性別差異對(duì)小鼠抗原誘導(dǎo)型干燥綜合征模型的影響

張 靜，田倩雯，侯仕強(qiáng)，周彤彤，黃 磊，顧 芳，林 寧，魏 偉，吳華勛

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗炎免疫藥物安徽協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032；2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬滁州醫(yī)院(滁州市第一人民醫(yī)院)神經(jīng)外科，安徽 滁州 239000)

干燥綜合征(Sjogren′s syndrome， SS)是一種全身性自身免疫性疾病，主要影響外分泌腺，出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致黏膜表面嚴(yán)重干燥，臨床表現(xiàn)為口干和眼干[1-2]；也可累及肺、皮膚等其他器官[3]。目前，SS的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床暫無理想的藥物，以局部替代對(duì)癥治療為主，對(duì)SS的深入研究具有重要意義[4]。C57BL/6J小鼠是實(shí)驗(yàn)研究常用的小鼠，具有繁殖快和遺傳穩(wěn)定的特點(diǎn)，通過對(duì)其頜下腺勻漿作為抗原背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，誘導(dǎo)成為SS動(dòng)物模型[5]。SS動(dòng)物模型的研究為SS的發(fā)病機(jī)制和治療干預(yù)提供了重要實(shí)驗(yàn)方法，在SS的研究中較少涉及到對(duì)影響動(dòng)物成模的因素的研究[6]。

SS具有明顯的性別差異，男女比例約為1 ∶9[7]，提示性別差異可能影響SS的發(fā)病過程。研究人員常采用雌性動(dòng)物作為SS的動(dòng)物模型，很少采用雄性動(dòng)物，為探討性別差異對(duì)抗原誘導(dǎo)型SS模型的影響，并比較雌、雄SS動(dòng)物模型在SS樣表現(xiàn)和病理表現(xiàn)的差異，選用雌性和雄性C57BL/6J小鼠，背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射自身抗原，誘導(dǎo)小鼠SS模型，成模后對(duì)雌性和雄性小鼠的SS模型小鼠造模成功率、全身表現(xiàn)、病理評(píng)分及脾臟T、B細(xì)胞的比例進(jìn)行分析，對(duì)比雌性和雄性C57BL/6J小鼠對(duì)抗原誘導(dǎo)SS模型的成模過程以及成模效果的影響，為以后研究SS選取雌、雄動(dòng)物提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J小鼠購買自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0010。選取60只SPF級(jí)，8周左右的雌、雄C57BL/6J小鼠，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)計(jì)劃由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)同意實(shí)施(倫理審查批號(hào)：LLSC20200667)。

1.2 試劑弗氏完全佐劑(Freund′s adjuvant complete，F(xiàn)CA)(批號(hào)：F5881)，弗氏不完全佐劑(Freund′s incomplete adjuvant，F(xiàn)IA)(批號(hào)：F5506)購自美國Sigma-Aldrich公司，注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮(Zoletil50)(2020外獸藥證字06號(hào))購自法國Virbac公司；毛果蕓香堿(pilocarpine hydrochloride)(批號(hào)：ab141301)購自英國Abcam公司；流式抗體CD4(批號(hào)：553650)、IL-17(批號(hào)：560184)、RORγ(批號(hào)：562607)、CD25(批號(hào)：557192)、Foxp3(批號(hào)：560408)、CD19(批號(hào)：553785)、CD138(批號(hào)：558626)、CD27(批號(hào)：558754)購自美國BD公司。

