葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)體外潰瘍性結(jié)腸炎的細(xì)胞損傷及細(xì)胞焦亡機(jī)制

王康，鄧牧文，唐立，張軍，陸巖，歐陽滿照

（南方醫(yī)科大學(xué) 順德醫(yī)院 胃腸外科，廣東 佛山 順德 528308）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是指由多種原因?qū)е碌穆苑翘禺愋阅c道炎癥性疾病，以局限于黏膜層的炎癥反復(fù)發(fā)作為特征［1］。消化道穩(wěn)態(tài)的紊亂會(huì)導(dǎo)致腸黏膜持續(xù)炎癥，從而引起腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IEC）的屏障功能障礙，這可能是UC發(fā)病的一個(gè)重要原因［2］。在UC組織中，可以明顯觀察到上皮屏障細(xì)胞的破壞［3］，腸上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)性損傷會(huì)引發(fā)炎癥性反應(yīng)［4］。然而，腸上皮屏障的破壞與UC發(fā)生發(fā)展間的具體分子機(jī)制尚未明確。

細(xì)胞焦亡是炎性反應(yīng)相關(guān)性的細(xì)胞死亡方式［5］，焦亡的激活與細(xì)胞損傷密切相關(guān)，且通常伴隨大量促炎性因子的釋放［6］。細(xì)胞受到損傷及刺激時(shí)，炎癥小體識(shí)別蛋白識(shí)別危險(xiǎn)因素相關(guān)模式分子（damage-associated molecular patterns，DAMPs）等信號(hào)，形成炎癥小體復(fù)合物，在由炎癥小體復(fù)合物活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）剪切作用下，GSDMD-Full（Gasdermin D Full）形成切割活化的GSDMD-N（Gasdermin D Nterminal），活化的GSDMD-N發(fā)揮膜成孔效應(yīng)（圖1），會(huì)促進(jìn)成熟的白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）釋放，導(dǎo)致細(xì)胞裂解［7-8］。細(xì)胞焦亡激活后炎性反應(yīng)的發(fā)生，表明其與潰瘍性結(jié)腸炎中有著重要關(guān)聯(lián)［9］。研究發(fā)現(xiàn)在葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的小鼠UC模型中，焦亡相關(guān)蛋白GSDMD-N表達(dá)顯著增加［10］。然而，體外細(xì)胞的相關(guān)研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究擬通過體外培養(yǎng)Caco-2、NCM460細(xì)胞，使用DSS破壞體外屏障，檢測細(xì)胞形態(tài)及焦亡相關(guān)蛋白，探討在DSS誘導(dǎo)下結(jié)腸炎與細(xì)胞焦亡的聯(lián)系。

圖1 腸上皮屏障破壞過程中相關(guān)分子機(jī)制Figure 1 Related molecular mechanisms in the destruction of the intestinal epithelial barrier

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人腸癌細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞、人正常腸上皮細(xì)胞株NCM460細(xì)胞（細(xì)胞均由中科院細(xì)胞庫提供，并于本課題組細(xì)胞液氮罐中保存）。主要的試劑、耗材和儀器包括：RPMI-1640培養(yǎng)基（Thermo Fisher），葡聚糖硫酸鈉（DSS，MP Biomedicals，216011080），CCK-8試劑盒（C0038，碧云天），AnnexinV-FITC／PI流式試劑盒（C1062S，碧云天），β-actin、GSDMD-Full、GSDME-Full、GSDME-N、GSDMD-N抗體（Proteintech），鼠二抗（Thermo Fisher）；6孔板（Corning，康寧，3516）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher），倒置顯微鏡（Leica），流式細(xì)胞儀（FACSCanto），酶標(biāo)儀（Victor Nivo 3F），蛋白印跡系統(tǒng)（Bio-RAD）。以下實(shí)驗(yàn)均在南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建體外模型

①設(shè)置分組及給藥方案：將Caco-2細(xì)胞、NCM460細(xì)胞均分成8組，分別以不同質(zhì)量濃度DSS（0、10、20、30、40、50、60、70 mg／mL）干預(yù)。Caco-2細(xì)胞、NCM460細(xì)胞在含有上述質(zhì)量濃度梯度DSS、10%胎牛血清以及1%雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中于37℃二氧化碳孵箱里孵育48 h，處理完畢則收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞，檢測相關(guān)指標(biāo)。②細(xì)胞鋪板：取Caco-2細(xì)胞、NCM460細(xì)胞懸液100μL加入96孔板（每孔約5×103細(xì)胞）。③CCK-8細(xì)胞活力檢測：96孔板中，每孔加入10μL CCK-8溶液；在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h；用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力，并繪制DSS藥物質(zhì)量濃度曲線；分別取DSS對Caco-2細(xì)胞和NCM460細(xì)胞48 h的IC50質(zhì)量濃度作用于細(xì)胞，構(gòu)建體外潰瘍性結(jié)腸炎細(xì)胞屏障模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng)

