鹽酸氟西汀對(duì)高原腦水腫大鼠腦組織的保護(hù)作用

鄒蓓蕾，潘 菁，吳慶豐，張朋朋，石志群，田貽婷，李文斌，馬慧萍

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院1.藥劑科、2.衛(wèi)勤部，甘肅 蘭州 730050；3．中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000)

鹽酸氟西汀是一種是經(jīng)典的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin transporter，SERT)抑制劑，屬于選擇性血清素再攝取抑制劑，臨床上廣泛用于治療嚴(yán)重抑郁癥[1]。動(dòng)物研究表明，氟西汀具有神經(jīng)保護(hù)[2]、抗炎[3]、改善空間記憶及認(rèn)知[4]作用。Hu等[5]發(fā)現(xiàn)，在暫時(shí)性大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠模型中氟西汀可以調(diào)節(jié)HIF-1α-Netrin/VEGF級(jí)聯(lián)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，改善缺血性卒中后的長(zhǎng)期功能恢復(fù)。舒曉東等[6]發(fā)現(xiàn)，氟西汀通過(guò)促進(jìn)線粒體自噬，減少抑郁癥發(fā)生發(fā)展中星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡和萎縮，發(fā)揮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。孫慧等[7]發(fā)現(xiàn)，鹽酸氟西汀與尼莫地平聯(lián)合使用能夠顯著減少腦中梗死面積，改善行為學(xué)和認(rèn)知功能損傷，其機(jī)制可能與減少腦中炎癥反應(yīng)，升高BDNF水平相關(guān)。況超等[8]發(fā)現(xiàn)，氟西汀可通過(guò)減少AD小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量丟失和下調(diào)AD小鼠海馬區(qū)Ach E表達(dá)量，從而改善AD模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

經(jīng)過(guò)課題組前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究篩選，于細(xì)胞模型、動(dòng)物模型mRNA水平、蛋白水平實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)缺氧條件下SERT蛋白高表達(dá)，給藥后SERT蛋白表達(dá)減少，由此我們猜測(cè)SERT蛋白可能為治療高原腦水腫(high altitude cerebral edema,HACE)的一個(gè)靶點(diǎn)，而氟西汀作為經(jīng)典的SERT抑制劑，可能對(duì)高原缺氧損傷具有一定的保護(hù)作用；研究表明，HACE一般為炎性水腫，而氟西汀具有抗炎作用。曹琪璐等[9]發(fā)現(xiàn)，鹽酸氟西汀對(duì)缺氧PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，最佳給藥濃度為10-6mol·L-1，其作用機(jī)制可能與緩解氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，我們?cè)噲D通過(guò)大型低壓低氧模擬艙進(jìn)行HACE造模，鹽酸氟西汀灌胃給藥，研究鹽酸氟西汀對(duì)大鼠HACE模型的保護(hù)作用；同時(shí)，基于文獻(xiàn)報(bào)道的氟西汀具有促進(jìn)神經(jīng)血管生成的作用，我們?cè)噲D研究缺氧時(shí)鹽酸氟西汀給藥對(duì)HIF-1α/VEGF/MMP-9這一信號(hào)通路的影響，以及與氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器 大型低壓低氧動(dòng)物艙(FLYDWC50-IIA，貴州風(fēng)雷)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Microfuge22R，BACKMAN COOLTER)；快速研磨儀(FTissuelyser，上海凈信)；電泳槽(Criterion型，美國(guó)Bio-Rad)，多功能酶標(biāo)儀(Spectramax i3，Molecular Devices公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康♂Wistar大鼠72只，體質(zhì)量為(220±20)g，購(gòu)于斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)為SCXK(京)2019-0010，動(dòng)物使用合格證號(hào)為SYXK(軍)2017-0047。于聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案得到聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.3藥品與試劑 鹽酸氟西汀膠囊(禮來(lái)蘇州制藥有限公司)，乙酰唑胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，甲酰胺(北京索萊寶科技有限公司)10%水合氯醛(中國(guó)人民解放軍第一醫(yī)院)；試劑盒丙二醛(A003-4-1，MDA)、超氧化物歧化酶(A001-3-2，SOD)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。抗體包括AQP4(ab259318)；HIF-1α(ab179483)；VEGF(ab1316)；MMP-9(ab58803)；SERT(ab254358)小鼠抗β-actin(中杉金橋，TA-09)。

