白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子1通路改善大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機制

王 瑞 高 釗 張曉東 樊貝貝 孫夢娜 王 偉 曾廣偉

(1 空軍軍醫(yī)大學附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科,西安,710032; 2 西安國際醫(yī)學中心醫(yī)院心臟內(nèi)科,西安,710100)

心肌缺血指心臟的血液灌注降低,誘使心臟的供氧減少,心肌能量代謝異常,無法促進心臟正常工作的一種病理狀態(tài)[1]。近年來,隨著人民生活水平的提高,心肌缺血的患病率和發(fā)病率逐年升高,目前已成為中老年人的常見病和多發(fā)病。缺血性心臟病是造成人類死亡的關鍵誘因之一,心肌缺血再灌注(Myocardial Ischemia/Reperfusion,MI/R)損傷是一種常見的病理生理過程,但是發(fā)生發(fā)展機制繁雜,至今尚未完全研究清楚。目前,治療冠心病的主要方法為冠狀動脈介入治療、溶栓治療等[2],但對于MI/R造成的組織損傷尚無有效的防治方法。因此,探討MI/R發(fā)病機制,研究治療的新途徑,對于MI/R的防治具有重要意義。炎癥反應在心肌缺血再灌注損傷發(fā)病過程中具有重要作用,已有研究表明炎癥反應是MI/R損傷的主要病理機制之一,在心肌缺血患者中炎癥反應明顯升高[3-4]。白藜蘆醇(Resveratrol,Res)是一種多酚化合物,葡萄酒中含量較高。Res具有廣泛的藥理作用,包括抗癌、保護神經(jīng)元、抗衰老等作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)預處理Res對MI/R損傷大鼠的具有保護作用[6-7],但是具體的保護機制尚未完全研究清楚。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silent Information Regulator 1,Sirt1)是一種抗衰老蛋白,幾乎在哺乳動物細胞中均有表達,涉及細胞內(nèi)能量代謝、抗細胞凋亡、抗氧和抗炎等生物作用[8]。研究顯示，Sirt1可改善氧化應激和炎癥反應,還可減輕缺血再灌注所致腦組織損傷[9]。Res作為Sirtl的激活劑,研究發(fā)現(xiàn)Res的保護作用與激活Sirtl密切相關[10]。Res可通過激活Sirt1抑制核因子κB炎癥反應通路,該研究提示Res可通過Sirt1/核因子κB通路減少炎癥介質(zhì)[11],但是Res是否可通過Sirt1/核因子κB通路改善心肌缺血損傷仍值得進一步研究。眾所周知,線粒體是缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)損傷的重要靶點。心肌I/R損傷不僅導致線粒體能量產(chǎn)生障礙,而且還導致線粒體鈣超載、線粒體膜電位喪失、線粒體通透性轉換孔開放,進而導致線粒體介導的心肌細胞凋亡[1]。研究表明,多種心臟保護劑(如維生素C和硫化氫)可以抑制再灌注期間線粒體鈣超載,從而減少線粒體通透性轉換孔的過度開放,最終減少細胞凋亡[12]。然而,目前Res是否可通過Sirt1改善心肌缺氧缺血損傷誘導的線粒體功能障礙

因此本研究將對通過建立MI/R模型和心肌細胞缺氧/復氧模型,進一步探討Res改善心肌缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取60只6～7周齡雄性健康SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g。SD大鼠購自空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院骨科實驗室，許可證號：SYXK(陜)2020-007。實驗前進行適應性飼養(yǎng)1周,實驗室環(huán)境控制室內(nèi)濕度40%～60%,溫度20～24 ℃,12 h光/暗循環(huán),不限制大鼠飲食。本研究通過空軍軍醫(yī)大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會倫理審核(倫理審批號:TDLL-2018010-26)。

