3p在急性腦梗死患者血漿中表達(dá)下調(diào)〔8〕，但其在急性腦梗死腦組織損傷中的作用并不清楚。

作為miRNAs家族成員，miR-338-3p不僅參與腫瘤細(xì)胞凋亡，而且其低表達(dá)還與神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔14,15〕。本研究結(jié)果表明，miR-338-3p過(guò)表達(dá)可通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善急性腦梗死大鼠腦組織損傷。提示，miR-338-3p在急性腦梗死腦組織損傷中起著重要的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

另外，miR-338-3p在細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。miR-338-3p可通過(guò)抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)/P38信號(hào)通路下調(diào)炎癥因子VCAM-1和ICAM-1表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)〔16〕。VCAM-1和ICAM-1是黏附分子的免疫球蛋白超家族成員，其表達(dá)升高可促進(jìn)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為炎癥巨噬細(xì)胞，分泌促炎因子，在白細(xì)胞活化、黏附和滲出等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用〔17,18〕。在急性腦梗死患者中存在著VCAM-1和ICAM-1高表達(dá)，而抑制其表達(dá)可減弱炎癥反應(yīng)，緩解腦組織損傷〔19,20〕。本研究結(jié)果表明，miR-338-3p過(guò)表達(dá)可通過(guò)降低VCAM-1和ICAM-1表達(dá)減輕其介導(dǎo)的腦組織炎癥損傷。提示，miR-338-3p可能通過(guò)減輕腦組織炎癥損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上，miR-338-3p可通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡保護(hù)急性腦梗死大鼠腦組織損傷。本研究從炎癥和細(xì)胞凋亡角度初步揭示了miR-338-3p的神經(jīng)保護(hù)作用，其具體的抗炎和抗凋亡機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討。