不同中藥復(fù)方及不同提取方法提取液對小鼠耐缺氧作用的影響*

李婉玉，馬慧萍，馬趣環(huán)，石曉峰△，魯艷梅，張朋朋，張家旭，董學(xué)鳳，葉倩女

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730030；2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，蘭州 730050；3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院全軍高原損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050）

人體各器官對于氧氣都有不同程度的需求，尤其以大腦和心臟耗氧量最多；當(dāng)氧氣吸收障礙或轉(zhuǎn)化不足會引起一系列慢性疾?。?］，故有缺氧乃萬病之源之說；進(jìn)駐高原低氧環(huán)境或密閉空間作業(yè)的人員，以及患有心肺等疾病者，常處于缺氧狀態(tài)，導(dǎo)致身體亞健康現(xiàn)象。為了提高人們的生活質(zhì)量，開發(fā)提高缺氧耐受力的藥物及保健食品，已成為研究關(guān)注的又一熱點(diǎn)［2］。

復(fù)方紅景天全方由可用于保健食品的紅景天、黃芪和藥食同源的黃精、枸杞子（別名：紅耳墜）4味中藥組成，方中各藥均單獨(dú)具有耐缺氧、抗疲勞活性［3-6］，其中紅景天、枸杞子、黃芪是純中藥類和中藥與營養(yǎng)素復(fù)方類提高缺氧耐受力保健食品中使用頻次較高（前10位）的中藥［2］。本課題組前期曾根據(jù)處方中各味藥材的有效成分和化學(xué)性質(zhì)，設(shè)計(jì)出紅景天和黃芪先醇提，藥渣與黃精、枸杞子2味藥材進(jìn)行水提的工藝，并用Box-Behnken響應(yīng)面法［7］和多目標(biāo)遺傳算法［8］對其醇提、水提工藝進(jìn)行優(yōu)選，但是缺乏藥效學(xué)驗(yàn)證的工藝好似無本之木，且紅景天資源匱乏，現(xiàn)已不支持大規(guī)模的開發(fā)利用［9］，而黃芪、黃精和枸杞子資源豐富，質(zhì)量優(yōu)良，作為西北高原道地藥材具有很大的開發(fā)潛力。為此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以紅景天或黃芪為主成分組成的不同中藥復(fù)方，并用不同的提取方法制得提取液，評價(jià)不同中藥組方及不同提取方法提取物對小鼠的耐缺氧作用，旨在優(yōu)選中藥組方及提取方法，為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

紅景天購自于隴南市惠康中藥材有限公司，黃芪、黃精、枸杞子藥材均購自蘭州安寧杏林藥材批發(fā)部，經(jīng)甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院石曉峰主任藥師鑒定為正品。復(fù)方丹參滴丸（規(guī)格：27 mg×180丸，批號：190709）由天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：20201010）由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（批號：20201211）、超氧化物歧酶（SOD）試劑盒（批號：20201212）、谷胱甘肽（GSH）試劑盒（批號：20200930）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號：20200818）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20200831）均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.2 動物

SPF級雄性BALB/c小鼠180只，體重20～22 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0006。動物飼養(yǎng)于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心，使用許可證號：SYCK（軍）2020-0040。飼養(yǎng)室溫度恒定在25～27℃，每12 h明暗交替，實(shí)驗(yàn)動物維持正常的飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)動物自由攝食進(jìn)水。

1.3 儀器

YC-010型多功能提取濃縮回收機(jī)組，上海雅程儀器設(shè)備有限公司；HH-4型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；DGZ-76型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CX-100快速開蓋萬能高速粉碎機(jī)，上海市晟喜制藥機(jī)械有限公司；AE200型電子分析天平；全自動樣品快速研磨儀JXFSTPRP-24，上海凈信科技；Sigma 3K15低溫離心機(jī)，德國Sigma凈信公司；SpectraMax i3全自動熒光酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)組藥物的制備