①實(shí)驗(yàn)分組：對照組（NC，不加DSS）、24 h組（DSS處理24 h）和48 h組（DSS處理48 h）。②細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞接種于6孔板，用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞接種量為（5～8）×105cells／孔，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。③DSS處理：將Caco-2細(xì)胞、NCM460細(xì)胞分別于含10%胎牛血清、1%雙抗以及IC50質(zhì)量濃度DSS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3組分別于37℃二氧化碳孵箱里培養(yǎng)0、24、48 h，處理完畢則收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞，檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 分析細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性

細(xì)胞培養(yǎng)板置于熒光倒置顯微鏡的載物臺(tái)上，分別觀測Caco-2細(xì)胞和NCM460細(xì)胞的對照組、24 h組、48 h組的細(xì)胞形態(tài)變化，拍照記錄，顯微鏡下（×100、×400）觀察細(xì)胞的胞膜完整性。

1.2.4 檢測細(xì)胞凋亡情況

取經(jīng)1.2.2中處理的細(xì)胞懸液100μL于5 mL流式管中，加入5μL FITC Annexin V和1～2μL PI，輕輕混勻。室溫、避光、反應(yīng)15 min后加入400μL 1×Annexin-binding buffer，輕柔混勻，冰上放置。1 h內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測，分析細(xì)胞的凋亡比例。

1.2.5 檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

取1.2.2中培養(yǎng)的細(xì)胞，分別收集培養(yǎng)基上清和貼壁細(xì)胞。將培養(yǎng)基上清在離心機(jī)中以14 000 g離心2 min，取其沉淀，收集蛋白；貼壁細(xì)胞加入裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白。采用UV法測定蛋白質(zhì)量濃度，取10μg上樣，經(jīng)SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h。Caco-2細(xì)胞的蛋白條帶PVDF膜用GSDME-Full（Gasdermin EFull）一抗稀釋液（VGSDMD-Full一抗∶V抗體稀釋液＝1∶1 000）、GSDME-N（Gasdermin E Nterminal）一抗稀釋液（VGSDMD-N一抗∶V抗體稀釋液＝1∶1 000）、β-actin一抗稀釋液（Vβ-actin一抗∶V抗體稀釋液＝1∶1 000）4℃孵育過夜；NCM460細(xì)胞的蛋白條帶PVDF膜用GSDME-Full一抗稀釋液（VGSDME-Full一抗∶V抗體稀釋液＝1∶1 000）、GSDME-N一抗稀釋液（VGSDME-N一抗∶V抗體稀釋液＝1∶1 000）、β-actin一抗稀釋液（Vβ-actin一抗∶V抗體稀釋液＝1∶1 000）4℃孵育過夜。用PBST洗膜3次，10 min／次，加入對應(yīng)熒光二抗稀釋液（V二抗∶V抗體稀釋液＝1∶2 000），室溫孵育3 h。洗膜3次，10 min／次，將PVDF膜置于ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)的白光平板中心位置，進(jìn)行發(fā)光孵育監(jiān)測，膠片掃描存檔，Image Pro Plus軟件對特異條帶灰度值進(jìn)行數(shù)字化分析。

1.2.6 獲取焦亡蛋白R(shí)NA表達(dá)情況

人類蛋白圖譜在線數(shù)據(jù)庫（human protein atls，HPA）（https：／／www.proteinatlas.org／）通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，整合了人類不同組織和器官中的蛋白質(zhì)和RNA表達(dá)情況。本研究以“GSDMD”為檢索詞，在HPA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，選擇出GSDMD在人類腸組織中單細(xì)胞集群的RNA表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本次研究采用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行圖片繪制和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖片處理使用ImageJ軟件。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次及以上。

2 結(jié)果

2.1 DSS對人腸上皮細(xì)胞活性的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性顯示：經(jīng)過質(zhì)量濃度梯度DSS分別處理Caco-2細(xì)胞、NCM460細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)處理時(shí)間為48 h時(shí)，Caco-2細(xì)胞和NCM460細(xì)胞的活力隨著DSS濃度的升高而降低（圖2），Caco-2細(xì)胞、NCM460細(xì)胞的IC50質(zhì)量濃度分別為10 mg／mL、40 mg／mL。

圖2 在DSS誘導(dǎo)體外UC模型實(shí)驗(yàn)中人腸上皮細(xì)胞活性的變化Figure 2 Changes of the activity of human intestinal epithelial cells in DSS-induced UC cell model experiments in vitro

