艾納香中抗炎活性成分虛擬篩選及麥角甾醇過氧化物對NF-κB信號通路的影響

龍 利，彭俊超，楊 會，廖加美，蔡亞玲，王 魯

(貴州大學藥學院， 西南特色藥用生物資源開發(fā)利用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550025)

虛擬篩選技術由于其具有周期短、成本低、可操作性強、避免藥理實驗穩(wěn)定性等特點，已成為篩選中藥活性成分最便捷的有效方法之一。趙宏等[1]利用分子對接技術發(fā)現(xiàn)，MAP2K1、MAPK1和PIK3CA等靶點可能為巴亞格七味散治療酒精性肝病的關鍵靶點。單佳鈴等[2]通過分子對接技術發(fā)現(xiàn)，荷包牡丹堿、柯伊利素、木犀草素可能為短穗兔耳草治療兩種疾病的有效化合物。

艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.為菊科艾納香屬植物，被譽為貴州優(yōu)勢苗族藥物，是許多中成藥產(chǎn)品的原料藥，具有溫中活血、祛風除濕、緩解傷寒感冒、殺菌止癢、預防關節(jié)炎等功效[3]，近年來，其化學成分以及藥理學活性研究有了新的進展，目前文獻報道及數(shù)據(jù)庫搜索得到176種化學成分，包括萜類、黃酮類化合物、醇類和甾類等[4]。研究表明，艾納香中黃酮類、甾體類等有較好的抗炎活性，艾納香中活性成分芳樟醇抑制炎性因子的表達，抑制NF-κB信號通路激活[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，艾納香油能抑制炎癥慢反應物質產(chǎn)生，抑制TLR4信號途徑中相關蛋白以及COX-2的激活，減少TNF-α、IL-1β、IL-6、NO、LTB4、PGE2的生成及iNOS的活性。為了探明艾納香中是哪些成分通過抑制TLR4信號活化來發(fā)揮抗炎作用，以及如何靶向TLR4信號通路上的關鍵蛋白。為此，我們以TLR4信號通路上的關鍵蛋白為靶點，運用分子對接技術虛擬篩選艾納香中抗炎活性成分，并通過檢測其對相關蛋白表達的影響探明其抗炎作用及機制。

1 材料與方法

1.1 生物信息平臺與軟件PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)、中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、中科院化學成分數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn)、 Chem3D 15.0軟件、AutoDock vina軟件。

1.2 細胞與試劑RAW264.7細胞購于昆明細胞庫，Hela細胞株由貴州醫(yī)科大學肖潮達副教授惠贈。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購于美國Gibco公司，脂多糖(血清型O1 1：B4)購于美國Sigma-Aldrich公司，IL-1β、IL-6細胞因子檢測試劑盒購自基因美公司，抗體NF-κB p65、p-NF-κB、IκBα、p-IκBα、β-actin、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗均購自Immunoway公司，DAPI細胞核染料購自Solarbio公司，麥角甾醇過氧化物(ergosterol peroxide,EP)購自西力生物技術有限公司(分子量為428.7)。

1.3 儀器Multiscan GO多功能酶標儀(Thermo Scientific公司)、UVP Touch System化學發(fā)光成像系統(tǒng)(德國耶拿Analytik jena)、Mini-PROTEAN Tetra凝膠電泳(美國Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1艾納香化學成分分子庫的構建及3D結構的獲取及格式轉換 通過中科院化學成分數(shù)據(jù)庫、TCMSP以及國內(nèi)外文獻調研收集艾納香中化學成分，采用Chem Office 2015程序中的Chem Draw模塊繪制艾納香中化學成分的2D結構同時轉換為3D結構，并保存為mol2格式。最后，運用Discovery Studio軟件對艾納香化學成分進行能量最小化處理并轉化為pdbqt格式。

1.4.2TLR4信號通路關鍵蛋白晶體結構的獲取及格式轉換 TLR4信號通路中關鍵蛋白TLR4/MD-2、MyD88、IRAK1、TRAF6、IKKβ的晶體結構從PDB獲取，并獲取各個蛋白的功能結構域如TLR4/MD-2的疏水口袋、MyD88的Toll/白介素1受體域(TIR)、IRAK的激酶結構域(KD)、TRAF6的鋅指結構域(TANK)、IKKβ的激酶結構域(KD)，使用Auto Dock Tools、Discovery Studio軟件對TLR4通路各個關鍵蛋白或結構域去水加氫處理以及能量最小化，并保存為pdbqt格式。