1.2 方法

1.2.1常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn) 取BALB/c♂小鼠50只，體質(zhì)量(20.0±2.0)g，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為缺氧模型組(M，滅菌注射用水)、乙酰唑胺組(ACZ，100 mg·kg-1)、鹽酸氟西汀低劑量組(F-L，2.8 mg·kg-1)、鹽酸氟西汀中劑量組(F-M，14 mg·kg-1)、鹽酸氟西汀高劑量組(F-H，28 mg·kg-1)，灌胃給藥14 d，最后一次給藥1 h后，將各組小鼠放入涂有凡士林的250 mL廣口瓶中(瓶中需提前放入用紗布包裹的5 g鈉石灰和濾紙)，擰緊瓶蓋，確保不漏氣，記錄每只小鼠的開(kāi)始實(shí)驗(yàn)的時(shí)間以及死亡時(shí)間，計(jì)算小鼠存活時(shí)間，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取最佳給藥劑量。

1.2.2高原腦水腫大鼠模型建立 取♂Wistar大鼠68 只，隨機(jī)分為4 組：正常組(NC)、模型組(M)、乙酰唑胺組(ACZ，200 mg·kg-1)、鹽酸氟西汀組(FLX，10 mg·kg-1)，每組17只。將正常組大鼠放置于氧艙外部(即飼養(yǎng)于蘭州當(dāng)?shù)睾０?，高度約為1 500 m)，其余3組大鼠放入大型低壓低氧氧艙內(nèi)，并按照10 m·s-1的速度將艙內(nèi)海拔升至6 000 m，設(shè)置晝夜溫差并附加寒冷條件，即溫度為12 ℃(8 ∶00-20 ∶00)/2 ℃(20 ∶00-次日 8 ∶00)。大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，放在氧艙內(nèi)3 d，待d 4時(shí)進(jìn)入氧艙，在當(dāng)?shù)睾０? 500 m(NC組)和海拔3 500 m(其余3組)的高度完成取材。

1.2.3大鼠腦含水量測(cè)定 各組取大鼠10只，腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠完全麻醉后處死，迅速解剖并分離腦組織，取左半腦迅速稱組織濕重，然后將其置于濾紙上放入80 ℃恒溫烘箱中烘72 h，稱組織干重，確保達(dá)到恒重(前后2次質(zhì)量誤差小于0.000 3 g)，計(jì)算腦含水量/%=(濕重-干重)/濕重×100%

1.2.4大鼠腦通透性測(cè)定 每組取大鼠5只，腹腔注射2%EB溶液，24 h后麻醉處死，迅速取出全腦，用生理鹽水洗去腦組織表面的血液，然后用濾紙吸干。稱取100 mg右半腦，將其剪成3個(gè)約10 mm的小塊，加入3 mL甲酰胺。60 ℃水浴放置24 h，離心，取上清液，用酶標(biāo)儀測(cè)定上清液OD620 nm值。

EB標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：將伊文思藍(lán)溶于甲酰胺中得到EB貯備液，梯度稀釋為不同濃度的EB溶液。溶液濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 mg·L-1，從每種濃度EB溶液分別取出200 μL，測(cè)定OD620 nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5大鼠腦組織病理學(xué)觀察 每組各取2個(gè)大鼠腦組織，用0.9%生理鹽水清洗表面血液，10%的中性甲醛溶液固定48 h，于腦的視交叉后切片，繼續(xù)固定，樣品用石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.2.6腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 選取測(cè)定腦組織含水量的10只大鼠，麻醉并解剖，取右腦，生理鹽水沖洗血漬，濾紙吸干水分。稱質(zhì)量，加入質(zhì)量9倍的生理鹽水，每管加入兩顆鋼珠，配平，使用勻漿機(jī)進(jìn)行組織勻漿，60 Hz，60 s; 4 ℃離心，3 500 r·min-1，10 min，取上清液測(cè)定氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)即MDA含量、T-SOD活力。

1.2.7腦組織中缺氧相關(guān)蛋白的表達(dá) 選取測(cè)定腦組織含水量的10只大鼠，麻醉并解剖，取右腦，稱質(zhì)量，加入裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，置于2 mL EP管中，每管加鋼珠2顆，配平，低溫勻漿。室溫靜置30 min，12 000 r·min-1低溫(4 ℃)離心，取上清；BCA 法測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算上樣量。取離心后的上清加入4×上樣緩沖液(1/3樣品體積)，100 ℃，5 min，使蛋白變性，分裝樣品。配制凝膠電泳，上樣，電泳(80 V/20 min ，110 V/40 min)，轉(zhuǎn)膜(220 mA，1.5 h)，然后將PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉 2 h。VEGF(1 ∶2 000)，AQP4(1 ∶1 000)和 β-actin(1 ∶3 000)，一抗4 ℃孵育，過(guò)夜。次日洗膜，1×TBST 緩沖液洗滌4×10 min；二抗孵育2 h，再次洗膜4×10 min，結(jié)束后在膜上滴加ECL發(fā)光液使其顯色發(fā)光，統(tǒng)計(jì)蛋白發(fā)光程度。使用ImageJ進(jìn)行量化，灰度值表示。