1.3 動(dòng)物分組將雌、雄小鼠各隨機(jī)分為兩組，即雌性和雄性小鼠造模組(每組各20只)，雌性和雄性小鼠正常組(每組各10只)，共計(jì)4組。

1.4 SS模型的建立另取雌、雄C57BL/6J小鼠各4只，處死小鼠后新潔爾滅浸泡10 min，超凈工作臺(tái)上解剖小鼠，取頜下腺組織，分離黏膜和結(jié)締組織，用PBS洗凈，置于高壓滅菌后的紗布吸干多余液體，稱質(zhì)量，剪碎，每0.1 g加1 mL PBS，在冰上用研缽研磨，研磨約20 min至組織完全研碎。4 ℃離心機(jī)3 000 r·min-1離心15 min，棄上層脂質(zhì)，吸取上清液，置15 mL無菌離心管。BCA法蛋白定量后用PBS將抗原稀釋成5 g·L-1，加等量FCA，使抗原最終濃度調(diào)整為2.5 g·L-1[8]。以第一次注射抗原為d 0，d 0、7、14，模型組小鼠背部消毒后多點(diǎn)皮內(nèi)注射同性別小鼠的抗原，注射劑量為 0.1 mL·20 g-1。d 21用FIA注射加強(qiáng)小鼠免疫，注射抗原劑量和方式同前。

1.5 體質(zhì)量和全身情況觀察從造模開始d 0、d 7、d 14、d 21、d 28、d 35、d 42稱取小鼠體質(zhì)量，觀察小鼠有無舔舌，抓撓口唇、全身皮膚破損等現(xiàn)象。

1.6 唾液量造模6周后，測(cè)量所有小鼠的唾液量。測(cè)量前麻醉，小鼠肌肉注射鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮(替來他明 ∶唑拉西泮=1 ∶1)(稀釋10倍，濃度為5 g·L-1，以體重20 g的小鼠為例，肌肉注射60 μL)，完全麻醉后立刻腹腔注射0.025 g·L-1毛果蕓香堿溶液，注射劑量為0.1 mL·20 g-1[9]，注射5 min后收集唾液，將已經(jīng)稱好質(zhì)量(M1)的棉球放入小鼠口頰內(nèi)，收集10 min(注意觀察棉球是否掉落)，取出棉球分析天平上稱質(zhì)量(M2)[唾液分泌量(mg)=M2-M1]。對(duì)造模組唾液量無顯著變化的小鼠進(jìn)行剔除，計(jì)算造模成功率。

1.7 頜下腺指數(shù)和頜下腺病理d 42處死小鼠，取頜下腺稱質(zhì)量計(jì)算頜下腺指數(shù)[頜下腺指數(shù)=頜下腺質(zhì)量(mg)·小鼠體質(zhì)量(g)-1]，立即將頜下腺用4%多聚甲醛固定[10]，固定24 h后，石蠟包埋切片制作病理切片，HE染色后，顯微鏡下觀察拍照，對(duì)頜下腺組織進(jìn)行病理評(píng)價(jià)。采用Chisholm和Mason評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)，0級(jí)，無淋巴細(xì)胞浸潤；1級(jí)，輕度淋巴細(xì)胞浸潤；2級(jí)，中度浸潤，即在每4 mm2內(nèi)小于1個(gè)浸潤灶(浸潤灶是指有50個(gè)或更多的淋巴細(xì)胞)；3級(jí)，每4 mm2內(nèi)有1～2個(gè)浸潤灶；4級(jí)每4 mm2內(nèi)有2個(gè)或以上浸潤灶[11]。

1.8 脾臟T淋巴細(xì)胞分析處死小鼠后，新潔爾滅浸泡5 min 后無菌操作臺(tái)取小鼠脾臟，淋巴細(xì)胞分離液提取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，鋪板、刺激、洗細(xì)胞、表面抗體4 ℃孵育30 min、洗細(xì)胞、固定10 min、洗細(xì)胞、破膜10 min、洗細(xì)胞、胞內(nèi)抗體4 ℃孵育30 min、洗細(xì)胞、過濾網(wǎng)上機(jī)，流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞的變化。

