不同茬口對娃娃菜根際土壤養(yǎng)分和真菌群落的影響

陳 倬，馮海萍，程彥弟，劉 素，康建宏，吳宏亮*

（1．寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2．寧夏農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所，寧夏 銀川 750002）

娃娃菜是一種小型白菜，屬于十字花科蕓薹屬白菜亞種的一種半耐寒性蔬菜，以45 d為一個生長周期。娃娃菜幫薄甜嫩，味道鮮美，受廣大群眾喜愛。當(dāng)前多在云南、北京、寧夏等地規(guī)?；N植［1］，而寧夏是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃的冷涼蔬菜特色優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)，尤其是在環(huán)六盤山區(qū)域，目前主要種植娃娃菜、花椰菜、芹菜、甘藍等，栽培面積約2.7萬hm2，占全區(qū)露地蔬菜近一半［2］。隨著人們需求的增加和可利用耕地面積的減少，在實際生產(chǎn)過程中，人們通過增加娃娃菜的種植年限來謀求更高的利益，導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)惡化，土傳病害加重，娃娃菜產(chǎn)量及品質(zhì)逐年下降。

有研究表明，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的改變是連作障礙發(fā)生的主要原因，作物連作對根際土壤細菌有抑制作用，而對真菌起促進作用，土壤由高肥力轉(zhuǎn)變?yōu)榈头柿Γ?-4］；由“細菌型”轉(zhuǎn)變?yōu)椤罢婢汀保?-6］。姜國霞等［7］針對作物高效種植方式的研究，摸索出了“小麥-西瓜-蘿卜”這種高效互作栽培模式，這種模式能有效提高土地利用率、農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量及經(jīng)濟效益，改善土壤狀況，解決農(nóng)作物連作障礙問題；張順濤等［8］研究油菜輪作對后茬作物的影響，結(jié)果表明，油菜是一種很好的倒茬作物，能夠提高后茬作物的產(chǎn)量及土壤養(yǎng)分；陳海生等［9］研究水旱輪作對綠花椰菜根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，水旱輪作使根際土壤真菌多樣性指數(shù)得到提高，并且很好地改善綠花椰菜根際土壤微生物環(huán)境；李星月等［10］對草莓根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化進行研究，發(fā)現(xiàn)草莓連作直接導(dǎo)致根際土壤真菌豐度和多樣性降低；時偉等［11］研究大蔥輪作對溫室黃瓜根際土壤微生物多樣性的影響發(fā)現(xiàn)，黃瓜根際土壤中細菌多樣性及均勻度指數(shù)經(jīng)過大蔥輪作這種種植方式得到提高，但真菌的多樣性與均勻度指數(shù)降低。因此，研究不同茬口的娃娃菜根際土壤真菌群落的變化情況，對選擇合適的娃娃菜茬口及緩解其連作障礙有重要的意義。

本試驗以土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性為著手點，運用高通量測序技術(shù)，探明不同茬口種植娃娃菜后對根際土壤化學(xué)性質(zhì)、土壤真菌群落組成及多樣性的影響機理，為娃娃菜選擇合適的茬口提供理論依據(jù)。

1 試驗內(nèi)容及方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于寧夏回族自治區(qū)固原市原州區(qū)彭堡鎮(zhèn)閆堡村（36°6′23″N，106°10′48″E），該區(qū)域?qū)賹幭哪喜坷錄鰩?，典型的中溫帶半干旱大陸性氣候，光熱資源豐富，海拔1687 m，年日照時數(shù)2480 h，年均氣溫6.0～6.2℃，≥10℃的積溫約3000℃，年平均降水量300～450 mm，無霜期120～160 d，降水時空分布不均，由南向北遞減，其中7～9月降水量占總降水量的68%，試驗地肥力中上等。

2018年種植前0～20 cm土壤基礎(chǔ)化學(xué)性狀：pH為8.43，電 導(dǎo) 率（EC）為0.26 mS·cm-1，全 磷（TP）含量為0.08 g·kg-1，有效磷（AP）含量為42.65 mg·kg-1，有機質(zhì)（OM）含量為1.238%，銨態(tài)氮（NH4+-N）含量為0.06 mg·kg-1，硝態(tài)氮（NO3--N）含量為1.57 mg·kg-1，全氮（TN）含量為0.41 g·kg-1，速效鉀（AK）含量為288.74 mg·kg-1。2018年7種作物收獲后其根際土壤養(yǎng)分見表1。