復(fù)方紅景天醇-水提取組：依處方比例分別稱取4味藥材，將紅景天和黃芪混合，加入14倍藥材量的70%乙醇，回流提取138 min，同法提取2次［7］，過濾，濾液減壓回收至無醇味；藥渣與黃精、枸杞子共同水提，按料液比1∶10（g：ml）加水提取2.94 h，同法3次［8］，過濾，濾液與無醇味的醇提物合并，濃縮，浸膏于50℃烘干，得浸膏粉373.56 g，備用。

復(fù)方黃芪醇-水提取組：按上述方法和工藝條件操作，將黃芪先醇提，藥渣與黃精、枸杞子混合共同水提，制得浸膏粉210.17 g，備用。

復(fù)方紅景天水提取組：依處方比例分別稱取4味藥材，混合，按料液比1∶10（g：ml）加水提取2.94 h，同法提取三次［8］，過濾，合并濾液，濃縮，浸膏于50℃烘干，得浸膏粉323.14 g，備用。

復(fù)方黃芪水提取組：按上述方法和工藝條件操作，將黃芪、黃精、枸杞子混合共同水提，得浸膏粉188.31 g，備用。

給藥前將各組浸膏粉按相應(yīng)劑量用滅菌注射用水配制成溶液，備用。

1.5 分組及給藥

將180只BALB/c小鼠隨機(jī)分成6組（n=30），即空白對照組、復(fù)方丹參組、復(fù)方紅景天醇-水提取組、復(fù)方紅景天水提取組、復(fù)方黃芪醇-水提取組、復(fù)方黃芪水提取組。其中，空白組灌胃滅菌注射用水，復(fù)方丹參組給藥劑量依人用劑量折算為0.15 g/kg；復(fù)方紅景天醇-水提取組和水提取組給藥劑量為3 g/kg；復(fù)方黃芪醇-水提取組和水提取組給藥劑量為1.7 g/kg（復(fù)方紅景天醇-水提取組和水提取組給藥劑量依預(yù)實(shí)驗(yàn)確定；復(fù)方黃芪醇-水提取組和水提取組根據(jù)處方的比例和復(fù)方紅景天醇-水提取組和水提取組給藥劑量折算，以保持除紅景天外的其余3味藥的等量）；各組連續(xù)灌胃給藥10 d，0.2 ml/10 g，每日一次，實(shí)驗(yàn)遵守相關(guān)倫理要求。

1.6 常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)

各組小鼠于末次灌胃1 h后［10］，將小鼠放入裝有5 g鈉石灰的250 ml磨口瓶中，每瓶放一只。瓶底預(yù)先放一張濾紙用于吸收小鼠排泄物，預(yù)先在瓶口內(nèi)部和瓶蓋外沿均勻涂抹凡士林，放入小鼠后立即塞緊瓶蓋（防止漏氣）并開始計(jì)時(shí)，觀察到小鼠呼吸停止，腹部不起伏終止計(jì)時(shí)，記錄每只小鼠的存活時(shí)間，并計(jì)算存活時(shí)間延長率，延長率%=各給藥組（死亡時(shí)間-開始時(shí)間）/空白組存活時(shí)間×100%。

1.7 亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)

各組小鼠于末次灌胃1 h后，腹腔注射濃度為24 mg/ml的亞硝酸鈉溶液，注射劑量0.1 ml/10 g，注射完成后立即開始計(jì)時(shí)，觀察到小鼠呼吸停止、無明顯活動特征終止計(jì)時(shí)，記錄每只小鼠的存活時(shí)間。

1.8 急性腦缺血缺氧實(shí)驗(yàn)

各組小鼠于末次灌胃1 h后，用鋒利的手術(shù)剪自頸部逐只將小鼠斷頭，記錄斷頭后小鼠張口喘氣的次數(shù)；并取小鼠的腦組織，按照試劑盒說明書測定各組小鼠腦組織中T-AOC、SOD、GSH、CAT、MDA含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同中藥復(fù)方及不同提取方法提取液對小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間影響的比較

