煙葉病害大數(shù)據(jù)庫(kù)建立與運(yùn)用

戴 恩，田 華，李 龍，周 亮，翟國(guó)帥

1.云南省煙草公司 昆明市公司，云南昆明 650051；2.北京佰司特貿(mào)易有限責(zé)任公司，北京 100021

1 煙草花葉病的概述情況

云南是中國(guó)最重要、規(guī)模最大的“兩煙”生產(chǎn)基地，煙草是云南省重要經(jīng)濟(jì)支柱之一。云南的高原氣候和土壤條件為煙草作物種植提供了良好的天然生態(tài)環(huán)境，加上科學(xué)種植和精心管理，建立和鞏固了優(yōu)質(zhì)煙葉基地。然而，病毒病的普遍發(fā)生嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，在我國(guó)部分煙區(qū)已上升為煙草的第一大病害[1-2]。

煙草花葉病毒 （Tobacco mosaic virus，TMV），為RNA病毒，是煙草花葉病等的病原體，屬于Tobamovirus群[3]。TMV侵染煙草引起的煙草病毒病是我國(guó)煙草上發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的病害之一，廣泛分布于我國(guó)廣大煙區(qū)，尤其是南方煙區(qū)發(fā)生較為普遍且日益加重，一般發(fā)病率為5%～20%，給煙草產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。目前煙草普通花葉病還沒有治療的特效藥，防治時(shí)一定要做到“預(yù)防為主、綜合防治”[5]。

2 煙草花葉病毒的檢測(cè)方法簡(jiǎn)介

時(shí)間分辨熒光分析法（Time-resolved fluoraimmunoas say，TRFIA）是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新的標(biāo)記免疫分析技術(shù)，使用三價(jià)銪離子（Eu3+）螯合物作為示蹤劑標(biāo)記抗體與相應(yīng)待測(cè)抗原特異性結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在增強(qiáng)液中解高后在特定的激發(fā)光下發(fā)出特定的熒光，以時(shí)間分辨熒光納米顆粒為標(biāo)記載體和信號(hào)輸出單元，以特異性抗體為識(shí)別單元，使用熒光檢測(cè)儀對(duì)定量檢測(cè)卡上熒光信號(hào)進(jìn)行讀取，當(dāng)檢材中含有目標(biāo)檢測(cè)物時(shí)，熒光信號(hào)隨著含量的增加而變化，利用濃度和變化的關(guān)系建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行準(zhǔn)確定量。時(shí)間分辨熒光定量快速檢測(cè)技術(shù)具有標(biāo)記物穩(wěn)定、抗干擾強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好、操作較簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間較短的優(yōu)點(diǎn)，也可用于現(xiàn)場(chǎng)篩查靈敏度高，比膠體金靈敏度高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。

3 材料與方法

3.1 材料

鮮煙葉、煙草花葉病毒熒光定量檢測(cè)試紙條（試紙條所用耗材見表1），緩沖液、熒光定量檢測(cè)儀等（實(shí)驗(yàn)所用藥品及儀器見表2）。

表1 主要耗材

表2 主要儀器、試劑表

3.2 方法

3.2.1 煙草花葉病毒熒光定量試紙條的組裝 在PVC支持板上，按順序黏貼附著固相抗體的硝酸纖維素膜、吸收墊、玻璃纖維素膜、樣品墊（圖1），膜與墊、墊與墊間留有1～2 mm的重疊，重疊間隙不要留氣泡，用剪刀將粘貼好的試紙條剪成寬3 mm左右，常溫避光下干燥保存。

圖1 熒光定量試紙組裝圖

3.2.2 樣品采集 2021年7月從云南各地7個(gè)煙站采集鮮煙葉，共計(jì)15 000個(gè)樣本，將其編號(hào)后進(jìn)行煙草花葉病毒的檢測(cè)。各個(gè)煙站采樣情況見表3。

表3 7個(gè)煙站采樣詳情

3.2.3 實(shí)驗(yàn)操作步驟 先用天平取0.5g鮮煙草樣本至含有緩沖液的1.5 mL離心管中，使用搗棒上下?lián)v10～15次，搗碎。熒光檢測(cè)儀開機(jī)預(yù)熱幾秒，從包裝袋中取出試紙條。再用移液器取搗碎的樣本液100 L垂直滴于試紙條進(jìn)樣孔中。將滴過液的試紙條插入熒光定量檢測(cè)儀的樣品孔中，然后按測(cè)定，最后獲得樣品中花葉病菌數(shù)量，記錄數(shù)據(jù)。

煙草花葉病毒濃度閾值判定的標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)agdia的膠體金條進(jìn)行確定的，濃度閾值3 ng/mL檢出為陰性，3～10 ng/mL為弱陽，10～100 ng/mL為中強(qiáng)陽，＞100 ng/mL為強(qiáng)陽。