表1 7種作物收獲期根際土壤養(yǎng)分

1.2 試驗設(shè)計

2018年該試驗地種植以下7種作物，均采用滴灌方式種植，小區(qū)面積為30 m2?；式y(tǒng)一為：6000 kg·hm-2商品有機肥和300 kg·hm-2復(fù)合肥（總養(yǎng)分≥45%，N-P2O5-K2O：15%-15%-15%），追肥情況如下。

（1）馬鈴薯在出苗20 d后施用尿素60 kg·hm-2，硫酸鉀30 kg·hm-2；現(xiàn)蕾初期施用尿素90 kg·hm-2，硫酸鉀60 kg·hm-2；結(jié)薯盛期施用尿素90 kg·hm-2，硫酸鉀60 kg·hm-2。

（2）西蘭花在定植后20 d施用尿素60 kg·hm-2，硫酸鉀30 kg·hm-2；定植后40 d施用尿素60 kg·hm-2，硫酸鉀180 kg·hm-2。

（3）大蔥在定植后20 d施用尿素60 kg·hm-2，定植后50 d施用硫酸鉀60 kg·hm-2，硫酸鎂15 kg·hm-2；尿素150 kg·hm-2。

（4）洋蔥在定植后20 d施用尿素90 kg·hm-2；定植后50 d施用尿素120 kg·hm-2，硫酸鉀150 kg·hm-2。

（5）谷子在拔節(jié)期施用尿素60 kg·hm-2，抽穗期施用尿素60 kg·hm-2。

（6）大豆整個生長周期追肥兩次（每次施用尿素60 kg·hm-2）。

（7）娃娃菜第1次追肥定植后15 d施用尿素60 kg·hm-2，硫酸鉀45 kg·hm-2；第2次追肥為定植后40 d施用尿素90 kg·hm-2，硫酸鉀60 kg·hm-2。

2019年在其基礎(chǔ)上全部種植娃娃菜。試驗為單因素隨機區(qū)組試驗設(shè)計，共7個處理，分別為7種娃娃菜茬口：娃娃菜連作（CCC）、西蘭花茬口（BMC）、谷子茬口（MMC）、洋蔥茬口（OMC）、大豆茬口（SMC）、馬鈴薯茬口（PMC）、大蔥茬口（GMC）。不同小區(qū)土壤施肥量一致（娃娃菜第1次追肥定植后20 d：尿素60 kg·hm-2，硫酸鉀45 kg·hm-2；第2次 追 肥 為 定 植 后40 d：尿 素90 kg·hm-2，硫酸鉀60 kg·hm-2），每個處理均3次重復(fù)。

1.3 試驗材料

2018、2019年供試品種：娃娃菜（金皇后）、西蘭花（耐寒優(yōu)秀）、谷子（張雜19）、洋蔥（紅箭）、大豆（寧黑一號）、馬鈴薯（荷蘭一號）、大蔥（當(dāng)?shù)匦∑贩N）。

1.4 土樣采集

使用取土器取土（對所用東西進行滅菌處理）。對收獲期根際土壤進行采集：采用5點法取樣，取0～20 cm土壤，先除去約5 cm厚表面土壤，挖取作物的完整根，輕輕抖去沒有根系的大土塊，用刷子刷去附在根毛上的土壤，即為根際土。將取好的土樣一部分放在無菌自封袋中，將其風(fēng)干，用于測定土壤養(yǎng)分指標(biāo)；另外一部分土樣迅速通過1 mm篩子去除雜物，裝在5 mm凍存管中，放入液氮中暫存，帶回實驗室放置在-80℃冰箱中，用于微生物高通量測序。