1.9 脾臟B淋巴細(xì)胞分析提取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，加入相應(yīng)抗體4 ℃孵育30 min，清洗細(xì)胞過濾網(wǎng)上機(jī)，流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟漿細(xì)胞、記憶B細(xì)胞的變化。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 6.0軟件，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 雌性和雄性小鼠造模后體質(zhì)量及全身情況變化在SS的造模過程中，雌、雄模型組小鼠體質(zhì)量均低于同性別正常組，在d 28雌性小鼠模型組和正常組開始出現(xiàn)顯著性差異，d 35、d 42雌、雄性模型組差異均有顯著性。對(duì)比雌性模型組和雄性模型組小鼠體質(zhì)量發(fā)現(xiàn)，與同性別正常小鼠相比，雌性SS小鼠體質(zhì)量下降比雄性SS小鼠體質(zhì)量下降更早更明顯(Fig 1)。全身情況觀察顯示，從d 21起，模型組小鼠先后出現(xiàn)抓撓口唇、皮膚，舔舌等現(xiàn)象，隨時(shí)間的進(jìn)展這種現(xiàn)象越明顯，而正常組并無明顯異常，雌性SS模型組和雄性SS模型組之間差異無顯著性。

Fig 1 Changes in body weight of female and male mice

2.2 SS模型的建立，唾液量的變化及雌、雄小鼠造模成功率d 42測(cè)量所有小鼠唾液，模型組小鼠唾液量相比與同性別正常小鼠明顯下降，提示SS模型建立成功。雌性SS模型組與雄性SS模型組唾液量差異無顯著性(Fig 2)。剔除雌性和雄性模型組未成模動(dòng)物，得出雌性造模成功率為75%，雄性造模成功率為60%，對(duì)比雌性和雄性C57BL/6J小鼠造模成功率發(fā)現(xiàn)，雌性C57BL/6J小鼠比雄性更易成模(Fig 2)。

Fig 2 Saliva flow of female and male mice n=10)

2.3 頜下腺指數(shù)SS模型小鼠與同性別正常組小鼠頜下腺指數(shù)相比，SS模型小鼠頜下腺指數(shù)明顯升高，對(duì)比雌性小鼠和雄性小鼠頜下腺指數(shù)發(fā)現(xiàn)，雄性SS模型小鼠頜下腺指數(shù)明顯高于雌性SS模型小鼠，雄性正常組小鼠頜下腺指數(shù)也高于雌性正常組小鼠(Fig 3)。

Fig 3 Salivary gland indexes of female and male

2.4 頜下腺病理病理切片顯示，SS模型小鼠頜下腺組織出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤，浸潤主要出現(xiàn)在頜下腺組織的導(dǎo)管附近(黑色箭頭)，雌、雄SS模型浸潤程度差異無顯著性，正常小鼠頜下腺中無淋巴細(xì)胞浸潤(Fig 4)[12]。頜下腺病理評(píng)分結(jié)果顯示，SS模型小鼠與同性別正常小鼠頜下腺病理評(píng)分對(duì)比差異具有顯著性，雌性和雄性SS小鼠頜下腺病理評(píng)分差異無顯著性(Fig 5)。

Fig 4 Pathology of submandibular gland of female and male mice(×50)

Fig 5 Submandibular gland pathological score of femaleand male mice n=5)

2.5 脾臟T淋巴細(xì)胞小鼠脾臟流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與同性別正常組相比，雌性SS小鼠Th17(CD4+IL-17+RORγ+)細(xì)胞比例明顯升高(差異具有高度顯著性)，雄性SS小鼠差異無顯著性，雌性SS小鼠Treg(CD4+CD25+Foxp3+)細(xì)胞比例明顯降低(差異具有高度顯著性)，雄性SS小鼠明顯降低(Fig 6)。

Fig 6 Proportion of Th17 and Treg cells in spleen of female and male mice

2.6 脾臟B淋巴細(xì)胞脾臟流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與正常小鼠相比，SS模型小鼠漿細(xì)胞(CD19+CD138+)比例明顯升高，記憶B細(xì)胞(CD19+CD27+)比例明顯降低；與同性別正常小鼠比較，雌性SS模型小鼠漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞比例變化相比雄性SS小鼠差異無顯著性(Fig 7)。