與空白對照組相比，復(fù)方丹參組、復(fù)方黃芪醇-水提取組和水提取組均能顯著延長小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間（P＜0.01，P＜0.05），復(fù)方黃芪水提取組存活時(shí)間延長率（32.65%）優(yōu)于陽性對照藥復(fù)方丹參組（21.22%），與復(fù)方丹參組相比各組耐缺氧存活時(shí)間無明顯延長；與復(fù)方紅景天醇-水提取組相比，復(fù)方黃芪水提取組存活時(shí)間顯著延長（P＜0.01）；與復(fù)方紅景天水提取組相比，復(fù)方黃芪水提取組存活時(shí)間顯著延長（P＜0.01），其余各組均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與復(fù)方黃芪醇-水提取組相比，復(fù)方黃芪水提取組存活時(shí)間顯著延長（P＜0.01，表1）。

Tab.1 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the survival time of mice under normobaric hypoxia（±s，n=30）

Tab.1 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the survival time of mice under normobaric hypoxia（±s，n=30）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the blank control group；△△P＜0.01 vs Compound Rhodiola alcohol-water extract group；▲▲P＜0.01 vs Compound Rhodiola water extract group；○○P＜0.01 vs Compound Astragalus alcohol-water extract group

Group Extration method Dose（g/kg） Survival time（min） Extension rate（%）Control - 28.65±1.32 -Compound Danshen 0.15 34.73±3.34** 21.22 Compound Rhodiola alcohol-water 3 30.51±1.41 6.49 Compound Rhodiola water 3 29.88±2.96 4.29 Compound Astragalus alcohol-water 1.7 31.55±2.97* 10.13 Compound Astragalus water 1.7 38.00±2.12**△△▲▲○○ 32.65

2.2 不同中藥復(fù)方及不同提取方法提取液對小鼠亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間影響的比較

與空白對照組和陽性對照復(fù)方丹參組相比，不同中藥復(fù)方及不同提取方法提取液對小鼠亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間無明顯延長，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各組間相互比較也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2）。

Tab.2 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the survival time of mice poisoned by sodium nitrite（±s，n=30）

Tab.2 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the survival time of mice poisoned by sodium nitrite（±s，n=30）

Group Extration method Dose（g/kg）Survival time（min）Control - 17.50±1.35 Compound Danshen 0.15 17.54±1.07 Compound Rhodiola alcohol-water 3 18.15±1.85 Compound Rhodiola water 3 18.60±1.59 Compound Astragalus alcohol-water 1.7 17.76±1.73 Compound Astragalus water 1.7 19.80±3.10

2.3 不同中藥復(fù)方及不同提取方法提取液對小鼠急性腦缺血缺氧張口喘氣次數(shù)影響的比較

與空白對照組相比，復(fù)方丹參組、復(fù)方紅景天醇-水提取組、復(fù)方黃芪醇-水提取組及水提取組小鼠斷頭后張口喘氣次數(shù)均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），但與陽性對照復(fù)方丹參組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與復(fù)方紅景天醇-水提取組相比，復(fù)方紅景天水提取組、復(fù)方黃芪醇-水提取組和水提取組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與復(fù)方紅景天水提取組相比，復(fù)方黃芪醇-水提取組結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，復(fù)方黃芪水提取組顯著增加（P＜0.05）；與復(fù)方黃芪醇-水提取組相比，各組小鼠張口喘氣次數(shù)均無明顯增加（表3）。

Tab.3 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the number of openmouth gasping in acute cerebral ischemic and hypoxic mice（±s，n=30）

Tab.3 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the number of openmouth gasping in acute cerebral ischemic and hypoxic mice（±s，n=30）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the blank control group；▲P＜0.05 vs Compound Rhodiola water extract group

Group Extration method Dose（g/kg）Number of openmouth gasps Control - 9.29±0.95 Compound Danshen 0.15 12.57±1.13*Compound Rhodiola alcohol-water 3 12.43±0.79*Compound Rhodiola water 3 10.57±0.79 Compound Astragalus alcohol-water 1.7 12.86±1.77*Compound Astragalus water 1.7 13.57±0.54**▲

