參苓白術(shù)散早期干預(yù)對噁唑酮誘導(dǎo)過敏性結(jié)腸炎幼鼠的影響

葉麗妍，曾麗盈，陳佩文，葉綺娜，賴東蘭，陳曉剛*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心 兒科，廣東 廣州 510623；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 兒科，廣東 廣州 510405）

食物過敏（food allergy，F(xiàn)A）是一種對特定食物抗原的不良反應(yīng)，由免疫機(jī)制介導(dǎo)、發(fā)生在對特定過敏源敏感的個體身上，會導(dǎo)致組織和器官功能紊亂甚至損傷而引起一系列臨床表現(xiàn)。FA常常發(fā)生在嬰幼兒時期，其中胃腸道癥狀出現(xiàn)較早。流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國珠海、浙江、重慶3城市2歲以下兒童食物過敏檢出率約為5.6%～7.3%［1］，澳大利亞的1歲嬰兒群體中，超過10%的嬰兒存在常見食物過敏［2］，不同的食物引起的發(fā)病率亦不同［2-3］。過敏性結(jié)腸炎（allergic colitis，AC）為食物過敏所導(dǎo)致的一種消化道疾病，常見臨床表現(xiàn)為腹瀉和便血，以遷延性、慢性腹瀉多見，病程長短不一，嚴(yán)重者可出現(xiàn)低蛋白血癥、臟器功能紊亂，會影響患兒的生長發(fā)育，遠(yuǎn)期可能還與支氣管哮喘、過敏性鼻炎等多種過敏性疾病相關(guān)。AC目前尚無特效治療手段，主要以回避過敏食物、口服胃腸黏膜保護(hù)劑、微生物制劑等對癥治療，但仍有部分患兒療效欠佳，反復(fù)發(fā)作。因此，尋找、探索早期干預(yù)以減輕過敏性結(jié)腸炎的防治方法是目前臨床研究的重要方向。有臨床研究提示，參苓白術(shù)散可有效防治過敏性結(jié)腸炎、過敏性鼻炎、支氣管哮喘等，動物實(shí)驗(yàn)也表明其能減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的腸道炎癥反應(yīng)［4-9］。本研究用噁唑酮誘導(dǎo)法建立幼年小鼠的AC模型，試圖探索參苓白術(shù)散早期干預(yù)影響嬰幼兒AC的藥理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

150只7 d齡健康雌性BALB／c幼鼠，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（實(shí)驗(yàn)動物使用許可證：SYXK［粵］2018-0001，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SYXK［粵］2018-0034），體質(zhì)量為4～8 g／只，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，恒溫（22±1）℃，相對濕度50%～70%，幼鼠3周齡前由母鼠哺乳喂養(yǎng)，3周齡后自行攝食、飲水，晝夜循環(huán)光照。本研究倫理問題經(jīng)廣東中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心審批（批號：TCMF1-2019005）。

參苓白術(shù)散的組成：按《太平惠民和劑局方》所載，蓮子肉（去皮）、薏苡仁、縮砂仁、桔梗、白扁豆（炒）、白茯苓、人參、炙甘草、白術(shù)（麩炒）、山藥共10味藥按2∶2∶2∶2∶3∶4∶4∶4∶4∶4的比例配伍，以上10味中藥由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，用單蒸水洗滌后，入三角瓶中加4倍體積的雙蒸水浸泡2 h（人參另泡另煎），煎2次，每次煎30 min，去渣，兩煎液混合，G4濾器過濾，于60℃水浴中濃縮成每毫升藥液含原藥材2.56 g（即生藥質(zhì)量濃度2.56 g／mL），密封4℃保存?zhèn)溆?。酪酸梭菌（CGMCC313-1）由山東科興生物制品有限公司惠贈。

1.1.2 試劑與儀器

小鼠白介素4（interleukin 4，IL-4）、白介素10（interleukin 10，IL-10）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）ELISA試劑盒購自Elabscience公司，小鼠白介素13（interleukin 13，IL-13）ELISA試劑盒購自Boster公司，早幼粒白血病鋅指蛋白（promyelocytic leukemia zinc finger protein，PLZF）一抗購自Abcam公司、GAPDH一抗購自BIOSS公司，Goat anti-rabbit IgG（H+L）HRP二抗、Goat anti-mouse IgG（H+L）HRP購自Bioworld公司，PVDF膜購自Millipore公司，1.5 mol／LTris-HCl pH 8.8、1.0 mol／L Tris-HCl pH 6.8、TBST緩沖液購自廣州藍(lán)吉生物公司，甘氨酸、Tris、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、脫脂奶粉、SDS購自BIOFROXX公司，過硫酸銨、TEMED購自北京普利萊公司，顯影粉、定影粉購自天津世紀(jì)奧博公司，還原型SDS-PAGE 5×Loading Buffer購自CWBIO公司，PageRuler Prestained Protein Ladder（26616）購自Thermo scientific公司，超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物購自BOSTER公司，無水乙醇、無水甲醇、水合氯醛購自天津大茂公司，PBS液購自Thermo Fisher Scientific公司，噁唑酮購自Sigms-Aldrich公司，PE導(dǎo)管（P50）購自Smith Medical公司，無酶EP管購自AXYGEN公司，24G貝朗安全型新生兒留置針頭、1 mL及2.5 mL無菌注射器等均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科提供。