1.4.3虛擬篩選艾納香中抗炎活性成分 以TLR4信號通路的關鍵蛋白的功能結構域為包裹區(qū)域，設置其Grid box，采用Autodock Vina分子對接軟件進行虛擬篩選，以每個化合物與相關蛋白的結構域的最優(yōu)結合能(affinity)打分進行排序，篩選出每個關鍵靶點排名前10的化合物，并對其進行加權處理(y=TLR4/MD-2×40%+MyD88×10%+IRAK×10%+TRAF6×10%+IKKβ×30%)，篩選出最優(yōu)化合物，對最優(yōu)化合物與TLR4信號通路各個靶蛋白通過Discovery Studio軟件進行可視化分析。

1.4.4MTT法檢測RAW264.7的細胞活性 體外培養(yǎng)RAW264.7細胞，選擇5×108·L-1濃度的細胞懸液加入96孔板，100 μL/孔，培養(yǎng)12 h后，分別設立0、1.2×10-5、2.3×10-5、4.7×10-5、9.3×10-5、1.9×10-4、3.7×10-4mol·L-1終濃度劑量的EP實驗組，同時設立空白組、LPS組、各劑量+LPS實驗組以及調零組，各個劑量重復4個孔，加藥混勻后培養(yǎng)24 h，取20 μL MTT培養(yǎng)4 h后棄去上清，加150 μL DMSO避光振搖10 min，在490 nm處測量其OD值。

1.4.5ELISA法檢測RAW264.7細胞因子的分泌 選擇5×108·L-1濃度的細胞懸液加入24孔板，500 μL/孔，培養(yǎng)12 h后，分別設立空白組、LPS組、各劑量EP+LPS組、EP陰性對照組，每組3個復孔。培養(yǎng)12 h后，收集細胞上清，按照ELISA說明書進行操作，450 nm處檢測吸光度，參照標準曲線計算IL-6、IL-1β含量。

1.4.6Western blot法檢測RAW264.7細胞NF-κB相關蛋白的表達 選擇1×109·L-1細胞密度加入6孔板，2 mL/孔，培養(yǎng)12 h后，按照1.4.4方法進行藥物干預設置分組，培養(yǎng)12 h后，倒掉細胞上清，參考方法操作并計算IκB、p-IκB、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算各個目的蛋白相對表達量。

1.4.7激光共聚焦法檢測Hela細胞NF-κB p65的核移位 以3×108·L-1的Hela細胞鋪板于預先放入蓋玻片的6孔板中，24 h后，按照轉染試劑說明書，將偶聯(lián)上綠色熒光NF-κB p65(pEGFP-N1-p65)質粒在無血清的培養(yǎng)基條件下瞬時轉染入細胞(脂質體 ∶質粒DNA=10 μL ∶1 μg)，轉染4 h后，更換帶有血清的培養(yǎng)基轉染12 h后，分別設立空白組、LPS組、EP+LPS組分別繼續(xù)培養(yǎng)12 h，激光共聚焦顯微鏡在488 nm和507 nm處觀察偶聯(lián)熒光NF-κB p65的入核情況。

2 結果

2.1 艾納香的化學成分和TLR4關鍵靶蛋白文獻檢索和數(shù)據(jù)庫查詢共獲取艾納香中活性成分176個，主要包括萜類77個、黃酮類37個、甾體類3個、香豆素類3個以及其它。PDB獲取TLR4信號通路關鍵蛋白，其功能結構域信息見Tab 1。

Tab 1 The key proteins and functional domains of TLR4 signaling pathway

2.2 分子對接綜合打分結果將艾納香中176種活性成分與TLR4信號通路關鍵蛋白進行分子對接，Tab 2為篩選出綜合打分排名前10的化合物。

Tab 2 Weighted average results of molecular docking scores

2.3 EP與TLR4信號通路靶蛋白可視化分析EP結構式如Fig 1所示[5]，以3.2中打分最高的EP與靶蛋白的對接情況進行可視化分析，結果如Fig 2所示，EP與靶蛋白TLR4/MD-2、MyD88、IRAK1、TRAF6、IKKβ之間存在氫鍵、范德華力、烷基以及π-烷基疏水作用等相互作用力。EP的過氧環(huán)主要與GLUB350、GLYA470、ASNA466 等氨基酸形成氫鍵。在結合空腔外圍，一些疏水氨基酸如VALD48、ARGB324、PROA468、GLUA442、LYSD125在保持口袋的疏水性起到了重要的作用。這表明EP與靶蛋白通過多種價鍵相結合，具有良好的結合穩(wěn)定性。

