基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討槲皮素治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制*

邵一鳴，張濛，張新安，連鴻凱

1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450014； 2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450001； 3.河南省人民醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450003

骨關(guān)節(jié)炎是一種嚴(yán)重影響中老年人生活質(zhì)量的關(guān)節(jié)退行性疾病。其主要特點(diǎn)為關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜炎癥和關(guān)節(jié)間隙變窄，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛腫脹、活動(dòng)受限及畸形改變[1-3]。據(jù)估計(jì)，全球約有3億人患有骨關(guān)節(jié)炎，這是導(dǎo)致老年人殘疾的主要原因之一[4-5]。因此，早期診斷和治療可以延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[6]。目前，臨床治療早期骨關(guān)節(jié)炎以口服藥物為主，如糖皮質(zhì)激素類、非甾體類消炎藥、阿片類鎮(zhèn)痛藥和對(duì)乙?；宇愃幬颷7-8]。這些藥物僅僅針對(duì)疾病的癥狀，并沒有從根本上改變骨關(guān)節(jié)炎的病理狀況，而且還伴有一系列藥物不良反應(yīng)，如胃腸毒性、肝腎損傷和心血管損傷等[9-10]。因此，尋找一種更安全、更有效治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物具有重要意義。

槲皮素是一種廣泛分布于植物界的黃酮類化合物，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種作用[11]。研究表明，槲皮素可以通過抑制IRAK1/NLRP3信號(hào)通路進(jìn)一步抑制白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，減輕大鼠關(guān)節(jié)軟骨的退化和侵蝕[12]。但由于槲皮素治療骨關(guān)節(jié)炎的療效受多種途徑調(diào)節(jié)，機(jī)制較為復(fù)雜，常用的藥理學(xué)方法難以對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)分析。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以通過高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)可視化、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅确椒ń沂境煞帧悬c(diǎn)和疾病之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和分析其潛在的作用機(jī)制[13]。因此，本研究旨在利用生物信息學(xué)分析和分子對(duì)接技術(shù)闡明和驗(yàn)證槲皮素治療骨關(guān)節(jié)炎的分子作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 槲皮素結(jié)構(gòu)及靶點(diǎn)的獲取使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/)獲取槲皮素的結(jié)構(gòu)及其靶點(diǎn)信息，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為相對(duì)應(yīng)的人源基因名。

1.2 骨關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)獲取使用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)。在數(shù)據(jù)庫(kù)中以"osteoarthritis"為關(guān)鍵詞檢索，篩選得到編號(hào)為GSE82107的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)中含有17個(gè)樣本，其中包括7例正常膝關(guān)節(jié)滑膜組織標(biāo)本和10例終末期骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織標(biāo)本。上述所有測(cè)序數(shù)據(jù)集均基于GPL570平臺(tái)的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載。利用R軟件的"limma"包進(jìn)行兩組之間的差異性分析，設(shè)置|log2(FC)|>1，校正后P值<0.05，篩選出數(shù)據(jù)中具有差異表達(dá)的基因，差異分析結(jié)果以火山圖及熱圖的形式進(jìn)行可視化展示。此外，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.genecards.org/)中以"osteoarthritis"為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將其檢索所得的疾病靶點(diǎn)作為補(bǔ)充。

1.3 槲皮素治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)使用在線軟件VRNNY2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對(duì)上述所得的槲皮素靶點(diǎn)和骨關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到兩者的交集靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選通過STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//string-db.org/)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析，在中置信度(0.700)處設(shè)置所需的最低相互作用分?jǐn)?shù)，并隱藏游離靶點(diǎn)，構(gòu)建靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出PPI數(shù)據(jù)。將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape 3.8.2 軟件(http：//www.cytoscape.org)，對(duì)該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治龊秃诵陌悬c(diǎn)篩選，其中核心靶點(diǎn)的篩選條件為該網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)度、中介中心性及接近中心均大于其平均值。

1.5 “槲皮素-交集靶點(diǎn)-骨關(guān)節(jié)炎”對(duì)應(yīng)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為了更加清晰地呈現(xiàn)槲皮素與骨關(guān)節(jié)炎之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，使用Cytoscape 3.8.2 軟件繪制“槲皮素-交集靶點(diǎn)-骨關(guān)節(jié)炎”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 富集分析將1.4篩選到的核心靶點(diǎn)提交至Metascape在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//metascape.org/)，進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，其中KEGG分析中設(shè)置P<0.05，得到槲皮素治療骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的生物學(xué)功能和信號(hào)通路。

