高效液相色譜法測定小兒生血糖漿中尿囊素含量*

陳玉龍，荀 英，孫 曉，張亞鋒，董曼曼，李 敏

（1.陜西省藥品和疫苗檢查中心，陜西 西安710065；2.陜西省渭南市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 渭南714000；3.陜西省西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安710054）

貧血對兒童的健康成長有一定影響，中醫(yī)藥治療小兒貧血效果較好［1-2］。小兒生血糖漿治療小兒缺鐵性貧血及營養(yǎng)不良性貧血起效更迅速，藥品不良反應(yīng)發(fā)生率低，且口感較好，更易被兒童接受［3-7］。小兒生血糖漿由山藥、大棗、熟地黃、硫酸亞鐵等制成，目前國內(nèi)共有8個批準(zhǔn)文號，現(xiàn)行藥品標(biāo)準(zhǔn)［8］含量測定項下山藥［以尿囊素（C4H6N4O3）計［9］］的含量測定操作煩瑣、費時，專屬性及重復(fù)性差。本研究中建立了測定小兒生血糖漿中尿囊素含量的高效液相色譜（HPLC）法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），配有Chromeleon7.2工作站，二極管陣列（DAD）檢測器；Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配有DAD檢測器；MS105型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為十萬分之一）；KQ-700 VDB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為700 W，頻率為100 kHz）。

1.2 試藥

小兒生血糖漿（西安潤泰藥業(yè)有限公司，批號分別為2018901，2018902，20181203）；尿囊素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111501-200202）；甲醇（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；超純水（實驗室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Waters XBridge Amide柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～21.0 min時94%A，21.0～21.5 min時94%A→80%A，21.5～28.0 min時80%A，28.0～28.5 min時80%A→94%A，28.5～35.0 min時94%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：191 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按尿囊素峰計應(yīng)不低于4 000。

2.2 溶液制備

取尿囊素對照品36.06 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得每1 mL含3.606 mg的對照品貯備液。精密吸取對照品貯備液1 mL，置100 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得每1 mL含36.06 μg的對照品溶液。精密量取樣品5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）15 min，放至室溫，用甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按現(xiàn)行藥品標(biāo)準(zhǔn)［8］制備不含山藥的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察［10-11］

專屬性試驗：精密吸取2.2項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，結(jié)果分離度大于1.5，尿囊素峰理論板數(shù)超過4 000，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項下尿囊素對照品溶液（質(zhì)量濃度為3.606 mg/mL）適量，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為18.03，36.06，72.12，144.2，288.50 μg/mL的系列對照品溶液，以尿囊素質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程Y=0.327 7X+1.073 7，r=0.999 9（n=5）。結(jié)果表明，尿囊素質(zhì)量濃度在18.03～288.50 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取尿囊素對照品溶液（質(zhì)量濃度為36.06 μg/mL）適量，按2.1項下色譜條件進樣測定6次。結(jié)果保留時間和峰面積積分值的RSD分別為0.13%和1.72%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為2018902）適量，依法制備供試品溶液，共6份，按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果的RSD為1.20%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為2018902）適量，依法制備供試品溶液，分別于制備后0，3，8，13，18，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果峰面積的RSD為0.80%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：精密量取樣品（批號為2018902，質(zhì)量濃度為0.290 4 mg/mL）5 mL，共9份，分別置25 mL容量瓶中，按50%，100%，150%比例分別加入尿囊素對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.288 5 μg/mL），各3份，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按外標(biāo)法計算含量。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

耐用性試驗：在2.1項下色譜條件基礎(chǔ)上，通過改變色譜柱（Waters XBridge Amide柱、Welch XB-NH2柱、Agela Innoval Durashell NH2柱）、流動相（低組分流動相比例變化±5%）、柱溫［（30±5）℃］、流速［（1.0±0.2）mL/min］、檢測波長［（191±2）nm］，考察方法耐用性。結(jié)果不同色譜條件下樣品測定含量與擬訂方法測定含量的RSD均不超過3.60%，表明方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

取3批（批號分別為2018901，2018902，2018203）樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按外標(biāo)法計算含量。結(jié)果每1 mL樣品中尿囊素含量分別為0.22，0.29，0.30 mg，平均為0.27 mg。

A.對照品溶液B.供試品溶液C.陰性對照品溶液圖1高效液相色譜圖1.AllantoinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

3 討論

3.1 前處理方法改進

原標(biāo)準(zhǔn)［8］含量測定項下尿囊素測定方法先用乙醇提取、離心、上清液濃縮、冷藏、濃縮，再重復(fù)提取1次，用水定容。操作煩瑣、費時，且提取效果和方法重復(fù)性均較差?，F(xiàn)修訂方法采用甲醇超聲提取，極大地簡化了提取步驟，操作簡單、省時，方法重復(fù)性好。

3.2 色譜方法改進

原標(biāo)準(zhǔn)［8］高效液相色譜分析采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反向色譜柱，該類型色譜柱對尿囊素類極性較大物質(zhì)的保留能力很弱，導(dǎo)致尿囊素出峰時間過早，無法與制劑中的干擾物質(zhì)完全分離，專屬性較差，無法滿足分析要求；檢測波長為201 nm，并非尿囊素色譜峰的最大吸收波長，靈敏度有待提高?，F(xiàn)修訂方法采用以丙基酰胺鍵合硅膠為填充劑的正向色譜柱，對極性物質(zhì)選擇性更強，保留能力和專屬性均增強，采用乙腈-水（94∶6，V/V）為初始流動相進行目標(biāo)組分的分離，后用乙腈-水（80∶20，V/V）洗脫保留更強的雜質(zhì)峰，有效節(jié)省了分析時間；更換檢測波長為191 nm，更接近尿囊素的最大吸收波長，提高了檢測靈敏度，達到了分析要求。

3.3 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于小兒生血糖漿中尿囊素的含量測定，為其質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。