1.5 測定項目及方法

1.5.1 土壤化學(xué)性質(zhì)的測定

土壤有機質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定，土壤全氮采用凱氏定氮法測定，土壤全磷采用HClO4-H2SO4法測定，土壤有效磷采用NaHCO3-鉬銻抗比色法測定，土壤硝態(tài)氮采用紫外分光光度法測定，銨態(tài)氮采用硫酸鉀浸提-靛酚藍比色法測定，土壤速效鉀采用NH4OAc-火焰光度法測定，上述土壤指標(biāo)測定方法參照鮑士旦［12］《土壤農(nóng)化分析》。pH和電導(dǎo)率用1∶5土水比，使用pH計和電導(dǎo)率儀測定。

1.5.2 不同茬口娃娃菜產(chǎn)量測定

娃娃菜收獲期對每個小區(qū)隨機取10株，用于測定娃娃菜單株總重、凈球質(zhì)量。測定不同茬口每公頃娃娃菜總重。

1.5.3 土壤真菌DNA的提取與PCR擴增

利用Omega Soil DNA Kit試劑盒提取土壤真菌的總DNA。使用紫外定量設(shè)備（Nanodrop，NC2000）對DNA進行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。

對土壤真菌ITS1可擴增區(qū)段進行擴增，前引物序列5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，后引物序列5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′；且擴增片段大小為280 bp。

PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)緩沖液25.0 μL，25.0 μL的GC緩沖液，2.5 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，10 Umol·L-1正向引物和反向引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌超純水8.75 μL，Q5DNA聚合酶0.25 μL。擴增條件：98℃預(yù)變性2 min，98℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃伸展30 s，72℃終伸展5 min結(jié)束，30個循環(huán)，10℃下保存。PCR擴增產(chǎn)物由Illumina MiSeq測序平臺進行雙端測序，以上過程委托上海派森諾科技有限公司完成。

1.5.4 測序數(shù)據(jù)分析

高通量測序的原始數(shù)據(jù)根據(jù)序列質(zhì)量進行初步篩查，通過質(zhì)量初篩的原始序列按照index和Barcode信息，進行文庫和樣本劃分，并去除barcode序列。按照QIIME2 dada2分析流程或Vsearch的分析流程進行序列去噪或OTU聚類。使用QIIME2進行分析，對前述獲得序列按97%的序列相似度進行歸類與OTU劃分，將OTU代表序列通過Unite數(shù)據(jù)庫進行生物學(xué)分類注釋。繪制稀疏曲線反映測序深度是否合適，獲得的OTU表來計算豐富度指數(shù)Chao1和Observed_species以及多樣性指數(shù)Shannon和Simpson、均勻度指數(shù)Pielous_evenness、覆蓋率指數(shù)Goods_coverage。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010和SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行整理與統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析進行Duncan檢驗；利用Origin 2020與R繪制OTU稀疏曲線、土壤真菌OTU分布花瓣圖、α多樣性箱線圖、土壤真菌門、目及屬水平物種組成柱狀圖以及屬水平雙聚類熱圖；通過Canoco 5.0進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茬口娃娃菜根際土壤化學(xué)性質(zhì)的差異