1.7 分子對(duì)接在Pubchem在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載槲皮素的2D結(jié)構(gòu)，使用OpenBabel軟件轉(zhuǎn)化為mol2格式。隨后從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(protein data bank，PDB，https：//www.rcsb.org/)下載PPI網(wǎng)絡(luò)中度值靠前的靶點(diǎn)的配體PDB格式文件，采用PyMOL軟件去除其中的水分子和配體分子，在SwissDock網(wǎng)站(http：//www.swissdock.ch/)分別上傳以上得到的結(jié)構(gòu)文件進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素的結(jié)構(gòu)及相關(guān)靶點(diǎn)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到140個(gè)槲皮素對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。槲皮素相關(guān)信息詳見表1。

表1 槲皮素的結(jié)構(gòu)及信息

2.2 骨關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)的獲取對(duì)編號(hào)為GSE82107的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析后，得到1 745個(gè)與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展有顯著影響的基因，其中上調(diào)基因369個(gè)，下調(diào)基因1 376個(gè)，分析結(jié)果見圖1。同時(shí)，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因3 211個(gè)，兩者合并去重后共得到骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)4 746個(gè)。最后映射出槲皮素治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點(diǎn)104個(gè)，見圖2。

圖1 GSE82107差異性分析的熱圖及火山圖

2.3 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選使用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中包含100個(gè)節(jié)點(diǎn)和719條邊。以“節(jié)點(diǎn)度值”“中介中心性”和“接近中心性”3個(gè)主要參數(shù)篩選關(guān)鍵基因，篩選閾值為節(jié)點(diǎn)度值≥ 14.38，中介中心性≥0.013，接近中心性≥0.447，篩選后剩余26個(gè)節(jié)點(diǎn)和287條邊。篩選過程見圖3。

圖2 槲皮素-骨關(guān)節(jié)炎交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 “槲皮素-交集靶點(diǎn)-骨關(guān)節(jié)炎”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建采用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建 “槲皮素-交集靶點(diǎn)-骨關(guān)節(jié)炎”對(duì)應(yīng)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見圖4。網(wǎng)絡(luò)圖中黑色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，紅色節(jié)點(diǎn)代表“槲皮素”，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表“骨關(guān)節(jié)炎”，線條代表槲皮素、骨關(guān)節(jié)炎與靶點(diǎn)具有對(duì)應(yīng)關(guān)系。

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析為了進(jìn)一步系統(tǒng)地闡明槲皮素治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制，采用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)26個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。選取P值排列前10位的結(jié)果分別以氣泡圖進(jìn)行可視化展示。GO功能富集分析獲得了928個(gè)結(jié)果，其中包括生物學(xué)過程(biological process，BP)863個(gè)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)26個(gè)、分子功能(molecular function，MF)39個(gè)。GO功能富集分析表明，生物過程主要集中于對(duì)腫瘤壞死因子、脂多糖、凋亡信號(hào)通路等調(diào)節(jié)；細(xì)胞成分主要集中在膜筏、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子復(fù)合體中；分子功能主要表現(xiàn)為細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合和腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等，見圖5。KEGG通路富集分析得到111條相關(guān)通路，主要包括癌癥相關(guān)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、凋亡、NF-κB信號(hào)通路等，詳見圖6。

圖3 槲皮素治療骨關(guān)節(jié)炎的PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鰣D

圖4 槲皮素-交集靶標(biāo)-骨關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 GO功能富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

2.6 分子對(duì)接結(jié)果一般認(rèn)為，配體與受體結(jié)合穩(wěn)定時(shí)的結(jié)合能越低，發(fā)生作用的可能性越大；當(dāng)結(jié)合能≤-5.0 kcal·mol-1時(shí)，兩者具有良好的親和力。分子對(duì)接結(jié)果顯示：槲皮素與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的結(jié)合能均<-5.0 kcal·mol-1，與腫瘤壞死因子、MYC、AKT1的結(jié)合能分別為-7.36、-6.96、-7.31 kcal·mol-1。由此表明，槲皮素與治療骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，見圖7。

圖7 槲皮素與腫瘤壞死因子、MYC、AKT1的分子對(duì)接模式圖

3 討論

在天然化合物中，黃酮類化合物已成為治療多種疾病的潛在候選藥物。槲皮素是一種存在于多種水果和植物中的黃酮類多酚化合物，具有預(yù)防和治療心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病以及癌癥等作用[14]。研究表明，槲皮素可以通過抑制SIRT1/AMPK介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)一步抑制大鼠軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，達(dá)到減輕關(guān)節(jié)軟骨退變的效果[15]。另外，槲皮素還可以通過抑制軟骨細(xì)胞的炎癥和凋亡調(diào)節(jié)滑膜巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞的極化，為軟骨細(xì)胞創(chuàng)造有利環(huán)境，促進(jìn)軟骨修復(fù)，從而發(fā)揮軟骨保護(hù)作用[16]。但是由于槲皮素通過多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)作用于骨關(guān)節(jié)炎，更多的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

