白芷提取物及其活性成分歐前胡素改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎

元明慧，姜禹辰，廉麗花，南極星，吳艷玲

(延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉 133002)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis)是一種典型與多種因素交叉的代謝性疾病，主要臨床特征是尿酸鹽結(jié)晶沉積和高尿酸血癥。根據(jù)不同的類(lèi)型和嚴(yán)重程度分為急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石關(guān)節(jié)炎和慢性痛風(fēng)石關(guān)節(jié)炎。嚴(yán)重的患者可能出現(xiàn)尿路結(jié)石、關(guān)節(jié)功能障礙、腎功能衰竭等并發(fā)癥[1-2]。目前臨床上治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的常規(guī)藥物主要包括秋水仙堿、非甾體抗炎藥等，這些藥物在使用過(guò)程中常常伴有不良反應(yīng)而限制了在臨床上的應(yīng)用[3]。因此，研究效果好、毒性低的抗痛風(fēng)藥物是目前藥學(xué)研究的重要方向之一。

白芷為傘形科植物白芷[Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f. ex Franch. et Sav，AD]的干燥根，主要含有香豆素類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、苷類(lèi)、生物堿類(lèi)等多種化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白芷具有抗菌、抗氧化、抗炎、保護(hù)神經(jīng)和鎮(zhèn)痛效果[4-5]。臨床廣泛應(yīng)用于頭痛、牙痛、風(fēng)濕痹痛、瘡瘍腫痛等病癥。有許多治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的外用中藥制劑配方中都含有白芷[6]。說(shuō)明白芷具有治療痛風(fēng)的作用，但未見(jiàn)單一用藥治療痛風(fēng)的相關(guān)報(bào)道。歐前胡素(imperatorin，IM)是白芷中一種主要的香豆素類(lèi)化合物，其藥理作用與白芷相似，具有抗癌、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗高血壓和抗菌的作用[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，歐前胡素可以減輕膠原誘導(dǎo)的大鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[8]。本文采用尿酸鈉(monosodium urate， MSU)晶體誘導(dǎo)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，觀察AD和IM對(duì)MSU誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠左踝關(guān)節(jié)腫脹度和滑膜組織中炎性浸潤(rùn)情況，以及滑膜組織中NLRP3、IL-1β、caspase-1、IL-1R1、IL-6、TNF-α含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑本實(shí)驗(yàn)所用白芷購(gòu)于延邊葉琳參茸藥品有限公司，產(chǎn)地為四川。歐前胡素購(gòu)于成都德銳可生物科技有限公司(批號(hào)：drk-1184-940126)。秋水仙堿購(gòu)于成都德銳可生物科技有限公司(批號(hào)：drk-1161-950118)。尿酸鈉購(gòu)于SIGMA公司(批號(hào)：BCBS7438)。Anti-GAPDH(ab8245)、Anti-NLRP3(ab181389)購(gòu)自Abcam；Anti-IL-1R1(sc-393998)、Anti-IL-1β(sc-32294)、Anti-IL-6(sc-28343)、Anti-caspase-1(sc-622)購(gòu)自Santa Cruz；BCA試劑盒(Beyotime)；RNA總提取試劑盒(Promega)；中性樹(shù)膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器化學(xué)成像發(fā)光顯色儀(Tanon)；全自動(dòng)倒置電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳槽、電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳槽(BIO-RAD)；水平搖床、低溫超速離心機(jī)、酶標(biāo)儀(Bio Tek)；Mastercycler PCR儀(Eppendorf)；凝膠成像分析儀(BIO-RAD)；Mini離心機(jī)、磁力加熱攪拌器(IKA)；高速冷凍離心機(jī)(HITACHI)；石蠟包埋機(jī)、轉(zhuǎn)輪切片機(jī)(Leica)。

1.3 動(dòng)物SD大鼠，♂，體質(zhì)量(200～220) g，SPF級(jí)，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(吉)2020-0010，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.4 白芷提取物的制備取白芷藥材50 g，加入75%乙醇500 mL，浸泡24 h，在80 ℃水浴中回流提取3 h，過(guò)濾，回流提取2次，收集濾液，60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏，冷凍干燥成凍干粉，即為白芷提取物。