由圖1所示，各處理土壤全磷含量從大到小依次為0.16、0.15、0.14、0.13、0.13、0.12、0.08 g·kg-1。土壤有效磷含量變化為CCC＜SMC＜OMC＜BMC＜PMC＜GMC＜MMC；土壤有機質(zhì)含量變化為OMC＜PMC＜CCC＜BMC＜SMC＜MMC＜GMC；土 壤 銨 態(tài) 氮含量變化為PMC＜CCC，OMC，GMC＜MMC＜BMC＜SMC；土壤硝態(tài)氮含量變化為PMC＜CCC＜OMC＜GMC＜MMC＜SMC＜BMC；土壤全氮含量變化為CCC＜OMC＜PMC＜BMC＜SMC＜GMC＜MMC；土壤速效鉀含量變化為CCC＜PMC＜OMC＜BMC＜GMC＜SMC＜MMC；土壤EC變化為PMC＜CCC＜OMC，BMC＜SMC＜GMC＜MMC；土壤pH變化為BMC＜MMC＜GMC＜OMC＜SMC＜CCC＜PMC。與CCC相比，除PMC土壤全磷含量降低了33.3%外，GMC、SMC、MMC、OMC、BMC處理土壤全磷含量均顯著上升，依次增加了33.3%、25.0%、71.74%、16.7%、8.3%、8.3%。各處理土壤有效磷含量顯著增加，MMC土壤有效磷含量最高，為85.25 mg·kg-1，土壤有效磷含量極顯著提高了316.9%。GMC土壤有機質(zhì)含量最高，為1.955%，顯著增加了49.1%；OMC土壤有機質(zhì)含量最低，為1.017%，降低了19.4%。SMC土壤銨態(tài)氮含量最高，為0.11 mg·kg-1，極顯著增加了57.1%，PMC土壤銨態(tài)氮含量最低，為0.06 mg·kg-1，降低了14.3%。BMC土壤硝態(tài)氮含量最高，為0.36 mg·kg-1，極顯著增加了500%，PMC土壤硝態(tài)氮含量最低，為0.05 mg·kg-1，下降了16.7%。其他處理土壤全氮含量均明顯提高，MMC土壤全氮含量最高，為1.11 g·kg-1，極顯著增加了126.5%。其他處理土壤速效鉀含量顯著增加，從小到大依次為243.28、250.80、269.21、288.56、322.75、378.47 mg·kg-1，依次提高了8.5%、11.8%、20.0%、28.7%、43.9%、68.7%。除PMC外，其他處理土壤EC值均明顯提高，其中MMC土壤EC為0.22mS·cm-1，極顯著上升了69.2%；PMC土壤EC為0.12 mS·cm-1，下降了7.7%。土壤pH在很大程度上影響作物根系正常生長，各處理土壤pH變化無顯著差異，其中PMC土壤pH較高，為9.1，提高了0.44%；BMC土壤pH最低，為8.84，降低了2.4%。

圖1 不同茬口娃娃菜根際土壤化學(xué)性質(zhì)的差異

2.2 不同茬口娃娃菜根際土壤樣本真菌測序深度及測序結(jié)果的分析

高通量測序結(jié)果顯示，7個樣本共獲得有效序列862144條，使用QIIME2并調(diào)用USEARCH檢查同時剔除嵌合體序列，去除不合格序列后共得到高質(zhì)量序列852269條，每個樣本高質(zhì)量序列占有效序列的比例都在98%以上，其有效序列表現(xiàn)為SMC＜BMC＜PMC＜CCC＜GMC＜MMC＜OMC。

稀疏曲線（Rarefaction curve）可以用來揭示土壤取樣的深度，說明取樣是否合理、取樣土壤微生物結(jié)構(gòu)是否能涵蓋所有微生物的多樣性。如圖2所示，在97%的相似度下，隨著測序數(shù)增加，7個處理Observed稀疏曲線變化均趨于平緩；且樣本序列數(shù)在80000左右時，OTU數(shù)基本達到飽和狀態(tài)，說明該試驗測序深度合理，在真實的土壤真菌環(huán)境中其真菌群落結(jié)構(gòu)可信度高，能夠真實地反映出這35個土壤樣本的真菌群落組成。

圖2 操作分類單元OTUs的Observed稀疏曲線

2.3 不同茬口娃娃菜根際土壤真菌花瓣圖分析

從不同茬口下娃娃菜根際土壤真菌OTU分布的花瓣圖可以清晰看出7個處理間真菌群落的重疊關(guān)系，每個橢圓代表一個樣本組，所有橢圓中間的重疊區(qū)域代表所有樣本組的共同含有OTU數(shù)，每個區(qū)塊的數(shù)字指示該區(qū)塊所包含OTU的數(shù)目。由圖3可知，7個處理共產(chǎn)生的OTU數(shù)為4573個，7個處理間共同擁有的OTU數(shù)為184個，占總OTU數(shù)的4.02%，在屬水平上共有的OTU主要屬于Archaeorhizomyces、Cladosporium；CCC、BMC、MMC、OMC、SMC、PMC和GMC中特有的OTU數(shù)分別為380、463、704、370、571、360和437個，分別占總OTU數(shù)的8.31%、10.12%、15.39%、8.09%、12.49%、7.87%和9.56%。CCC、BMC、MMC、OMC、SMC、PMC和GMC中包含的OTU數(shù)分別為564、647、888、554、755、544和621。7個 處 理 所包含的OTU數(shù)和特有的OTU數(shù)均以MMC最多，PMC最少；與CCC相比，OMC、PMC中的OTU數(shù)均呈下降趨勢，且分別低了1.8%、3.5%，MMC的OTU數(shù)比CCC高了57.4%。