1.1.2 藥物 白藜蘆醇(上海寶曼生物科技有限公司,貨號:D0041),

1.1.3 試劑與儀器 大鼠心臟來源的H9c2細胞(ATCC,美國,貨號:bio-54156),二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)(Sigma公司,美國,貨號:D2650),Sirt1抑制劑EX527(MCE公司,美國,貨號:HY-15452A),肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase MB,CK-MB)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:H197-1),乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A020-1-2),TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:H052-1),IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:H007),一抗Sirt1抗體(BioVision,美國,貨號:6137-100),一抗核因子κB抗體(Proteintech公司,美國,貨號:14220-1-AP),辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(上海聯(lián)邁生物工程有限公司,貨號:LM0208),四甲基偶氮唑鹽(Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT)試劑盒(愛必信(上海)生物科技有限公司,貨號:abs42022059),Rhod-2 AM(愛必信(上海)生物科技有限公司,貨號:abs47045183)、鈣黃綠素乙酰氧基甲基酯(Calcein-acetoxymethylester，Calcein AM)(愛必信(上海)生物科技有限公司,貨號:abs42014734),CoCl2(上海雅吉生物科技有限公司,貨號:YJ-34224R)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后,按照隨機數(shù)字表法隨機分為假手術組、心肌缺血再灌注模型組(MI/R組)、白藜蘆醇組(Res組)、Sirt1抑制劑EX527組(EX527組),每組15只。根據(jù)文獻[13]方法采用冠狀動脈結扎法建立MI/R損傷大鼠模型。假手術組:大鼠開胸但不結扎冠狀動脈。Res和EX527分別溶于5% DMSO,Res組:大鼠于缺血前15 min和再灌注前1 min經(jīng)尾靜脈注入Res(20 mg/kg);EX527組:大鼠給藥時間同Res組,經(jīng)尾靜脈注入Res(20 mg/kg)+EX527(1 μg/kg)。

1.2.2 心功能檢測 麻醉后將大鼠仰位固定,經(jīng)右側頸總動脈插管入左心室,聯(lián)接心電圖,記錄左心室舒張末期壓(Left Ventricular End Dilated Pressure,LVEDP)、左心室收縮壓(left Venteicular Systolic Pressuer,LVSP)、左室內(nèi)壓力變化最大上升和下降速率(±dp/dt)。

1.2.3 CK-MB、LDH、炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)水平檢測 再灌注2 h后,取腹主動脈血5 mL,離心后取上清液,置于-80 ℃冰箱備用。酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血清心肌損傷標志物CK-MB、LDH和炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6水平。

1.2.4 心肌梗死面積測定 實驗結束后,取大鼠心臟,去除多余組織和血水,濾紙吸干后稱重。切片,氮藍四唑溶液恒溫染色,梗死區(qū)心肌為淡紅色或不著色,正常心肌為暗紫色。梗死范圍=梗死區(qū)面積/左心室面積×100%。

1.2.5 心肌髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活力 取實驗大鼠部分心肌組織,去除多余組織、沖洗后勻漿,離心(-4 ℃,15 min)取上清液,采用比色法并測定吸光度(OD)值,計算MPO活力,具體相關步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法測定Sirt1和核因子κB蛋白表達水平 取大鼠心肌組織備用,吸干多余水分、血絲,去掉多余組織殘渣,依次稱重。將H9c2細胞裂解。按照說明書進行蛋白定量測定并計算上樣體積,凍存?zhèn)溆?。實驗前根?jù)目的蛋白的分子量配置分離膠和濃縮膠,分別37 ℃烘箱孵育后,按照定量計算的上樣量進行上樣并電泳,電泳后按照分子量切膠轉膜,封閉2 h,然后室溫孵育一抗Sirt1(1∶1 000)和核因子κB(1∶1 000)過夜。第2天洗滌3次,10 min/次,再室溫孵育二抗2 h,同樣洗滌3次后顯影成像,保存圖片后進行灰度值掃描和統(tǒng)計分析。

1.2.7 H9c2細胞培養(yǎng)和缺氧/復處理 H9c2細胞用含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，F(xiàn)BS)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的低糖杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle Medium，DMEM)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)基,用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)沖洗1次,加入缺氧緩沖液:1.0 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L MgCl2、139 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、5 mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid,HEPES]、20 mmol/L乳酸鈉。在MIC-101細胞低氧培養(yǎng)箱(5% CO2和95% N2)中于37 ℃孵育16 h模擬缺氧損傷。最后,在常氧條件下,將H9c2細胞置于無胎牛血清DMEM低糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 h,同時給予不同藥物處理。