筆者從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選到了腫瘤壞死因子、AKT1、MYC、CCND1、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)等26個(gè)槲皮素治療骨關(guān)節(jié)炎的核心靶點(diǎn)。腫瘤壞死因子-α是一種由包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子。在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤壞死因子-α通過抑制蛋白多糖的合成和刺激基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)的產(chǎn)生引起關(guān)節(jié)軟骨不穩(wěn)，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的降解[17]。腫瘤壞死因子-α還可以刺激促炎和促代謝介質(zhì)的合成，如MMP-1、MMP-3、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-8等，這些介質(zhì)均在引起關(guān)節(jié)炎癥、降解軟骨基質(zhì)蛋白過程中發(fā)揮重要作用[18]。當(dāng)阻斷腫瘤壞死因子-α受體時(shí)可明顯抑制軟骨中一氧化氮的產(chǎn)生，而一氧化氮是滑膜組織中潛在的凋亡介質(zhì)。此外，腫瘤壞死因子-α還可以直接或間接激活TLR信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡[19-20]。MYC基因是一組致癌基因，其家族成員包括C-myc、N-myc和L-myc。研究發(fā)現(xiàn)，C-myc基因沉默可以促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子表達(dá)[21]。EGFB在健康的關(guān)節(jié)軟骨中高度表達(dá)，它可以促進(jìn)關(guān)節(jié)中滑液的分泌，保持軟骨表面潤(rùn)滑以及提高關(guān)節(jié)軟骨機(jī)械強(qiáng)度。EGFR活性的降低會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨在發(fā)育過程中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)、功能和機(jī)械方面的損害，并在骨關(guān)節(jié)炎的病理過程中顯著加速軟骨退化[22]。

通過對(duì)核心靶點(diǎn)的GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)槲皮素治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)與骨和軟骨細(xì)胞的增殖修復(fù)、細(xì)胞凋亡以及炎癥機(jī)制的形成等生物學(xué)過程密切相關(guān)。軟骨細(xì)胞凋亡可能是調(diào)控軟骨退變的有效靶點(diǎn)。因?yàn)?，軟骨?xì)胞活力的喪失是人類骨關(guān)節(jié)炎的一個(gè)重要標(biāo)志[23]。炎癥在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中也起著核心作用。關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、滑膜組織、韌帶和半月板都參與了骨關(guān)節(jié)炎炎癥網(wǎng)絡(luò)的形成[24]。因此，炎癥通路的靶向治療可能為未來骨關(guān)節(jié)炎的臨床治療提供新思路。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，槲皮素治療骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵通路為PI3K/AKT信號(hào)通路、凋亡和NF-κB信號(hào)通路。PI3K/AKT是一條非常重要且相當(dāng)復(fù)雜的信號(hào)通路，它在許多細(xì)胞穩(wěn)態(tài)過程中都發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞存活、炎癥、新陳代謝和凋亡等[25-26]。同時(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路也是軟骨細(xì)胞存活和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子[27]。大量研究表明，多種生長(zhǎng)因子和生物活性物質(zhì)可通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路減少軟骨細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮骨關(guān)節(jié)炎保護(hù)作用，如胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、血小板衍生生長(zhǎng)因子BB、委陵菜酸等[28-29]。NF-κB信號(hào)通路不僅參與調(diào)控軟骨正常發(fā)育和病理破壞，而且是骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)炎癥介質(zhì)的主要調(diào)節(jié)因子，其主要由IKB激酶介導(dǎo)的IkBa降解和RelA磷酸化所激活[30-31]?；罨腜I3K/AKT還可以參與NF-κB p65的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[32]。由此可見，槲皮素可以通過以上關(guān)鍵通路及靶點(diǎn)調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎過程中的炎癥、免疫、凋亡等達(dá)到防治骨關(guān)節(jié)炎的效果。

最后，本研究通過分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證了槲皮素與腫瘤壞死因子、AKT1、MYC之間的結(jié)合能力。結(jié)果顯示，槲皮素可分別與腫瘤壞死因子、AKT1、MYC形成穩(wěn)定的對(duì)接模型，這進(jìn)一步證實(shí)了之前的推測(cè)結(jié)果。

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)槲皮素治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制進(jìn)行了綜合分析，結(jié)果提示槲皮素對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用是通過“多靶點(diǎn)、多途徑”的特點(diǎn)在抗炎、抑制軟骨細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮協(xié)同作用。這與現(xiàn)有的研究結(jié)果相互吻合，為今后槲皮素的藥理機(jī)制分析提供了數(shù)據(jù)支持，但本研究結(jié)果還需要后續(xù)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。