Fig 1 Structural formula of EP

Fig 2 Visual analysis of target proteins in EP and TLR4 signaling pathwaysA：TLR4/MD-2 B：IRAK1 C：MyD88 D：TRAF6 E：IKKβ

2.4 EP對RAW264.7細胞活性的結果在有或無LPS(0.8 mg·L-1)影響下，EP(3.7×10-4mol·L-1)的細胞OD值與空白組相比差異無顯著性(P>0.05)，見Fig 3A、Fig 3B。這說明在24 h內(nèi)EP在3.7×10-4mol·L-1濃度范圍內(nèi)無論有無LPS存在下對RAW264.7細胞的活性無明顯影響。

Fig 3 Effect of EP on cell activity in presence or absence of LPS A: Effect of EP on cell activity B: Effect of EP+LPS on cell activity

2.5 EP對LPS致RAW264.7細胞因子分泌的結果細胞因子IL-6、IL-1β的分泌是評價細胞炎性反應的主要標志物，結果如Fig 4所示，與空白組相比，LPS刺激下RAW264.7細胞分泌的IL-6、IL-1β明顯升高(P<0.01)；與LPS組相比，不同濃度的EP可以明顯降低IL-6、IL-1β的分泌(P<0.01)，且呈劑量依賴性。

Fig 4 Effect of EP on secretion of IL-6 and IL-1β by LPS induced cells

2.6 EP對LPS致細胞IκBα、NF-κB p65蛋白表達的結果在TLR4/NF-κB信號通路中，IκB蛋白與NF-κB解離能促使NF-κB的主要亞基p65轉移至核內(nèi)使NF-κB與下游靶基因結合從而導致炎癥因子的產(chǎn)生。本實驗檢測了IκBα、NF-κB p65的表達及其磷酸化水平。如Fig 5B所示，與空白組相比，LPS能明顯增強IκBα、NF-κB p65磷酸化水平(P<0.01)以及降低抗炎蛋白IκBα的表達水平；與LPS組相比，EP能明顯降低IκBα、NF-κB p65磷酸化水平，抑制IκBα的降解(P<0.01)。

Fig 5 Effect of EP on expression of inflammatory proteins of LPS induced NF-κB signaling pathway

2.7 EP對LPS致Hela細胞NF-κB p65蛋白亞細胞結構定位的結果為了明確EP對LPS處理后的NF-κB p65蛋白在Hela細胞的亞細胞定位，激光共聚焦顯微鏡記錄p65的入核情況。如Fig 6所示，與空白組相比，LPS刺激后綠色熒光明顯增強，這表明LPS會引起p65向細胞核轉移，而EP(4.7×10-5mol·L-1)處理后可以減弱p65核轉移。

Fig 6 Effect of EP on subcellular localization of NF-κB p65 protein

3 討論

TLR在炎癥、免疫細胞調控、存活和增殖方面發(fā)揮著關鍵作用，TLR和白細胞介素-1受體超家族共享一個TIR結構域[6]，TLR的信號傳導途徑被含有TIR 結構域的銜接蛋白調控，如MyD88、MAL、TRIF和TRAM、TIRAP，與不同的下游銜接蛋白的相互作用，使得各種TLR介導的信號傳導途徑具有特異性[7]。其中TLR4信號通路是TLR4與MD-2共同識別LPS后，胞內(nèi)招募下游的接頭蛋白[8]，若募集的是MyD88即為MyD88依賴途徑，進而激活 IRAK、TRAF6、IKKβ以及NF-κB等，導致NF-κB磷酸化水平增加以及NF-κB核移位，活化的NF-κB進入細胞核后，其κB位點與下游的靶基因特定區(qū)域相結合進而引起一系列基因表達的增加[9]，引起細胞因子釋放，最終導致炎癥的發(fā)生。為此，本論文在前期研究發(fā)現(xiàn)貴州優(yōu)勢苗族藥物艾納香的揮發(fā)油具有良好抗炎活性的基礎上，選擇了TLR4信號通路中的TLR4/MD-2、MyD88、IRAK1、TRAF6、IKKβ蛋白為靶向蛋白，采用分子對接技術虛擬篩選艾納香目前已報道的化合物，通過這一虛擬篩選技術，初步分析艾納香的抗炎活性成分。我們的實驗結果說明，分子對接打分前10的化合物如：EP、胡蘿卜甾醇、β-谷甾醇、16-貝殼杉烯、r-杜松萜烯、芫花素、艾納香素、木犀草素、Davidioside、金絲桃苷可能是艾納香的抗炎活性成分。