2.2 DSS對UC細(xì)胞模型細(xì)胞膜完整性的影響

在體外UC細(xì)胞模型中，本研究評估了DSS處理對Caco-2細(xì)胞以及NCM460細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生的應(yīng)激作用。熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示：與對照組（圖3A、D；圖4A、D）相比，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞均在一定程度上出現(xiàn)細(xì)胞腫脹，在放大400倍時(shí)特征性腫脹氣泡主要表現(xiàn)在細(xì)胞的細(xì)胞膜上（圖4B、C、E、F），在放大100倍時(shí)，可觀察到48 h組變化更劇烈（圖3C、F）。結(jié)果顯示，DSS可破壞Caco-2細(xì)胞、NCM460細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性。

圖3 在DSS誘導(dǎo)UC體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞形態(tài)的變化（×100）Figure 3 Changes of cell morphology in DSSinduced UC cell model in vitro（×100）

圖4 在DSS誘導(dǎo)UC體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞形態(tài)的變化（×400）Figure 4 Changes of cell morphology in DSSinduced UC cell model in vitro（×400）

對DSS處理的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)，來進(jìn)一步研究細(xì)胞膜完整性的破壞所造成的影響。在Caco-2細(xì)胞中，DSS處理48 h后，Caco-2細(xì)胞的凋亡比例顯著增加（25.7% vs 6.8%，P＜0.01）（圖5A）。在NCM460細(xì)胞中，DSS處理48 h后，NCM460細(xì)胞的凋亡比例顯著增加（33.3% vs 17.2%，P＜0.01）（圖5B）。

圖5 在DSS誘導(dǎo)UC體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞凋亡情況的變化Figure 5 Changes of the apoptosis in DSS-induced UC cell model in vitro

2.3 DSS對UC細(xì)胞焦亡蛋白表達(dá)的影響

通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測DSS誘導(dǎo)的體外潰瘍性結(jié)腸炎細(xì)胞屏障模型中焦亡相關(guān)蛋白GSDMD、GSDME的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Caco-2細(xì)胞中，與對照組相比，DSS處理的24 h組及48 h組的GSDMD-Full蛋白表達(dá)均減少（0.173±0.001 vs 0.864±0.008，P＜0.05；0.081±0.001 vs0.864±0.008，P＜0.05），活化GSDMD-N蛋白表達(dá)均增加（0.771±0.008 vs 0.269±0.003，P＜0.05；0.889±0.008 vs 0.268±0.003，P＜0.05）（圖6A）。在NCM460細(xì)胞中，相較于對照組，DSS處理的24 h組及48 h組的GSDME-Full蛋白表達(dá)均減少（0.706±0.006 vs1.345±0.097，P＜0.05；0.594±0.030 vs 1.345±0.097，P＜0.05），活化的GSDME-N 蛋白表達(dá)均增加（0.987±0.029 vs 0.472±0.058，P＜0.05；2.205±0.090 vs0.472±0.058，P＜0.05）（圖6B）。

圖6 在DSS誘導(dǎo)UC體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化Figure 6 Changes of the expression of pyroptosis-related proteins in DSS-induced UC cell model in vitro

2.4 焦亡蛋白在腸組織上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況

通過檢索HPA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，焦亡蛋白GSDMD集中表達(dá)于腸組織中腺體上皮細(xì)胞集群（enterocyte c-6、c-5、c-7、c-4、c-9、c-0）及未分化細(xì)胞集群（undifferentiated cell c-8），而在腸組織中血液及免疫細(xì)胞集群（blood＆immune cells c-3、c-12）中表達(dá)較少（圖7）。

圖7 各細(xì)胞類型中GSDMD RNA的表達(dá)情況Figure 7 The expression of GSDMD RNA in various types of cells

3 討論

完整的腸上皮細(xì)胞為構(gòu)成機(jī)體內(nèi)外環(huán)境之間的一道機(jī)械保護(hù)屏障，在阻止病原微生物入侵黏膜的過程中發(fā)揮著重要的作用，多項(xiàng)研究證實(shí)腸上皮屏障功能受損與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11］。并且最新研究表明，細(xì)胞焦亡在腸上皮屏障功能受損中具有重要作用［12］。因此，本研究利用DSS誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞Caco-2及腸上皮細(xì)胞NCM460來探究細(xì)胞焦亡與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系。在UC中，受到損害的腸上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生細(xì)胞焦亡，其炎癥主要集中在黏膜及黏膜下層［13-14］。研究表明，機(jī)體自身的免疫異常在UC的發(fā)病中起主要作用［15］，自身免疫異常會(huì)使腸道黏膜出現(xiàn)損害，但本研究用DSS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞和NCM460細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡也參與腸道屏障的破壞，這與之前的研究報(bào)道小鼠UC模型中焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)較正常對照小鼠增加一致，焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的增加與細(xì)胞損傷比例成正相關(guān)［16］，為細(xì)胞焦亡在腸上皮屏障的損壞機(jī)制提供了細(xì)胞層面的證據(jù)。在小鼠UC模型中，由細(xì)胞焦亡所致的屏障破壞可被焦亡相關(guān)抑制劑雙硫侖緩解［17］，此外在黏蛋白2（Mucin 2，Muc2）基因敲除所致的自發(fā)性小鼠UC模型中，NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）抑制劑MCC950可減少膜成孔效應(yīng)所導(dǎo)致的炎癥因子的釋放［18］。鑒于細(xì)胞焦亡在細(xì)胞損傷反應(yīng)機(jī)制中扮演著重要角色，因此，探究UC中細(xì)胞損傷與細(xì)胞焦亡的關(guān)系可為尋找新的UC診治方法提供新的視角。