1.5 尿酸鈉晶體(MSU)的制備將800 mg尿酸鈉和5 mL NaOH(1 mol·L-1)加入155 mL去離子水煮沸，完全溶解，攪拌降至室溫，用1 mol·L-1HCl調(diào)pH至7.0，3 000 r·min-1離心2 min，4 ℃冷卻1 h后離心，d 2抽濾，收集晶體，4 ℃保存。

1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模SD大鼠隨機(jī)分為7組，每組5只，即為正常組、模型組、AD低、高劑量組(800、1 200 mg·kg-1)、IM低、高劑量組(20、40 mg·kg-1)、秋水仙堿組(0.8 mg·kg-1Colchicine， COL)。AD和IM各組連續(xù)灌胃給藥7 d。d 7 秋水仙堿組灌胃給藥一次。d 8除正常組外，其余各組均用乙醚麻醉，將0.2 mL MSU溶液(取0.5 g MSU溶于9 mL生理鹽水加入適量吐溫充分溶解)注射到左踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)造模。24 h后，大鼠進(jìn)行安樂(lè)死，收集滑膜組織。

1.7 大鼠左踝關(guān)節(jié)腫脹度的測(cè)量每組大鼠分別在造模前(0 h)和造模后2～24 h，測(cè)量大鼠左踝關(guān)節(jié)同一部位的周長(zhǎng)，測(cè)量3次，取平均值。

1.8 Western bolt檢測(cè)滑膜組織中炎性因子的蛋白含量取滑膜組織，加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)勻漿機(jī)勻漿10 min，5 000 r·min-1離心10 min，BCA法測(cè)定蛋白含量，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行western blot檢測(cè)，測(cè)定蛋白相對(duì)含量。

1.9 RT-PCR檢測(cè)滑膜組織中炎性因子mRNA的表達(dá)用RNA提取試劑盒從滑膜組織提取總RNA，用所需的基因引物進(jìn)行RT-PCR過(guò)程，通過(guò)凝膠成像分析儀不同曝光時(shí)間進(jìn)行拍照分析。引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Primer and sequences

1.10 HE染色觀察滑膜組織病理學(xué)變化將滑膜組織多聚甲醛固定后，3%硝酸脫鈣8 d，用0.1%氨水中和1 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片后，用蘇木素和伊紅對(duì)切片進(jìn)行染色，最后在顯微鏡下觀察并采圖。

2 結(jié)果

2.1 AD和IM對(duì)MSU誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠左踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響與正常組相比，大鼠左踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹(Fig 1)，造模2 h腫脹達(dá)到高峰(P<0.05)。與模型組相比，AD、IM和COL組的大鼠左踝關(guān)節(jié)腫脹逐漸得到緩解，見(jiàn)Tab 2。

Fig 1 Left ankle joints of each group after injection of MSU 24 h

Tab 2 Effect of AD and IM on ankle swelling induced by MSU of )

2.2 AD和IM對(duì)滑膜組織病理形態(tài)的變化正常組滑膜組織中滑膜細(xì)胞排列整齊，沒(méi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組滑膜組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，并伴有纖維蛋白滲出，滑膜組織增生，滑膜層增厚；AD、IM和COL組滑膜細(xì)胞的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜組織增生均有不同程度的減輕，見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Effect of AD and IM on synovial histopathology of MSU induced gouty arthritis

2.3 AD和IM對(duì)滑膜組織中炎性因子的影響如Fig 3，4所示，與正常組相比，MSU誘導(dǎo)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的滑膜組織中NLRP3、IL-1β、caspase-1的蛋白和mRNA表達(dá)均明顯高(P<0.01)。同時(shí)促進(jìn)IL-1R1、IL-6、TNF-α蛋白或mRNA表達(dá)(P<0.01)。給予AD、IM和COL后NLRP3、IL-1β、caspase-1的蛋白和mRNA表達(dá)水平降低(P<0.01，P<0.01)，且可以降低炎性因子IL-1R1、IL-6、TNF-α的蛋白或mRNA的表達(dá)(P<0.01)。

Fig 3 Effect of AD and IM on content of NLRP3， caspase-1， IL-1β， IL-6， IL-1R1 protein

Fig 4 Effect of AD and IM on content of NLRP3， caspase-1， IL-1β， IL-6， IL-1R1， TNF-α mRNA