圖3 不同茬口娃娃菜根際土壤的真菌OTU分布花瓣圖

2.4 不同茬口娃娃菜根際土壤真菌群落Alpha多樣性的影響分析

如圖4所示，土壤真菌豐富度指真菌群落種類的數(shù)目，Chao1和Observed_species指數(shù)越大，表明該樣本群落的豐富度越高。7個處理Chao1、Observed_species指數(shù)均表現(xiàn)為PMC＜CCC＜OMC＜BMC＜GMC＜SMC＜MMC；MMC的樣本群落豐富度最高，PMC的樣本群落豐富度最低，與CCC相比，MMC處理的土壤真菌Chao1、Observed_species指數(shù)分別增加了58.1%、57.9%，PMC處理Chao1、Observed_species指數(shù)均降低了5.9%。土壤真菌均勻度指不同真菌在群落中分布的數(shù)量差異，Pielous_evenness指數(shù)越高表明真菌群落越均勻，各處理Pielous_evenness指數(shù)表現(xiàn)為GMC＜SMC＜OMC＜PMC＜CCC＜BMC＜MMC；與CCC相比，MMC處理Pielous_evenness指數(shù)增加了11.5%，而GMC處理Pielous_evenness指數(shù)下降了15.8%。Shannon或Simpson指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高，Shannon指數(shù)對群落的豐富度以及稀有OTU更敏感；而Simpson指數(shù)對均勻度和群落中的優(yōu)勢OTU更敏感。7個處理Shannon指數(shù)表現(xiàn)為GMC＜OMC＜PMC＜SMC＜CCC＜BMC＜MMC；與CCC相比，MMC處理下Shannon指數(shù)最高，增加了19.9%，真菌群落樣本多樣性提高，而GMC處理Shannon指數(shù)減少了15.8%；各處理Simpson指數(shù)表現(xiàn)為SMC＜GMC＜OMC＜PMC＜CCC＜BMC＜MMC；與CCC相比，MMC處理下Simpson指數(shù)最高，增加了9.7%，SMC處理Shannon指數(shù)減少了13.5%。

圖4 不同茬口娃娃菜根際土壤真菌群落Alpha多樣性指數(shù)分組箱式圖

2.5 不同茬口娃娃菜根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成及相對豐度的影響分析

如圖5所示，門水平下除OMC外，各處理土壤真菌相對豐度最高的均為子囊菌門（Ascomycota），油壺菌門（Olpidiomycota）次之，各處理子囊菌門相對豐度差異明顯。子囊菌門和油壺菌門為各處理土壤真菌的優(yōu)勢菌門，占總豐度的64.8%～81.3%。子囊菌門相對豐度表現(xiàn)為OMC＜SMC＜BMC＜CCC＜GMC＜PMC＜MMC；MMC處理子囊菌門相對豐度最高，為55.6%，與CCC相比，MMC處理子囊菌門相對豐度增加了23.4%。油壺菌門相對豐度表現(xiàn)為MMC＜BMC＜CCC＜GMC＜PMC＜SMC＜OMC；OMC處理油壺菌門相對豐度最高，為37.5%，與CCC相比，OMC處理下其相對豐度增加了42.1%。擔(dān)子菌門（Mortierellomycota）和被孢霉門（Chytridiomycota）2個的相對豐度之和為3.5%～5.6%，7個處理間相對豐度差異不明顯；其他真菌的相對豐度為14.5%～29.5%，占比較大。壺菌門（Basidiobolomycota）等5門真菌相對豐度只占了0.35%～1.15%。

