NM23-H2通過下調P-STAT3表達抑制結直腸腺癌的發(fā)生及遷移*

曹 強,李 箏

(1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術學院，湖南 湘潭 411102；2.湘潭市第一人民醫(yī)院病理科，湖南 湘潭 411102)

近年來，結直腸腺癌患病率呈逐年上升趨勢，結直腸腺癌的發(fā)生涉及多種基因的改變，NM23基因是一種常見的抑癌基因，NM23基因突變可通過微管聚合的異常及對細胞骨架的影響參與腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉移等[1]。NM23-H1對結腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤的侵襲、轉移均具有抑制作用[2]。Janus激酶-信號轉導子與轉錄激活子(JAK-STAT)信號通路參與了多種病理過程，如炎癥、腫瘤、免疫性疾病等[3]。JAK-STAT信號通路中活化了的P-STAT信號蛋白經細胞膜轉入細胞內，指導相關靶基因的轉錄[4-5]。何超月等[6]發(fā)現(xiàn)，吉馬酮可能是通過下調JAK-STAT信號通路活性抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖、遷移的。彭文等[7]發(fā)現(xiàn)，激活JAK2-STAT3通路可逆轉BCAR4沉默對食管癌EC9706細胞侵襲、遷移，以及對炎癥因子表達的抑制和細胞凋亡的誘導。張大為等[8]發(fā)現(xiàn)，復方苦參注射液能通過抑制JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮其對肝癌HepG2細胞增殖、侵襲的抑制作用，JIANG等[9]發(fā)現(xiàn)，通過上調RP11-468E2.5可抑制JAK-STAT信號通路，JAK-STAT信號通路的阻斷能抑制結直腸癌細胞增殖，同時可促進癌細胞凋亡。本研究探討了NM23-H2與JAK-STAT信號通路在結直腸腺癌的遷移過程中的作用及是否存在相關性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源 選取2018年1月至2021年1月湖南省湘潭市第一人民醫(yī)院收集的結直腸腺癌病理蠟塊80個，其中腺癌35個，癌旁組織20個，淋巴結轉移25個。人結直腸腺癌SW620細胞購自上?？道噬锟萍加邢薰荆瑢в蠳M23-H2基因的重組質粒(pcDNA3.1-NM23-H2)轉染的SW620細胞命名為SW620-NM23-H2，在湖南省湘潭市中心醫(yī)院細胞分子實驗室進行傳代培養(yǎng)。

1.1.2儀器與試劑 石蠟切片機購自河南鄭州南北儀器有限公司，UniTMA Quick-Ray手動式組織芯片制備儀購自上海宇北醫(yī)療器械有限公司，病理組織攤烤片機購自沈陽恒松科技有限公司，吹風機、高壓鍋、離心機均由湖南省湘潭市中心醫(yī)院細胞分子實驗室提供，細胞培養(yǎng)超凈工作臺購自濟南騰昊科學儀器有限公司，二氧化碳細胞培養(yǎng)箱購自北京東方安諾生化科技有限公司，HH-W600S電熱恒溫水箱、TGL-16WL離心機均購自常州金壇良友儀器有限公司，ECLIPSE MA100倒置顯微鏡購自北京創(chuàng)城致佳科技有限公司，24孔板、Transwell小室均購自北京明陽科華生物科技有限公司，伯樂小型電泳儀1658001購自山東濟南愛來寶儀器設備有限公司，蛋白質印跡(Western blot)凝膠成像儀購自上海金鵬分析儀器有限公司。免疫組織化學(免疫組化)一抗——P-STAT3抗體、兔抗人多克隆抗體均購自沈陽萬類生物科技有限公司，NM23-H2抗體、兔抗人多克隆抗體均購自北京百奧萊博科技有限公司，均于-20 ℃冰箱保存。免疫組化二抗購自上海愛必信生物科技有限公司，4 ℃冰箱保存?？乖迯鸵骸蹤此峋彌_液購自上海尚寶生物科技有限公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自天津格里斯醫(yī)藥化學技術有限公司，蒸餾水、二氨基聯(lián)苯胺顯色液、載玻片、蓋玻片、中性樹膠封片劑均由湖南省湘潭市中心醫(yī)院細胞分子實驗室提供，lipofectamine2000購自北京沃比森科技有限公司，G418購自青島捷世康生物科技有限公司，NM23-H2基因的重組質粒(pcDNA3.1-NM23-H2)購自武漢益普生物科技有限公司，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶均購自上海康朗生物科技有限公司，結晶紫及甲醇購自上海尚寶生物科技有限公司，青霉素-鏈霉素雙抗購自上海源培生物科技有限公司，用于Western blot實驗的P-STAT3抗體及二抗均購自沈陽萬類生物科技有限公司，RIPA裂解液購自上海滬震實業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1組織芯片制作 將80個病理蠟塊對應的蘇木精-伊紅(HE)染色切片逐一由病理科主治醫(yī)師進行癌組織觀察，并與之對應的蠟塊組織對比觀察，由此在蠟塊上對癌組織進行定位，使用手動式組織芯片制作儀采集蠟塊中已標記好的癌組織，轉移到空白蠟塊內，然后將制作好的組織芯片放入60 ℃的溫箱內，使用包埋框重新對組織芯片蠟塊進行二次包埋，將二次包埋好的組織芯片蠟塊放入4 ℃冰箱備用。