雖然已有研究報(bào)道小鼠模型中細(xì)胞焦亡與UC的聯(lián)系［19］，但關(guān)于DSS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞和NCM460細(xì)胞與細(xì)胞焦亡的聯(lián)系少有報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)在DSS誘導(dǎo)后，Caco-2細(xì)胞和NCM460細(xì)胞均發(fā)生了焦亡。在以往體外模型中，DSS的刺激可使腸上皮細(xì)胞間的緊密連接遭到破壞［20］，因此本模型更趨向于物理急性損傷。除此之外，在DSS誘導(dǎo)的體外模型中，相關(guān)免疫細(xì)胞的免疫反應(yīng)不會(huì)被激活［21］，所以本研究為探究DSS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞和NCM460細(xì)胞損傷與UC的聯(lián)系提供了基礎(chǔ)。國內(nèi)外許多研究證實(shí)，Caco-2細(xì)胞由于其良好的單層細(xì)胞吸收能力而被廣泛用于屏障模型的構(gòu)建［22］，因此本研究選擇Caco-2細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究在Caco-2細(xì)胞系中觀察到細(xì)胞腫脹以及焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)與細(xì)胞損傷比例呈正相關(guān)，在一定程度上證明了此研究的有效性。同時(shí)，最新研究表明，經(jīng)DSS處理的Caco-2細(xì)胞除了細(xì)胞的胞膜通道及受體蛋白改變外，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力和跨膜電阻也顯著改變，從而導(dǎo)致Caco-2細(xì)胞的胞膜通透性增加［23］，這一特性很好的契合了UC相關(guān)的表型。

近年來，越來越多的研究試圖從細(xì)胞死亡機(jī)制中尋求UC新的治療靶點(diǎn)［24-26］。本研究通過DSS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞和NCM460細(xì)胞，探尋了體外屏障細(xì)胞的破壞與細(xì)胞焦亡的關(guān)聯(lián)，結(jié)合HPA數(shù)據(jù)庫的焦亡蛋白R(shí)NA在腸組織上皮細(xì)胞中的表達(dá)特異性，為進(jìn)一步研究UC復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制及探尋潛在的治療策略提供了一定理論基礎(chǔ)。最新研究也發(fā)現(xiàn)，抑制經(jīng)典細(xì)胞焦亡信號(hào)通路可以減輕巨噬細(xì)胞焦亡［27-28］，表明細(xì)胞焦亡在細(xì)胞損傷中的關(guān)鍵作用，為UC的診治提供了新的思路［29-31］。與之前已發(fā)表的UC細(xì)胞機(jī)制研究相比，本研究在細(xì)胞形態(tài)變化的基礎(chǔ)上分析了細(xì)胞損傷焦亡相關(guān)蛋白的變化，探究了細(xì)胞焦亡與UC的聯(lián)系。本研究也存在一定局限性，目前研究發(fā)現(xiàn)越來越多的分子參與細(xì)胞焦亡通路，因此還需要結(jié)合更多標(biāo)志性分子來進(jìn)一步探索細(xì)胞焦亡與UC的關(guān)系。

綜上所述，本研究通過DSS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞和NCM460細(xì)胞驗(yàn)證了體外UC模型中細(xì)胞焦亡的發(fā)生，并發(fā)現(xiàn)焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)與細(xì)胞損傷比例呈正相關(guān)。因此，本研究從細(xì)胞焦亡角度出發(fā)，為探尋UC新的診治方法提供了一定理論基礎(chǔ)。細(xì)胞屏障破壞在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展中有一定促進(jìn)作用，但細(xì)胞屏障破壞的具體分子機(jī)制仍未知，值得進(jìn)一步深入研究。

作者貢獻(xiàn)聲明

王康：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；鄧牧文：參與實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；唐立：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，文獻(xiàn)收集；張軍：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，參與論文寫作；陸巖：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，修改論文；歐陽滿照：提出研究思路和框架，修改論文。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。