1.2.8MRI對(duì)高原腦水腫的評(píng)估 使用oper-1.0 T MRI掃描儀大鼠體線圈，T2壓水圖像(T2-Flair)序列進(jìn)行掃描。序列參數(shù)如下：T2-Flair的參數(shù)為：TR/TE=8000/92 ms，THK=1.50，GAP=0.30，F(xiàn)OV=80×80 mm，F(xiàn)A=90.0。

在大型低壓低氧氧艙于海拔3 500 m將大鼠處死，保留缺氧狀態(tài)隨后將大鼠固定在核磁線圈上，進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果

2.1 常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)如Tab 1所示，與M組相比，F(xiàn)-M組的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，延長(zhǎng)率為17.78%，差異有顯著性(P<0.05)；與M組相比，F(xiàn)-L組和F-H組存活時(shí)間有所延長(zhǎng)，但不存在顯著性差異(P>0.05)。其中，F(xiàn)-M組大鼠的延長(zhǎng)率與乙酰唑胺組接近，效果最佳。因此，選取鹽酸氟西汀中劑量為最佳給藥劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Tab 1 Effects of fluoxetine on survival time of mice under

2.2 大鼠腦含水量測(cè)定如Fig 1所示，與NC組相比，M組大鼠腦組織含水量明顯增多，差異有顯著性(P<0.05)；與M組相比，F(xiàn)LX組腦組織含水量明顯下降，差異有顯著性(P<0.05)。

Fig 1 Water content of brain tissues of rats

2.3 大鼠腦通透性測(cè)定如Fig 2所示，與NC組相比，M組大鼠腦組織中EB含量明顯增加，差異有顯著性(P<0.01);與M組相比，F(xiàn)LX組大鼠腦組織內(nèi)EB含量明顯減少，差異有顯著性(P<0.05)。

Fig 2 EB content in rat brain tissues

2.4 大鼠腦組織病理學(xué)觀察如Fig 3所示，與NC組相比，M組大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷嚴(yán)重，核固縮明顯，血管腫脹，血管周?chē)g隙明顯擴(kuò)大；細(xì)胞空泡化增多；M組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞數(shù)量減少。給予藥物干預(yù)后，大腦皮層細(xì)胞核固縮及血管腫脹現(xiàn)象有所改善，海馬區(qū)細(xì)胞排列較為整齊，并且鹽酸氟西汀的治療效果優(yōu)于乙酰唑胺。

Fig 3 Pathological observation of brain tissue staining in cerebral cortex and hippocampus of rats (HE×400)

2.5 腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定如Fig 4所示，與NC組相比，M組大鼠腦組織中 MDA含量明顯上升(P<0.01)，T-SOD活力明顯降低(P<0.01)；與M組相比，ACZ 組腦組織中MDA含量明顯降低(P<0.01)，但T-SOD的活力無(wú)明顯影響；FLX組大鼠腦組織中MDA含量明顯降低(P<0.01)，T-SOD活力明顯升高(P<0.01)。

Fig 4 MDA content and SOD activity in rat brain tissues

2.6 腦組織中缺氧相關(guān)蛋白的表達(dá)如Fig 5所示，與NC組相比，M組大鼠腦組織中HIF-1α、VEGF、MMP-9、AQP4蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，SERT蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05);與M組相比，ACZ 組腦組織中HIF-1α蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，VEGF、MMP-9、AQP4、SERT蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；FLX組大鼠腦組織中MMP-9、AQP4蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，HIF-1α、VEGF、SERT蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。

Fig 5 Expression of hypoxia-related proteinin brain tissues of rats

2.7 MRI對(duì)高原腦水腫的評(píng)估HACE在MRI上的特征在于白質(zhì)水腫且好發(fā)于胼胝體壓部。如Fig 6所示，與NC組相比，M組大鼠腦部胼胝體處呈現(xiàn)明顯高信號(hào)；與M組相比，ACZ組和FLX組信號(hào)有所降低；ACZ組信號(hào)降低但是高于正常組，F(xiàn)LX組信號(hào)降低且與正常組接近。

Fig 6 MRI evaluation of cerebral edema in rats during hypoxia and drug intervention

3 討論

當(dāng)機(jī)體從平原快速進(jìn)入高原后，會(huì)因?yàn)槿毖酢⒌蛪?、寒冷等環(huán)境因素產(chǎn)生一系列高原反應(yīng)，如頭痛、失眠、耳鳴、眩暈等，進(jìn)而導(dǎo)致一系列急性高原病，比如高原肺水腫和HACE。HACE是急性高山病或高原肺水腫的繼發(fā)病，目前HACE 急救用藥主要為地塞米松，乙酰唑胺與地塞米松聯(lián)合使用[10-11]。目前，HACE治療藥物主要有以下幾種機(jī)制：維持腦細(xì)胞膜完整性，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)；改善腦細(xì)胞代謝和腦循環(huán);減輕腦血管滲漏，促進(jìn)腦血管生成；抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制炎性因子的表達(dá)[12]。目前HACE沒(méi)有特異性用藥，開(kāi)發(fā)HACE防治新藥迫在眉睫。