1.2.2HE染色方法 將制作好的組織芯片從4 ℃冰箱中取出，使用石蠟切片機進行切片，切片烘烤后進行染色：(1)將切片放入二甲苯液中停留15 min，重復1次；(2)將切片依次放入100%、90%、80%乙醇中各停留5 min；(3)切片放入蒸餾水中停留5 min；(4)將切片放入蘇木素染液中染色10 min，然后用水流沖洗2 min；(5)用鹽酸乙醇分化30 s；(6)將切片放入伊紅染色液中染色1 min；(7)依次將切片放入80%、90%、95%、100%乙醇中各2 min，取出后進行透明并用中性樹膠封片。

1.2.3免疫組化染色 前期切片制作方法與HE染色相同，免疫組化染色步驟：(1)將切片放入3個盛有二甲苯的缸中各停留15 min；(2)依次將切片放入100%、90%、80%乙醇中各停留3 min，然后放入蒸餾水中停留5 min；(3)將切片放入盛有枸櫞酸鹽的高壓鍋中煮沸3 min后緩慢冷卻；(4)用3%過氧化氫孵育10 min消除內源性過氧化物酶；(5)滴加正常山羊血清處理15 min；(6)在切片上滴加P-STAT3、NM23-H2抗體放置于4 ℃冰箱過夜；(7)在切片上滴加二抗，37 ℃恒溫箱孵育20 min；(8)將二氨基聯(lián)苯胺顯色液滴加適量于切片上，顯微鏡下邊觀察邊顯色，顏色出現(xiàn)黃色改變即刻終止，使用流動自來水沖洗；(9)將切片放入蘇木素液中染色1 min，自來水沖洗返藍10 min；(10)將切片分別放入80%、95%、100%乙醇中各停留5 min；(11)將切片放入二甲苯停留5 min，使用中性樹膠封片。

1.2.4結果判定 P-STAT3定位于細胞核，NM23-H2定位于細胞質和細胞核，P-STAT3、NM23-H2顯色后呈棕褐色或棕黃色顆粒。評分標準：(1)根據(jù)切片陽性細胞著色強度計分，棕黃色或棕褐色計2分，淺黃色計1分，無色計0分；(2)根據(jù)陽性細胞百分比計分，陽性細胞占0%～30%計1分，>30%～80%計2分，>80%計3分；(3)總分為陽性細胞著色強度計分和陽性細胞百分比計分的乘積，0～3為陰性，>3～7分為陽性，>7～9分為強陽性。