圖5 不同茬口娃娃菜根際土壤真菌門分類水平組成和分布

由圖6可知，目水平下除MMC外，各處理土壤真菌相對豐度最高的為油壺菌目，各處理之間差異性明顯，其相對豐度表現(xiàn)為MMC＜BMC＜CCC＜GMC＜PMC＜MMC＜OMC；OMC油壺菌目相對豐度最高，為37.5%，MMC最低，為9.17%。與CCC相比，MMC處理下油壺菌目相對豐度極顯著降低了62.7%，且柔膜菌目（Helotiales）相對豐度顯著降低了54.8%，銀耳目（Tremellales）相對豐度顯著降低了69.01%，格孢腔菌目（Pleosporales）相對豐度極顯著增加了89.01%。

圖6 不同茬口娃娃菜根際土壤真菌目分類水平組成和分布

由圖7可知，屬水平下各處理土壤真菌相對豐度最高的為油壺菌屬（Olpidium），占土壤真菌總相對豐度的9.13%～37.43%，即為優(yōu)勢菌屬。各處理的油壺菌屬相對豐度表現(xiàn)為：MMC＜BMC＜CCC＜GMC＜PMC＜SMC＜OMC；各處理的油壺菌屬相對豐度差異明顯。OMC處理油壺菌屬相對豐度最高，為37.43%，與CCC相比，其相對豐度顯著提高了42.7%，MMC處理油壺菌屬相對豐度極顯著下降了65.2%，被孢霉屬相對豐度極顯著提高了68.8%，炭疽菌屬相對豐度極顯著下降了96%。Plectosphaerella、鐮刀菌屬（Fusarium）、炭疽菌屬（Colletotrichum）均為致病菌。炭疽菌屬相對豐度顯著下降，降低了輪作后娃娃菜病害發(fā)生。

圖7 不同茬口娃娃菜根際土壤真菌屬分類水平組成和分布

2.6 不同茬口娃娃菜根際土壤真菌屬分類水平類群比較

將娃娃菜各茬口根際土壤前50位真菌屬的豐度數(shù)據(jù)繪制成熱圖。由圖8可知，不同娃娃菜茬口作物土壤真菌群落分為5大類，MMC歸為一類，SMC為一類，GMC與PMC較近為一類，CCC為一類，OMC與BMC為一類?？梢钥闯觯琈MC處理下土壤真菌屬與其他處理差異明顯。與CCC相比，8個真菌屬（Epicoccum、Cercophora、Chrysosporium、Acremonium、Stagonosporopsis、Mycosphaerella、Metarhizium、Pyrenochaetopsis）主要集中在MMC中，其對土壤真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。

圖8 真菌屬分類水平物種組成雙聚類圖

2.7 土壤真菌優(yōu)勢菌屬與土壤化學(xué)性質(zhì)相關(guān)性分析

將土壤真菌優(yōu)勢菌屬與土壤化學(xué)性質(zhì)進行Pearson相關(guān)分析，各處理土壤全氮、有效磷、有機質(zhì)含量影響土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)。由表2可知，根際土 壤pH與Botryotrichum呈 正 相 關(guān)（P＜0.05）；EC與Fusarium、Mortierella呈正相關(guān)（P＜0.05）；土壤全磷含量與Botryotrichum呈正相關(guān)（P＜0.05）；土壤全氮、有效磷含量與Fusarium（P＜0.01）及Nectriaceae、Mortierella（P＜0.05）呈正相關(guān)，與Colletotrichum呈負相關(guān)（P＜0.05）；土壤速效鉀含量與Mortierella（P＜0.05）呈正相關(guān)；土壤有機質(zhì)含量與Fusarium、Nectriaceae（P＜0.05）及Mortierella（P＜0.01）呈正相關(guān)；土壤硝態(tài)氮與Botryotrichum呈負相關(guān)（P＜0.05），與Alternaria呈正相關(guān)（P＜0.05）；土壤銨態(tài)氮含量與Plectosphaerella（P＜0.01）、Alternaria（P＜0.05）呈正相關(guān)。