3 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎在臨床上以關(guān)節(jié)劇痛伴腫脹發(fā)熱暗紅為主要表現(xiàn)。白芷始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，在我國(guó)有著悠久的藥食兩用的歷史。白芷中主要含有的有效成分為香豆素類(lèi)和揮發(fā)油類(lèi)，除此之外，還含有香豆素苷類(lèi)、微量元素、多糖等多種有效成分[5]。白芷因其消腫止痛、祛風(fēng)除濕的作用，常與其他清熱解毒、消腫止痛的藥物配伍應(yīng)用與治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的外用制劑。臨床研究證實(shí)了白芷與清熱解毒、活血通絡(luò)藥物配伍治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎可起到一定的作用，有其獨(dú)特的配伍特點(diǎn)[6]。臨床及科研中單獨(dú)用白芷治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的研究少見(jiàn)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究中白芷的鎮(zhèn)痛抗炎主要成分與總香豆素和揮發(fā)油類(lèi)有關(guān)，歐前胡素是香豆素中主要的活性成分。有研究顯示，歐前胡素和β-谷甾醇聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同緩解膠原誘導(dǎo)大鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，其機(jī)制與靶向LTA、CD83和SREBF1密切相關(guān)[8]。西藥長(zhǎng)期服用不良反應(yīng)發(fā)生率高，目前還沒(méi)有解決尿酸鹽沉積這個(gè)問(wèn)題的有效治療手段。中醫(yī)學(xué)在防治痛風(fēng)方面有著長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐和大量的臨床經(jīng)驗(yàn)，療效獨(dú)特，但其藥理機(jī)制尚不明確，限制了臨床應(yīng)用和推廣。目前臨床上治療痛風(fēng)的有效藥物分為兩類(lèi)，一是促進(jìn)尿酸排泄的藥物，如苯溴馬隆、丙磺舒等；二是抑制尿酸產(chǎn)生的藥物，如秋水仙堿、非甾體抗炎藥、促腎上腺素皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素等。但這些藥物常常伴有消化系統(tǒng)損害和肝腎毒性等不良反應(yīng)[9]。本研究中選取秋水仙堿為陽(yáng)性對(duì)照藥物。結(jié)果顯示，AD和IM可以減輕MSU誘導(dǎo)大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎左踝關(guān)節(jié)腫脹程度；降低滑膜組織中炎性物質(zhì)的滲出，抑制滑膜層增厚。綜上所述，AD和IM可以有效治療MSU誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎由尿酸鈉結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周?chē)M織，并與滑膜中免疫球蛋白結(jié)合，炎癥細(xì)胞聚集引起的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促使單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-1β等多種炎性因子。尿酸鈉晶體注射踝關(guān)節(jié)腔后可導(dǎo)致受試關(guān)節(jié)周徑明顯增大，腫脹嚴(yán)重[10-11]。IL-1β被認(rèn)為是尿酸鈉結(jié)晶誘導(dǎo)炎癥的關(guān)鍵因子，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的滑膜，滑液軟骨等關(guān)節(jié)組織中大量存在[12]。IL-6主要由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎期間IL-6水平升高，可作為判斷痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的指標(biāo)[13]。TNF-α可增加中性粒細(xì)胞的募集，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞選擇素活性，使中性粒細(xì)胞和 內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子結(jié)合，為促炎癥介質(zhì)，可對(duì)局部產(chǎn)生浸潤(rùn)，導(dǎo)致炎性介質(zhì)釋放，引起關(guān)節(jié)局部出現(xiàn)紅腫熱痛等炎癥反應(yīng)[14]。NLRP3是NLRs受體家族中的重要亞族之一，主要由B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生。 NLRP3作為胞內(nèi)模式識(shí)別受體，識(shí)別病原相關(guān)分子模式和危險(xiǎn)相關(guān)分子模式。如MSU、SiO2、CPPD、胞外ATP等危險(xiǎn)信號(hào)分子，可作為配體被NLRP3識(shí)別，使NLRP3發(fā)生蛋白寡聚化，并招募銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和caspase-1，組裝成NLRP3炎性體，最終活化效應(yīng)蛋白caspase-1[15]。由此可見(jiàn)，上述炎癥因子在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因此抑制它們的產(chǎn)生并阻斷炎癥反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有重要意義。本研究結(jié)果表明，AD和IM可以顯著抑制MSU導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。綜上所述，白芷提取物和歐前胡素在抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎方面有明顯的緩解作用，可以作為治療MSU誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的有效藥物，但作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。