1.2.5SW620細胞培養(yǎng)及SW620-NM23-H2穩(wěn)定轉染細胞株的建立 首先用75%乙醇噴灑并擦拭無菌超凈工作臺，將購買的SW620細胞轉移至細胞培養(yǎng)瓶中，加入含有青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液，放入二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用倒置顯微鏡觀察細胞增殖情況，當細胞覆蓋瓶底至80%左右時取出培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)液并用PBS吹打殘留的培養(yǎng)液，加入1 mL胰蛋白酶消化液，蓋好瓶蓋放在倒置顯微鏡下進行觀察，當細胞回縮凸起變圓時立即停止胰蛋白酶消化，并將培養(yǎng)瓶中胰蛋白酶倒掉，在培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)液，反復吹打消化好的細胞使其分散脫壁，將細胞懸液接種在新的培養(yǎng)瓶中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期生長的SW620細胞，使用胰蛋白酶消化液消化后接種于6孔板并加入培養(yǎng)液過夜，細胞匯合度達到80%時進行轉染，將含有l(wèi)ipofectamine2000的無血清培養(yǎng)基和含有pcDNA3.1-NM23-H2的無血清培養(yǎng)基混合，用槍頭輕輕上下吹打直至其混勻，將混合液室溫下放置10 min，吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，加入混合液和無血清培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)4 h后倒掉培養(yǎng)板中的液體，加入DMEM高糖培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板放入二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)24 h后用胰蛋白酶消化6孔板中的細胞進行傳代，接種于新的6孔板中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，加入G418,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)2周后待培養(yǎng)板中長出單細胞克隆株時移至96孔板中進行擴增，當細胞長滿整個孔時用胰蛋白酶消化細胞，并將其移至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，收集陽性克隆細胞。

1.2.6Transwell遷移實驗 將SW620細胞、SW620-NM23-H2細胞培養(yǎng)至對數(shù)期，使用胰蛋白酶消化細胞，并用PBS洗滌1次，使用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，將Transwell小室置于24孔板內，在下室加入DMEM高糖培養(yǎng)液，上室加入150 μL細胞懸液，繼續(xù)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，棄培養(yǎng)液，用PBS洗2次，甲醛固定20 min，結晶紫染色20 min，PBS洗3次，顯微鏡下觀察細胞并計數(shù)。

1.2.7Western blot 待SW620細胞、SW620-NM23-H2培養(yǎng)至匯合度達85%時取出培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)液，每瓶細胞加3 mL PBS，輕輕搖動1 min，倒掉洗液，每瓶細胞加入500 μL裂解液，反復吹打轉入1.5 mL離心管，放置于冰上用裂解液裂解20 min，輕輕晃動培養(yǎng)瓶使細胞充分裂解，用細胞刮將細胞刮至培養(yǎng)瓶一側，迅速將細胞碎片及裂解液移至2 mL離心管內，12 000 r/min離心10 min后將上清液移至0.5 mL離心管內并于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用不同體積牛血清白蛋白(BSA)和超純水配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的BSA溶液。用移液槍分別移取100 μL配好的BSA溶液滴加至板孔中，再分別加入200 μL考馬斯亮藍，檢測各孔吸光度。將15%分離膠倒入玻璃板中，加入超純水壓膠，分離膠凝固后倒掉超純水，然后加入濃縮膠，插入齒梳濃縮膠凝固后拔出齒梳。在電泳槽內加入電泳液后緩慢加入樣本，開始電泳，電泳結束后開始切膠，取下玻璃板輕輕分離，棄上層濃縮膠，根據(jù)泳道及Marker標記切下蛋白相對分子質量所對應的膠，根據(jù)膠的尺寸剪切聚偏氟乙烯膜，由黑色面開始，依次鋪膜，即海綿、三層濾紙、膠、膜、三層濾紙、海綿，鋪膜過程中不能干，同時趕走氣泡。結束后取出膜，放入含有5%BSA的脫脂牛奶中常溫下封閉1 h后取出膜滴加一抗，4 ℃冰箱過夜，用TBST 洗膜后將膜放入二抗室溫孵育1 h后用凝膠成像系統(tǒng)顯影。

2 結 果

2.13種蠟塊P-STAT3、NM23-H2表達比較 3種蠟塊P-STAT3、NM23-H2表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3種蠟塊P-STAT3、NM23-H2表達比較