表2 不同茬口娃娃菜根際土壤化學(xué)性質(zhì)與真菌優(yōu)勢菌屬相關(guān)性

2.8 不同茬口娃娃菜產(chǎn)量的差異

由表3可知，各茬口娃娃菜單株總重SMC最大，為1207.69 g，其次是MMC、GMC、BMC；凈球質(zhì)量MMC最大，為799.50 g，其次是SMC、GMC、OMC。與CCC相比較，各茬口娃娃菜產(chǎn)量顯著提高，其中SMC產(chǎn)量最高，為73674.90 kg·hm-2，提高了10.7%，MMC的產(chǎn)量與SMC相差不多，為73510.50 kg·hm-2，提高了10.4%；其次是GMC為73302.30 kg·hm-2，提高了10.1%。

表3 不同茬口娃娃菜產(chǎn)量

2.9 主成分分析

對不同茬口娃娃菜根際土壤真菌Alpha多樣性指數(shù)與土壤化學(xué)性質(zhì)進行主成分分析，由表4可知，第一主成分貢獻率為88.1%，前兩個主成分累計貢獻率為99.8%，可以很好地說明各茬口土壤真菌多樣性與土壤養(yǎng)分之間的關(guān)系。由圖9可知，CCC與其他處理在不同象限分布，與CCC的距離表現(xiàn)為PMC＜OMC＜BMC＜GMC＜SMC＜MMC，因此可以看出，MMC與CCC距離最遠，MMC為娃娃菜最適茬口，實際生產(chǎn)種植中應(yīng)選擇MMC或其他旱地作物與娃娃菜實行水旱輪作，緩解連作障礙。

表4 不同茬口主成分分析 （%）

圖9 主成分分析結(jié)果

3 討論

3.1 不同茬口對娃娃菜根際土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

作物間按照一定時間順序進行輪換倒茬種植，利用不同作物對茬口水分、養(yǎng)分等環(huán)境因素需求的差異，不僅能使作物穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，也可促進資源集約利用［13］。土壤養(yǎng)分是土壤生態(tài)系統(tǒng)十分重要的組成部分和土壤基礎(chǔ)肥力的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是土壤理化性狀和生物學(xué)特性的綜合反映，直接影響到土壤或土地的生產(chǎn)力，也是各種作物生長所需營養(yǎng)元素的基本來源，并受不同耕作方式和土壤利用方式的顯著影響［14］。

元晉川等［15］研究不同茬口對冬油菜養(yǎng)分積累時發(fā)現(xiàn)：種植大豆、毛苕子均顯著提高后茬根際土壤堿解氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷含量，并且大豆茬口提升土壤理化性質(zhì)效果最為明顯。禚其翠等［16］研究前茬作物對煙田土壤養(yǎng)分的影響表明，大蒜和綠肥這兩種前茬處理，能夠降低土壤pH，顯著增加烤煙根際土壤有效磷、速效鉀及有機質(zhì)含量，這一研究結(jié)果與本試驗研究結(jié)果基本一致。牛倩云等［17］研究表明，通過輪作能增加土壤堿解氮、有效磷、速效鉀和有機質(zhì)含量，并且在酸性環(huán)境中適合絕大多數(shù)真菌生長繁殖，而細菌主要適宜在中性環(huán)境中生長繁殖。孫倩等［18］研究不同輪作模式對作物根際土壤養(yǎng)分及真菌群落組成影響表明，輪作后土壤pH均有所下降，而土壤有機質(zhì)、全磷、全鉀、全氮含量經(jīng)輪作后均明顯增加，這一結(jié)果與本試驗研究結(jié)果相一致。劉旭等［19］研究得出的結(jié)論為不同地區(qū)不同種植模式及不同作物種類均會影響土壤理化性質(zhì)，對土壤肥力的影響也不同。