1.2.8 細胞分組 H9c2細胞分為5組:1)對照組:在正?？諝鈼l件下培養(yǎng)16 h,然后用無血清DMEM代替培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。2)缺氧/復氧組:細胞缺氧培養(yǎng)16 h,再用無血清DMEM復氧培養(yǎng)4 h。3)Res組:細胞缺氧培養(yǎng)16 h,用無血清DMEM復氧培養(yǎng)時加入20 mmol/LRes處理4 h。4)EX527組:細胞缺氧培養(yǎng)16 h,用無血清DMEM復氧培養(yǎng)時加入1 μmol/L EX527處理4 h。

1.2.9 細胞活力檢測 細胞活力采用MTT法檢測。H9c2細胞培養(yǎng)在96孔板中,以每孔1×105個細胞的密度接種。缺氧/復氧損傷后,用MTT(5 mg/mL)孵育細胞。4 h后丟棄上清液,每孔加入二甲基亞砜200 mL。用Bio-RAD Model 680型酶標儀檢測490 nm處的吸光度。

1.2.10 線粒體鈣離子濃度檢測 用Rhod-2 AM檢測線粒體鈣離子(Ca2+)濃度。細胞5×104個/mL的濃度培養(yǎng)在共聚焦培養(yǎng)皿中,與5 mmol/LRod-2 AM避光孵育20 min。用PBS洗滌后,分別在552 nm的激發(fā)波長和581 nm的發(fā)射波長下采集圖像。

1.2.11 線粒體通透性轉換孔開放程度的測定 用Calcein AM和CoCl2測定線粒體通透性轉換孔開放程度。細胞用1 mmol/L Calcein AM和1 mmol/L CoCl2避光孵育15 min,然后用PBS清洗兩次。分別在494 nm的激發(fā)波長和517 nm的發(fā)射波長下用FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡掃描圖像。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能的比較 與假手術組比較,MI/R組大鼠的LVSP、+dp/dtmm和-dp/dtmm均明顯降低,LVEDP升高(P<0.05)。與MI/R組比較,Res組大鼠LVSP、+dp/dtmm和-dp/dtmm均明顯增加,LVEDP減少(P<0.01),但是Sirt1的抑制劑EX527可逆轉Res對MI/R大鼠心肌血流量的改善作用(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心功能的比較

2.2 心肌梗死面積的比較 與假手術組比較,MI/R組大鼠心肌梗死面積明顯升高(P<0.05);與MI/R組比較,Res組大鼠心肌梗死面積減少(P<0.01),但Sirt1的抑制劑EX527組可逆轉Res對MI/R大鼠心肌梗死面積的減少作用(P<0.05)。見圖1。

圖1 白藜蘆醇對MI/R大鼠心肌梗死面積的影響

2.3 各組大鼠Sirt1、核因子κB蛋白表達水平比較 與假手術組比較,MI/R組大鼠核因子κB表達水平均明顯升高,Sirt1水平降低(P<0.05);與MI/R組比較,Res組大鼠核因子κB表達水平均明顯降低,Sirt1水平升高(P<0.05);但是Sirt1的抑制劑EX527組可逆轉Res對MI/R大鼠Sirt1/核因子κB通路的改善作用(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠Sirt1、核因子κB蛋白表達水平比較

2.4 各組大鼠肌酸激酶同工酶和乳酸脫氫酶比較 與假手術組比較,MI/R組大鼠心肌損傷標志物CK-MB和LDH均明顯升高(P<0.05)。與MI/R組比較,Res組大鼠CK-MB和LDH均明顯降低(P<0.05),但是Sirt1的抑制劑EX527組可逆轉Res對MI/R大鼠心肌損傷標志物的改善作用(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肌酸激酶同工酶和乳酸脫氫酶比較