2.4 不同中藥復(fù)方及不同提取方法提取液對小鼠腦組織T-AOC、SOD、GSH、CAT、MDA影響的比較

與空白對照組相比，復(fù)方丹參組和復(fù)方黃芪水提取組T-AOC活性均顯著增強(qiáng)（P＜0.01，P＜0.05）；復(fù)方紅景天醇-水提取組和復(fù)方黃芪水提取組SOD活性均顯著增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01）；復(fù)方丹參、復(fù)方紅景天醇-水提取組及水提取組、復(fù)方黃芪水提取組GSH活性均顯著增強(qiáng)（P＜0.01）；復(fù)方黃芪水提取組CAT活性顯著增強(qiáng)（P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.01）。與陽性對照復(fù)方丹參組相比，各組T-AOC活性無明顯增強(qiáng)，復(fù)方黃芪水提取組SOD、GSH、CAT活性均顯著增強(qiáng)（P＜0.01，P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。與復(fù)方紅景天醇-水提取組相比，復(fù)方紅景天水提取組、復(fù)方黃芪醇-水提取組和水提取組T-AOC活性均無明顯增強(qiáng)；復(fù)方黃芪水提取組SOD活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；各組GSH、CAT活性均無顯著增強(qiáng)，MDA含量無明顯降低。與復(fù)方紅景天水提取組相比，復(fù)方黃芪水提取組SOD活性均顯著增強(qiáng)（P＜0.05），各組T-AOC、GSH、CAT活性均無明顯增強(qiáng)，MDA含量無顯著降低。與復(fù)方黃芪醇-水提取組相比，各組T-AOC活性均無明顯增強(qiáng)，復(fù)方黃芪水提取組SOD、GSH活性均顯著增強(qiáng)（P＜0.01，P＜0.05），CAT活性無明顯增強(qiáng)，MDA含量顯著降低（P＜0.05，表4）。

3 討論

復(fù)方紅景天全方由紅景天、黃芪、黃精、枸杞子4味中藥組成，是在民間驗(yàn)方的基礎(chǔ)上經(jīng)我省知名中醫(yī)學(xué)者加減論證得來。其中藥典收錄的大花紅景天Rhodiola crenulata（HK.f.et.Thoms）H.Ohba為景天科紅景天屬多年生草本植物，具有益氣活血、通脈平喘的功效［11］?，F(xiàn)代藥理研究表明，其具有改善睡眠、生血活血、抗腦缺氧、抗疲勞、活血止血、清肺止咳、化淤消腫、解熱退燒、滋補(bǔ)元?dú)獾榷喾矫嫠幚砉δ埽?，12］，復(fù)方中黃芪為補(bǔ)氣要藥，配伍黃精、枸杞子補(bǔ)氣養(yǎng)陰，滋陰潤肺。中醫(yī)認(rèn)為缺氧屬肺腎氣虛、痰濁瘀阻，而復(fù)方紅景天有益氣滋陰的功效，因此可針對其開發(fā)耐缺氧保健品［2］。紅景天歷來為抗缺氧常用中藥，是多種藏成藥、中成藥、食品、飲料和化妝品的重要原料，需求量大，但藥材來源以野生資源為主，由于其生境獨(dú)特、習(xí)性特殊、分布狹窄，常遭遇地毯式地采光挖凈，面臨種源斷絕的危機(jī)，已被列為國家Ⅱ級重點(diǎn)保護(hù)野生植物［12，13］。目前常用的耐缺氧類西藥如乙酰唑胺等雖然療效較好，但仍有較多副作用［14］。而耐缺氧、抗疲勞中藥及復(fù)方作用效果好兼具補(bǔ)益功效且副作用較少［15］，值得深入研究。植物多糖具有較好的抗氧化、耐缺氧作用［16-18］。復(fù)方中黃芪、黃精、枸杞子等多糖含量較高，且紅景天苷、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷等有效成分極性較大，適合用大極性溶劑提取。而水作為常用溶劑安全性較高，因此在前期醇-水提工藝的基礎(chǔ)上考慮直接水提的方法。為此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)和急性腦缺血缺氧實(shí)驗(yàn)，在動物水平評價(jià)復(fù)方紅景天及復(fù)方黃芪先醇提后水提和全方水提方法對藥效的影響，以確定其處方是否可以剔除瀕危藥材紅景天，為紅景天的資源保護(hù)提供新的思路。

Tab.4 Effects of different herbal compound and extracts from different extraction methods on T-AOC，SOD，GSH，CAT and MDA in mouse brain tissues（±s，n=30）