Fig 7 Proportion of plasma cells and memory B cells in spleen of female and male mice

3 討論

SS是一種慢性全身性自身免疫性疾病，臨床上尚無理想的治療藥物，可能與遺傳、自身免疫、激素等多種因素有關(guān)，確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[13]。SS發(fā)病機(jī)制的研究需要合適的動(dòng)物模型，C57BL/6J小鼠SS模型與SS患者疾病狀態(tài)相似，且具有模型制備簡單、成模較快、可很好的模擬SS患者臨床表現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)[14]，常用于研究SS的發(fā)病機(jī)制、藥效學(xué)研究的動(dòng)物模型。SS性別差異明顯，臨床患者多以中年女性為主，男女比例約為1 ∶9[7]。

為探討動(dòng)物性別差異對(duì)SS模型建立的影響，采用8周左右的雌、雄C57BL/6J小鼠，通過對(duì)其背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射同批同性別頜下腺蛋白制成的抗原，誘導(dǎo)建立SS動(dòng)物模型，在第5周雌性SS模型組小鼠體質(zhì)量與正常組差異有顯著性，雄性SS模型組小鼠第6周差異出現(xiàn)顯著性，與雄性SS模型小鼠比，雌性SS小鼠體質(zhì)量下降更早，出現(xiàn)顯著性差異，可能相比雄性小鼠，雌性小鼠對(duì)炎癥反應(yīng)更強(qiáng)烈，導(dǎo)致食欲減退；造模后的第4周起，開始出現(xiàn)舔舌、抓撓口唇等現(xiàn)象；第6周測(cè)量所有小鼠唾液量，SS模型組小鼠唾液量與正常組比差異有顯著性，剔除未成模的小鼠，雌性和雄性SS模型小鼠唾液量差異無顯著性，雌性SS模型造模成功率高于雄性，這與女性患者發(fā)病率高的研究結(jié)果相符合；對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分析結(jié)果表明，與正常小鼠相比，SS模型小鼠Treg細(xì)胞和記憶B細(xì)胞比例明顯降低，Th17細(xì)胞和漿細(xì)胞比例明顯升高，提示細(xì)胞免疫和體液免疫的異常，T、B淋巴細(xì)胞的異常變化，可能與自身免疫系統(tǒng)的紊亂有關(guān)，導(dǎo)致過度自身免疫反應(yīng)，與臨床SS患者免疫系統(tǒng)異常變化結(jié)果相符合，提示SS模型的成功建立[15-17]；雌性SS小鼠Th17和Treg細(xì)胞比例變化相比雄性SS小鼠更具有統(tǒng)計(jì)意義，提示雌性SS小鼠疾病情況更加嚴(yán)重，雌性激素可能加重SS的進(jìn)展[18]；SS模型小鼠頜下腺指數(shù)明顯高于同性別正常組，從另一方面提示模型的成功建立，雄性SS小鼠頜下腺指數(shù)明顯高于雌性SS小鼠，這與性別本身差異有關(guān)，與SS病理嚴(yán)重程度無關(guān)。本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的SS小鼠模型，雌性與雄性小鼠之間的SS樣表現(xiàn)與整體病理情況存在差異，雌性小鼠更早更易于誘導(dǎo)成模，且表現(xiàn)出更顯著的SS樣表現(xiàn)和病理情況。在大多數(shù)研究中，研究人員采用雌性動(dòng)物作為SS的動(dòng)物模型，很少采用雄性動(dòng)物，在本實(shí)驗(yàn)中雄性小鼠可以誘導(dǎo)成為實(shí)驗(yàn)所需的SS動(dòng)物模型，成模率偏低，嚴(yán)重程度較雌性低，可作為對(duì)男性SS發(fā)病機(jī)制、藥效學(xué)研究的一種動(dòng)物模型。期望本文能對(duì)研究SS雄性與雌性的小鼠選擇提供新的參考依據(jù)，從而能更加全面的研究SS。