本實(shí)驗(yàn)小鼠常壓密閉實(shí)驗(yàn)所選擇的鹽酸氟西汀3個(gè)劑量均根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研和人與大鼠的種屬間劑量換算所得，并篩選確定鹽酸氟西汀抗缺氧的最佳劑量，為鹽酸氟西汀中劑量14 mg·kg-1，該劑量下小鼠的存活時(shí)間及延長(zhǎng)率最高；同時(shí)，大鼠高原腦水腫模型的建模條件成熟，重復(fù)性、穩(wěn)定性較好[13]。以上實(shí)驗(yàn)證明，鹽酸氟西汀可改善HACE所造成的缺氧損傷，具有一定程度的保護(hù)作用。

同時(shí)，氧化應(yīng)激與能量代謝相關(guān)結(jié)果表明，與正常組大鼠相比，缺氧模型組大鼠MDA含量增加，SOD酶活性降低，給予鹽酸氟西汀后，MDA和SOD結(jié)果均得到改善。這一現(xiàn)象可能的解釋是，缺氧條件下可能會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，生物體內(nèi)氧分子分解產(chǎn)生大量氧自由基，過(guò)量自由基會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量MDA，導(dǎo)致抗氧化酶 SOD活性降低，這些都表明缺氧后機(jī)體抗氧化能力下降[14]，而給予鹽酸氟西汀干預(yù)后會(huì)清除一部分自由基，從而使機(jī)體內(nèi)自由基含量重新平衡。

為了進(jìn)一步探討鹽酸氟西汀對(duì)腦血管生成以及對(duì)SERT蛋白表達(dá)的影響[15]，我們提取腦組織蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，缺氧模型組HIF-1α、VEGF、MMP-9、AQP4、SERT蛋白均明顯上調(diào)，給予鹽酸氟西汀干預(yù)后均明顯下調(diào)。HIF-1α為缺氧感知蛋白，AQP4為水通道蛋白，是HACE發(fā)生的標(biāo)志蛋白[15]，缺氧條件下這兩種蛋白上調(diào)表明HACE模型比較成功；SERT蛋白的變化證明了我們的猜想，即SERT蛋白可能為HACE的一個(gè)靶點(diǎn)；有文獻(xiàn)表明，氟西汀可以防止鼠百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓，是通過(guò) ERK1/2磷酸化途徑減少ROS生成和降低HIF-1α和VEGF蛋白水平實(shí)現(xiàn)的，并且腦組織與肺組織中SERT的cDNA同源性達(dá)到100%[16]，這也是鹽酸氟西汀具有抗HACE作用的一個(gè)佐證。HIF-1α、VEGF、MMP-9這3個(gè)蛋白的變化證明了鹽酸氟西汀對(duì)腦血管生成的影響可能是通過(guò)HIF-1α/VEGF/MMP-9信號(hào)通路發(fā)揮作用的[17]，這只是初步猜測(cè)，還需要RT-PCR和CO-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

HACE是一種比較嚴(yán)重的急性高原病，臨床表現(xiàn)為意識(shí)障礙和軀干共濟(jì)失調(diào)，影像學(xué)顯示血管源性水腫，白質(zhì)和胼胝體有微出血[18]。核磁共振結(jié)果顯示，在6 000 m附加寒冷條件下，T2-flair序列下，模型組大鼠胼胝體處呈現(xiàn)明顯高信號(hào);給予藥物干預(yù)后，胼胝體處信號(hào)均有所降低，鹽酸氟西汀組效果更好。由于條件有限，我們嘗試DWI、SWI等序列，效果均不太理想，因此我們只簡(jiǎn)單地進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察判斷大鼠腦部水腫程度。眾多文獻(xiàn)表明，腦水腫發(fā)生于肺水腫后，且更加嚴(yán)重，腦部微出血也可以觀察到。

綜上所述，鹽酸氟西汀具有HACE防護(hù)作用，其機(jī)制可能為減輕腦血管滲漏，促進(jìn)腦血管生成；抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制炎性因子的表達(dá)。鹽酸氟西汀作為經(jīng)典的抗抑郁藥，近年來(lái)被學(xué)者開(kāi)拓了很多新的研究方向，如肺動(dòng)脈高壓、腸易激綜合征、結(jié)腸癌、帕金森綜合征等，這都體現(xiàn)了開(kāi)發(fā)氟西汀的重大價(jià)值和意義。