2.5 各組大鼠炎癥介質(zhì)比較 與假手術組比較,MI/R組大鼠血清炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-6的水平均明顯升高(P<0.05)。與MI/R組比較,Res組大鼠TNF-α和IL-6的水平明顯下降(P<0.05),但是Sirt1的抑制劑EX527組可逆轉Res對MI/R大鼠炎癥反應的改善作用(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠炎癥介質(zhì)比較

2.6 各組大鼠髓過氧化物酶活力比較 與假手術組比較,M/IR組大鼠MPO活力均明顯升高(P<0.05)。與MI/R組比較,Res組大鼠MPO活力明顯下降(P<0.05),但是Sirt1的抑制劑EX527組可逆轉Res對MI/R大鼠MPO活力的改善作用(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠髓過氧化物酶活力比較

2.7 組H9c2細胞Sirt1蛋白表達和細胞活力比較 與對照組比較,缺氧/復氧組H9c2細胞的Sirt1蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。與缺氧/復氧組比較,Res組H9c2細胞的Sirt1蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。與Res組比較,EX527組H9c2細胞的Sirt1蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。與對照組比較,缺氧/復氧組H9c2細胞活力明顯下降(P<0.05)。與缺氧/復氧組比較,Res組H9c2細胞的活力明顯升高(P<0.05)。與Res組比較,EX527組H9c2細胞的活力明顯下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組H9c2細胞Sirt1蛋白表達和細胞活力比較

2.8 各組H9c2細胞線粒體Ca2+水平比較 與對照組比較,缺氧/復氧組H9c2細胞的線粒體Rhod-2相對熒光強度明顯升高(P<0.05)。與缺氧/復氧組比較,Res組H9c2細胞的線粒體Rhod-2相對熒光強度明顯下降(P<0.05)。與Res組比較,EX527組H9c2細胞的線粒體Rhod-2相對熒光強度明顯升高(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組H9c2細胞線粒體Ca2+水平比較

2.9 各組H9c2細胞線粒體通透性轉換孔開放程度比較 與對照組比較,缺氧/復氧組H9c2細胞的Calcein相對熒光強度明顯下降(P<0.05)。與缺氧/復氧組比較,Res組H9c2細胞的Calcein相對熒光強度明顯升高(P<0.05)。與Res組比較,EX527組H9c2細胞的Calcein相對熒光強度明顯下降(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組H9c2細胞線粒體通透性轉換孔開放程度比較

3 討論

心肌缺血系指各種原因引起的冠狀動脈血流量減少,心肌氧等物質(zhì)供應不足以及代謝產(chǎn)物清除遇到障礙的臨床癥狀,主要表現(xiàn)為心律失常、微血管阻塞、心肌細胞凋亡等[14]。隨著人們生活方式與飲食結構的變化,心肌缺血發(fā)病率和致病率逐年升高。MI/R指心肌組織血流供應被中斷一段時間后恢復正常灌注時,造成心肌功能異常和組織損傷的病理過程[15]。

臨床發(fā)現(xiàn),心肌缺血一段時間再灌注后,發(fā)生炎癥反應、細胞能量代謝異常等癥狀[16]。研究表明,MI/R早期造成的炎癥反應是導致心肌組織繼發(fā)性損傷的關鍵因素,繼而刺激機體產(chǎn)生一系列的病理級聯(lián)反應[17]。CK-MB為心肌細胞內(nèi)特征性的同工酶,主要存在于心肌組織,可反映心肌細胞損傷程度[18]。LDH廣泛分布心肌組織,是判斷心肌疾病發(fā)展的常用指標[19]。本研究結果同樣顯示MI/R大鼠心功能發(fā)生損傷、心肌梗死面積和心肌損傷標志物CK-MB、LDH水平均明顯高于假手術組。

白藜蘆醇(Res)是一種多酚類化學物質(zhì),主要存在于紅酒和葡萄中,具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎等作用。Res可有效改善MI/R損傷的心肌梗死面積和凋亡水平[20]。有研究發(fā)現(xiàn),Res可通過調(diào)控血管生成、抗炎、抗氧化等發(fā)揮保護心肌的作用[21]。本研究結果同樣顯示,MI/R大鼠經(jīng)Res治療后可明顯改善大鼠的心功能發(fā)生損傷、心肌梗死面積、MPO活力和炎癥反應。