3.2 不同茬口對娃娃菜根際土壤真菌多樣性的影響

土壤微生物在土壤生態(tài)功能中起著至關(guān)重要的作用，在物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化過程中具有重要影響，例如土壤微生物參與土壤有機質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化、土壤養(yǎng)分合成與利用、土壤團聚體形成、土壤重金屬及有機污染物降解、溫室氣體排放等［20-21］。土壤真菌多樣性與土壤有機質(zhì)含量密切相關(guān)，土壤有機質(zhì)含量提高，增加土壤真菌多樣性［22］。MMC處理真菌多樣性指數(shù)明顯高于連作，孫倩等［18］研究發(fā)現(xiàn)可能是土壤pH降低所致，因為土壤pH下降會刺激土壤中適宜酸性環(huán)境真菌的生長繁殖；與CCC對比，MMC土壤有機質(zhì)含量有所增加，且MMC下土壤pH下降，增加了適宜酸性環(huán)境生長的真菌，其真菌多樣性指數(shù)得到提高。

3.3 不同茬口娃娃菜根際土壤養(yǎng)分對真菌群落的影響

土壤化學(xué)性質(zhì)對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大，本試驗研究表明，土壤中全氮、有效磷、有機質(zhì)含量為影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因子。王楠等［23］研究毛竹闊葉林受到模擬酸雨脅迫的影響，通過冗余、相關(guān)性分析得出土壤全氮顯著影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，這一結(jié)論與本試驗研究結(jié)果相一致。王濤等［24］通過冗余分析得出，影響賀蘭山丁香生長的真菌和細菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素之一是土壤有效磷含量，本試驗中MMC土壤有效磷含量增加，可能是因為MMC下娃娃菜根際土壤解磷微生物較為充足。丁建莉等［25］利用CCA分析，明確了有效磷、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是影響東北黑土土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化的重要土壤養(yǎng)分因素。

輪作后各處理子囊菌門相對豐度有明顯差異，GMC、PMC、MMC處理土壤真菌優(yōu)勢菌群——子囊菌門相對豐度顯著提高，與陽祥等［26］對典型稻田土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性對比研究的結(jié)果相一致。油壺菌屬、油壺菌目均為一種有害微生物，能夠引發(fā)植株病害，導(dǎo)致幼苗死亡；毛殼菌屬能夠降解纖維素，參與土壤碳氮循環(huán)，產(chǎn)生抗生素或溶菌來抵抗土傳病原體［27-28］。與CCC相比，MMC處理下油壺菌屬與油壺菌目相對豐度均顯著降低，毛殼菌屬相對豐度明顯提高，利于誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性，減少植株病害的發(fā)生，提高土壤養(yǎng)分。子囊菌門是一類腐生真菌，能產(chǎn)生胞外酶更好地分解土壤中一些難降解的物質(zhì)，在降解土壤有機質(zhì)中起著重要作用，有利于土壤養(yǎng)分循環(huán)轉(zhuǎn)化，促進土壤微生物增長與繁殖［29-30］，MMC這種模式為子囊菌門真菌提供了適宜條件，使得子囊菌門相對豐度提高，利于分解土壤殘渣，提高土壤養(yǎng)分；被孢霉屬真菌在植物殘體的快速分解過程中發(fā)揮著重要作用，有效提高土壤養(yǎng)分濃度［31］。可見，MMC處理可有效改善根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，降低土壤病原菌豐度，增加拮抗菌豐度；同時，可減少娃娃菜病害發(fā)生，提高根際土壤養(yǎng)分。

4 結(jié)論

綜上所述，研究不同茬口種植娃娃菜后根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化特征對緩解農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中娃娃菜的連作障礙具有重要意義。本試驗利用高通量測序技術(shù)，探索不同茬口種植娃娃菜后對土壤化學(xué)性質(zhì)及真菌群落的影響，得出以下結(jié)論：MMC、SMC、GMC這3個處理均能有效提高娃娃菜根際土壤化學(xué)性質(zhì)，增加土壤真菌群落豐富度及多樣性；不同茬口根際土壤優(yōu)勢真菌為子囊菌門（Ascomycota）與油壺菌門（Olpidiomycota），屬水平下油壺菌屬（Olpidium）為優(yōu)勢菌屬；主成分分析可知，各處理與CCC距離相比，MMC最遠；MMC、SMC、GMC處理均顯著提高了娃娃菜的產(chǎn)量。綜合考慮，MMC為娃娃菜種植的最適茬口，實際生產(chǎn)種植中應(yīng)選擇MMC或其他旱地作物與娃娃菜實行水旱輪作以緩解連作障礙。