Tab.4 Effects of different herbal compound and extracts from different extraction methods on T-AOC，SOD，GSH，CAT and MDA in mouse brain tissues（±s，n=30）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the blank control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs the compound Danshen Group；△P＜0.05 vs Compound Rhodiola alcohol-water extract group；▲P＜0.05 vs Compound Rhodiola water extract group；○P＜0.05，○○P＜0.01 vs Compound Astragalus alcohol-water extract group

Group T-AOC（U/mg prot）SOD（U/mg prot）GSH（mg GSH/g prot）CAT（U/mg prot）MDA（nmol/mg prot）Control 0.74±0.22 1.03±0.20 0.62±0.30 2.50±0.95 4.90±1.48 Compound Danshen 2.61±0.35** 1.20±0.24 1.45±0.18** 2.60±0.51 4.58±0.88 Compound Rhodiola 1.04±0.38 1.42±0.52* 1.53±0.36** 3.10±0.69 4.39±0.58 Compound Rhodiola 1.01±0.34 1.31±0.30 1.61±0.40** 3.20±1.14 4.34±1.42 Compound Astragalus 1.01±0.25 1.15±0.14 0.80±0.31 2.95±0.46 4.66±1.20 Compound Astragalus 1.05±0.23* 1.64±0.50**##△▲○○1.80±0.56**#○ 4.17±1.68**## 3.28±0.88**#○

為了保證藥效結(jié)果的可靠性，參考文獻(xiàn)方法［19，20］，本試驗(yàn)選用復(fù)方丹參滴丸作為陽性對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方黃芪水提物可顯著延長小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間，且效果優(yōu)于陽性對照藥復(fù)方丹參滴丸；亞硝酸鈉注射作為一種化學(xué)缺氧的方法，也可評價(jià)不同藥物的耐缺氧作用。亞硝酸鈉入血后，將正常的二價(jià)鐵氧化成三價(jià)鐵使紅細(xì)胞失去載氧能力，最終使動物因缺氧死亡。本實(shí)驗(yàn)對小鼠腹腔注射亞硝酸鈉后，各給藥組小鼠存活時(shí)間沒有明顯延長，且死亡較快，分析原因可能是各藥物組沒有明顯保護(hù)亞硝酸鈉中毒的作用，也可能是亞硝酸鈉濃度過高，毒性太強(qiáng)對小鼠造成的傷害無法恢復(fù)［20］。陽性對照藥復(fù)方丹參滴丸、復(fù)方紅景天醇-水提取物、復(fù)方黃芪醇-水提取物及水提物對小鼠斷頭后張口喘氣次數(shù)較空白對照組均有顯著增加，但與陽性對照藥復(fù)方丹參滴丸比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

缺氧誘發(fā)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的自由基攻擊機(jī)體細(xì)胞或組織，嚴(yán)重時(shí)引起機(jī)體器官損傷，產(chǎn)生病變［21］。大腦易受到缺氧的影響，本實(shí)驗(yàn)測定小鼠腦組織中的T-AOC、SOD、GSH、CAT活性、MDA含量，能夠比較客觀的反映各藥物組在缺氧時(shí)對機(jī)體的保護(hù)作用。T-AOC、SOD、GSH和CAT作為重要的抗氧化物酶，其含量高低反映機(jī)體清除自由基和分解過氧化物的能力。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量高低能夠間接反映細(xì)胞的受損程度［22］。與陽性對照藥復(fù)方丹參滴丸組相比，復(fù)方黃芪水提物組小鼠腦組織除T-AOC活性有所下降外，SOD、GSH和CAT活性都顯著增加，MDA含量顯著下降，表明復(fù)方黃芪水提物組對缺氧引起的氧化應(yīng)激有一定程度的保護(hù)作用。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各給藥組對缺氧引起的氧化應(yīng)激均有不同程度的干預(yù)作用，可能是各藥物組具有耐缺氧作用的機(jī)制之一。以上結(jié)果提示復(fù)方黃芪水提物的耐缺氧效果最好，原復(fù)方紅景天全方可以剔除紅景天由黃芪、黃精、枸杞子組成，其制備提取方法為水提。