2.2NM23-H2對SW620細胞的遷移具有抑制作用 未轉染組細胞穿膜數(shù)比穩(wěn)定轉染細胞組明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.3穩(wěn)定轉染組細胞中P-STAT3的表達明顯降低 穩(wěn)定轉染組細胞中P-STAT3表達量明顯低于未轉染組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

3 討 論

腫瘤特別是惡性腫瘤嚴重危害著人們的身體健康，目前，對惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的病因及機制仍沒有完全明了，結直腸腺癌發(fā)生的基因分子機制尚不太清楚，NM23基因家族是研究較早的一種抑癌基因，其家族成員有6個，研究較多的是NM23-H1及NM23-H2。NM23基因編碼蛋白質能參與細胞紡錘體形成及細胞運動，MN23基因突變有可能通過影響細胞運動進而促進細胞轉移[10]。作為NM23基因家族成員之一的NM23-H2是否參與了結直腸腺癌轉移抑制作用方面的研究還不是很多，本研究對結直腸腺癌、癌旁組織、轉移淋巴結NM23-H2的表達情況進行了免疫組化染色，結果顯示，3種組織NM23-H2表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明NM23-H2基因可能參與了結直腸腺癌的轉移，并且有可能在結直腸腺癌的轉移中具有抑制作用，本研究Transwell實驗結果顯示，未轉染組細胞穿膜細胞數(shù)比穩(wěn)定轉染細胞組明顯增多，提示NM23-H2基因的高表達對結直腸腺癌細胞的遷移具有明顯的抑制作用。

在結直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中存在多種信號通路的活化，殷舞等[11]通過免疫組化的方法檢測了磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳動物雷帕霉素蛋白(mTOR)信號通路中關鍵信號分子——PI3K、p-Akt、p-mTOR在結直腸腺癌中的表達情況，結果顯示，PI3K、Akt、mTOR信號通路在不同級別腺瘤至腺癌中均呈過度激活狀態(tài)。張果等[12]通過HE和免疫組化方法證實了Wnt/β-聯(lián)蛋白信號通路在結直腸腺癌中處于過度活化狀態(tài)。

相關信號通路的活化在結直腸腺癌增殖、浸潤、轉移過程中扮演著重要的角色，JAK-STAT信號通路作為細胞內廣泛存在并參與細胞的分裂、增殖、分化、凋亡等重要生命活動過程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，以及浸潤、轉移過程中也發(fā)揮著重要作用。鄧楨等[13]發(fā)現(xiàn)，細胞因子信號轉導抑制因子1可通過抑制JAK-STAT信號通路活性進一步抑制肝癌細胞增殖、浸潤、遷移等，提示JAK-STAT信號通路的活化參與了胃癌的增殖及遷移。鮑軍等[14]發(fā)現(xiàn)，精子關聯(lián)抗原5能通過活化JAK-STAT信號通路增強乳腺癌細胞增殖和遷移能力。有關宮頸腫瘤細胞的實驗數(shù)據(jù)表明，JAK2、STAT3抑制劑能降低細胞增殖，促進細胞凋亡[15]。

JAK-STAT信號通路的活化是否對結直腸腺癌增殖、遷移有促進作用，本研究通過免疫組化方法測得JAK-STAT信號通路中核心轉錄因子——P-STAT在結直腸腺癌、癌旁組織、轉移淋巴結中的表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，本研究也探討了在結直腸腺癌中NM23-H2與JAK-STAT信號通路的相關性，Western blot實驗結果顯示，穩(wěn)定轉染組細胞中JAK-STAT信號通路中關鍵核轉錄因子——P-STAT3表達量明顯低于未轉染組，提示NM23-H2對結直腸腺癌的抑制可能是通過下調JAK-STAT信號通路的活性來實現(xiàn)的，結直腸腺癌的發(fā)生是多基因多分子共同參與的結果，將為進一步揭示結直腸腺癌發(fā)展機制、新靶點藥物的開發(fā)提供理論基礎。