Res是Sirtl激活劑,Res可通過激活Sirt1發(fā)揮抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)Sirtl在MI/R損傷中發(fā)揮重要的保護作用[22]。核因子κB是炎癥反應中重要的調(diào)節(jié)因子,可間接促進炎癥反應[23]。在腦缺血后Sirt1可通過抑制核因子κB發(fā)揮神經(jīng)保護作用[24-25]。本研究結果同樣顯示,Res可明顯升高Sirt1的蛋白表達水平,而降低核因子κB表達水平。Sirt1的抑制劑EX527可逆轉Res對MI/R大鼠心功能、心肌梗死面積、炎癥反應和MPO活力的改善作用,且升高核因子κB表達水平。

多種心臟保護劑(如維生素C和硫化氫)可以抑制再灌注期間線粒體鈣超載,從而減少線粒體通透性轉換孔的過度開放,最終減少細胞凋亡[26]。線粒體鈣超載是心肌I/R損傷的重要因素。鈣離子水平的變化是線粒體功能的指標[27]。研究表明,線粒體鈣超載導致線粒體去極化改變,最終導致ATP消耗和細胞死亡。本研究用Rhod-2 AM標記心肌線粒體,觀察Res對線粒體鈣離子變化的影響。結果顯示,Res組的Rhod-2熒光強度明顯低于缺氧/復氧組,提示Res能抑制I/R損傷所致的心肌細胞線粒體鈣超載。

高線粒體鈣離子水平可以觸發(fā)許多反應,如線粒體通透性轉換孔開放,最終導致線粒體介導的細胞凋亡。線粒體通透性轉換孔是線粒體內(nèi)膜和線粒體外膜之間的通道。在生理條件下,線粒體通透性轉換孔被周期性地打開。線粒體通透性轉換孔開放是I/R損傷的主要機制[28]。本研究采用Calcein和CoCl2染色顯示線粒體通透性轉換孔的開放。當線粒體通透性轉換孔被周期性打開時,Calcein進入線粒體,并在與線粒體內(nèi)膜上的NAD+結合時發(fā)出綠色熒光。如果線粒體通透性轉換孔過度開放,NAD+就會從孔中滲出,與細胞質(zhì)Calcein結合產(chǎn)生的綠色熒光會被CoCl2猝滅,線粒體熒光強度會變暗,間接反映線粒體內(nèi)膜的通透性。本研究結果顯示,Res組的綠色熒光強度明顯高于缺氧/復氧組,表明Res對缺血再灌注損傷引起的線粒體通透性轉換孔過度開放有明顯的抑制作用。

最近有報道稱,Sirt1也存在于線粒體內(nèi),并且與線粒體DNA密切相關。它與線粒體轉錄因子A相互作用,調(diào)節(jié)線粒體的生物發(fā)生[29]。此外,低氧條件下的線粒體延伸是通過Sirt1介導的線粒體融合蛋白1去乙酰化來調(diào)節(jié)的[30]。在本研究中,缺氧/復氧處理降低了心肌細胞中的Sirt1表達,而Res可上調(diào)Sirt1的表達。此外,Sirt1的抑制劑EX527可逆轉Res對I/R損傷所致的線粒體鈣超載和線粒體通透性轉換孔過度開放的影響。上述結果提示,Res對I/R處理的心肌細胞線粒體功能的改善作用也是部分通過調(diào)節(jié)Sirt1實現(xiàn)的。

綜上所述,本研究結果表明Res可通過激活Sirt1在一定程度上抑制核因子κB通路,降低炎癥介質(zhì)水平,改善MI/R大鼠心功能、心肌梗死面積和MPO活力。Res能抑制I/R誘導的心肌細胞線粒體鈣超載和線粒體通透性轉換孔過度開放。由此可見,Res具有較好地保護心肌缺血再灌注損傷的作用,其機制可能與Sirt1信號通路。