3.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2007軟件處理所得數(shù)據(jù)。

4 結(jié)果與分析

對(duì)云南省昆明市石林縣7個(gè)煙站檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示，石林煙站樣品檢測(cè)量為2 000個(gè)，其中花葉病陽性個(gè)數(shù)為15個(gè)，陽性率為0.75%，相對(duì)來說陽性率不高，相關(guān)部門應(yīng)提前做好預(yù)警及防控；鹿阜煙站樣品檢測(cè)量為2 000個(gè)，其中花葉病陽性個(gè)數(shù)為96個(gè)，陽性率為4.80%，相對(duì)來說陽性率處于可控制范圍內(nèi)，相關(guān)部門需做好預(yù)警及防控；長(zhǎng)湖煙站樣品檢測(cè)量為2 500個(gè)，其中花葉病陽性個(gè)數(shù)為5個(gè)，陽性率為0.20%，相對(duì)來說陽性率不高，仍需做好預(yù)警和防控；西街口煙站樣品檢測(cè)量為2 000個(gè)，其中花葉病陽性個(gè)數(shù)為33個(gè)，陽性率為1.65%，相對(duì)來說陽性率處于可控范圍，仍需做好預(yù)警和相關(guān)防控；大可煙站樣品檢測(cè)量為2 000個(gè)，其中花葉病陽性個(gè)數(shù)為55個(gè)，陽性率為2.75%，相對(duì)來說陽性率處于可控范圍，仍需做好預(yù)警和相關(guān)防控；板橋煙站樣品檢測(cè)量為2 000個(gè)，其中花葉病陽性個(gè)數(shù)為643個(gè)，陽性率為32.15%，陽性率相對(duì)其他幾個(gè)煙站是最高的，因此板橋煙站需引起重視，做好預(yù)警方案和防控措施，避免花葉病擴(kuò)散，有必要的話可更換煙草品種或?qū)嵭休喿髦贫?；圭山煙站樣品檢測(cè)量為2 500個(gè)，其中花葉病陽性個(gè)數(shù)為5個(gè)，陽性率為0.20%，相對(duì)來說陽性率不高，仍需做好預(yù)警和相關(guān)防控。

7個(gè)煙站陽性率的大小依次為：板橋煙站＞鹿阜煙站＞大可煙站＞西街口煙站＞石林煙站＞長(zhǎng)湖煙站、圭山煙站。此次采集云南省昆明市石林縣7個(gè)煙站樣品量共15 000個(gè)，其中陽性個(gè)數(shù)為852個(gè)，陽性概率為5.68%（表4、圖2）。

圖2 7個(gè)煙站花葉病檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖

表4 7個(gè)煙站煙葉病害檢測(cè)匯總表

5 討論

云南煙草常年種植面積超過35萬hm2，超過全國(guó)的1/3。近年來，煙草病毒病已經(jīng)成為煙草病蟲害中損失最大的一類病害[6]。2003年云南省煙草因病毒病造成的損失達(dá)4 800多萬元[7]。因此，煙草病毒病害的防治成為煙草植保工作的首要任務(wù)。我國(guó)在該病毒的檢測(cè)方法上主要有PCR法。本次通過熒光定量快速檢測(cè)法，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、檢測(cè)成本低的優(yōu)點(diǎn)，為煙草花葉病病害提供了快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)手段，并建立了煙草花葉病病毒數(shù)據(jù)分析和模型。

6 結(jié)論

（1）通過熒光定量快速檢測(cè)法，對(duì)云南省昆明市石林縣7個(gè)煙站的樣品進(jìn)行花葉病病害檢測(cè)，建立了云南省煙草公司昆明市公司煙葉病害花葉病數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，建立煙草花葉病病毒病的預(yù)警機(jī)制及防控措施。

（2）時(shí)間分辨熒光法快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)煙草花葉病毒閾值判定的標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)agdia的膠體金條進(jìn)行確定的，閾值定為3 ng/mL時(shí)與agdia的膠體金條陰陽性能完全符合，且檢測(cè)時(shí)間只需10 min，可用于對(duì)TMV的定量檢測(cè)，適合用于實(shí)驗(yàn)室或田間對(duì)TMV感染癥狀的研究及評(píng)估，滿足對(duì)TMV更高靈敏度檢測(cè)的需要。

（3）建立煙葉病害大數(shù)據(jù)庫(kù)，建立大數(shù)據(jù)技術(shù)的戰(zhàn)略意義在于對(duì)龐大的、含有意義的數(shù)據(jù)進(jìn)行專業(yè)化處理，是實(shí)時(shí)交互式的查詢效率和分析能力。對(duì)煙草病害來說，建立數(shù)據(jù)庫(kù)需前期對(duì)各地的煙草品種進(jìn)行大量檢測(cè)，歸納整理，以期發(fā)現(xiàn)一定規(guī)律，便于制定適合各地?zé)煵萜贩N相關(guān)病害預(yù)防、控制、管理方案。