EP是一種天然類固醇，最早于1947年從曲霉屬中分離出來，存在于多種真菌中，具有抗氧化、抗炎、抗癌和抗病毒活性[10]。關于EP的抗炎活性研究也有報道，Liaw等[11]研究發(fā)現(xiàn)，EP對LPS刺激的巨噬細胞產(chǎn)生NO、TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2均有較好的抑制作用，并抑制NF-κB和C/EBPβ的轉錄活性以及MAPKs的磷酸化[12]，Tewtrakul等[13]發(fā)現(xiàn)EP抑制NO、PGE2和TNF-α釋放，并且下調iNOS和COX-2的mRNA表達量。從穿心蓮分離得到EP顯著降低TNF-α、IL-6和LPS/IFN-γ刺激的RAW264.7細胞分泌NO[14]。雖然已有文獻報道EP能夠抑制細胞因子的分泌以及NF-κB的活化，但EP如何抑制NF-κB的活化卻未做深入的研究。為了驗證分子對接的結果，并探討其作用機制，我們選擇了EP進行實驗研究。我們的結果證實EP抑制LPS介導的NF-κB的活化是抑制了NF-κB上游的IκB蛋白的降解和磷酸化以及NF-κB自身的磷酸化，抑制NF-κB亞基p65的核移位，最終導致細胞因子IL-6、IL-1β分泌的減少而發(fā)揮抗炎作用，且抑制NF-κB的活化也與上游蛋白IKKβ、IRAK1、MyD88以及TLR4/MD-2有一定的關聯(lián)性，分子對接的結果也佐證了EP與TLR4/MD-2、MyD88、IKKβ、IRAK1等蛋白有較強的結合力。這些結果補充了EP抑制NF-κB的作用機制，也為下一步深入研究和開發(fā)EP及含有EP的艾納香和其他相關中草藥提供了實驗數(shù)據(jù)。

我們推測EP有可能以TLR4/MD-2為直接作用靶點。分子對接的結果顯示EP能嵌入到TLR4與MD-2形成的疏水口袋中，并且EP與TLR4/MD-2的氨基酸殘基存在范德華力作用，也與TLR4/MD-2的氨基酸殘基存在疏水相互作用，這有可能是EP占據(jù)了LPS的空間，從而阻斷了LPS所導致的炎癥反應。同時，TLR4/MD-2在LPS-TLR4信號通路中扮演著不可或缺的角色，TLR4信號通路的活化需要LPS的傳遞、TLR4與MD-2的二聚化、MyD88或TRIF的銜接、IRAK1的磷酸化、IKKβ的激活以及NF-κB的入核促進大量細胞因子IL-6、IL-1β等的產(chǎn)生，引起“細胞因子”風暴，最終導致炎性疾病的產(chǎn)生。已有大量文獻報道了TLR4或MD-2的靶向抑制劑，通過破壞TLR4/MD-2異源二聚和TLR4同源二聚而阻止TLR4被激活，從而阻斷NF-κB/MAPK信號通路的激活[15]，以及上調p-p65和TLR4/MD-2復合物的表達，顯著抑制了NF-κB p65核轉入[16]。這說明TLR4/MD-2在炎癥中起著關鍵性作用，因此EP有可能以TLR4/MD-2為靶點，從源頭上阻止LPS的信號轉導。當然，EP是否是通過TLR4/MD-2與蛋白結合從而影響IκBa和NF-κB p65的磷酸化，則需要進一步探究。