全自動樣品快速研磨儀（JXFSTPRP-24）購自上海凈信公司，脫色搖床（TS-1）購自海門其林貝爾公司，冷凍高速離心機(jī)（TGL-18R）購自珠海黑馬公司，旋渦振蕩器（QL-901）購自海門麒麟公司，電熱恒溫水槽（DK-8D）購自上海一恒公司，PH計(jì)（ST3100）購自奧豪斯儀器公司，X射線攝影暗匣（AX-Ⅱ）購自廣東粵華公司，自動酶標(biāo)儀（RT-6000）購自深圳雷杜公司，數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（LG2000）購自杭州朗基公司，電泳、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（Mini）購自Bio-rad公司，酶標(biāo)分析儀、低溫高速離心機(jī)購自Thermo Scientific公司，電熱恒溫?fù)u床（KS 3000i control）購自IKA公司，-80℃超低溫冰箱購自中科美菱公司，十萬分電子分析天平（MS半微量型號）購自賽多利斯公司，快速混勻器購自國華公司，動物剃毛器購自科德士公司等。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥方法

150只幼鼠分兩批進(jìn)入實(shí)驗(yàn)（第1批60只，第2批90只），各自隨機(jī)分為空白組、參苓白術(shù)散高劑量組、參苓白術(shù)散中劑量組、參苓白術(shù)散低劑量組、益生菌組和模型組，第一批每組各10只，第二批每組各15只。

連續(xù)灌胃17 d，1次／d（實(shí)驗(yàn)第0～16天），參苓白術(shù)散高劑量組小鼠每kg體質(zhì)量每次給予含生藥量25.6 g的參苓白術(shù)散煎液，中劑量組予12.8 g／次，低劑量組予6.4 g／次，所有參苓白術(shù)散煎液均稀釋為25 mL／kg后，使用新生兒留置針經(jīng)口灌胃給參苓白術(shù)散各劑量組小鼠；益生菌組給予酪酸梭菌（109cfu），將酪酸梭菌稀釋為25 mL／kg的混懸液后灌胃給小鼠，模型組及空白組均按25 mL／kg灌胃PBS液。

至實(shí)驗(yàn)第17天，幼鼠腹部皮膚剃毛2 cm×2 cm，模型組、參苓白術(shù)散各劑量組及益生菌組均予0.2 mL 3%噁唑酮100%乙醇溶液皮膚滴注致敏，空白組則給予等體積的PBS液皮膚致敏，自然風(fēng)干，24 h后（實(shí)驗(yàn)第18天）重復(fù)一次。5 d后（實(shí)驗(yàn)第23天）行結(jié)腸灌注，先予麻醉劑（每100 g幼鼠體質(zhì)量注射0.3 mL）腹腔注射麻醉，用自制灌腸器（2.5 mL注射器連接內(nèi)徑0.58 mm的PE導(dǎo)管）插入幼鼠肛門約3～4 cm，模型組、參苓白術(shù)散各劑量組及益生菌組均予0.15 mL 1%噁唑酮50%乙醇液灌腸，空白組則給予等體積的PBS液灌腸。抽取液體，沿導(dǎo)管緩緩注入，倒置幼鼠60 s，令致敏液與結(jié)腸充分接觸。灌腸第2天后連續(xù)3 d（實(shí)驗(yàn)第24～26天），每日記錄幼鼠體質(zhì)量、大便性狀及便隱血情況，進(jìn)行DAI評分，若幼鼠進(jìn)食減少、體質(zhì)量減輕、毛色無光澤、懶動、活動量減少、出現(xiàn)稀便或便血試驗(yàn)陽性，認(rèn)為造模成功表現(xiàn)。

結(jié)腸灌注3 d后（實(shí)驗(yàn)第26天）取材，麻醉后處死幼鼠，沿腹中線剪開皮膚，打開腹腔暴露結(jié)腸，取病變明顯處結(jié)腸組織，小心刮去糞便等內(nèi)容物后，剪取3段（每段約1～1.5 cm），用PBS液沖洗干凈，其中一段以4%中性甲醛固定用于常規(guī)HE染色，光鏡下觀察評價病理改變，其余兩段分別放入潔凈EP管中，-80℃保存待測相關(guān)細(xì)胞因子及PLZF蛋白表達(dá)水平。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Figure 1 Experimental procedure

1.2.2 分析幼鼠疾病活動指數(shù)評分

自灌腸第2天（實(shí)驗(yàn)第24天）起至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（實(shí)驗(yàn)第26天），每天觀察記錄各組幼鼠的體質(zhì)量、大便性狀及便血情況，便隱血檢測采用匹拉米酮法，按Okayasu等標(biāo)準(zhǔn)分析幼鼠疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分（表1），DAI＝（體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)）／3。

表1 DAI評分表Table 1 DAI score

1.2.3 觀察幼鼠結(jié)腸組織病理改變

取4%中性甲醛固定的結(jié)腸組織，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察，參照Ekstrom等的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)上皮損傷、水腫、淋巴細(xì)胞／單細(xì)胞／漿細(xì)胞浸潤、中性粒細(xì)胞浸潤和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤等評價病理改變（表2）。

表2 結(jié)腸組織病理學(xué)評分（HPS）1）Table 2 Histopathological score（HPS）1）of colon

1.2.4 檢測幼鼠結(jié)腸IL-4、IL-13、IFN-γ、IL-10水平

從-80℃冰箱取出凍存結(jié)腸組織，快速稱質(zhì)量，分兩次加入共1mL PBS液，研磨充分，室溫下靜置3～5 min，4℃，11 000 g離心15 min，取上清液備用，依照試劑盒要求實(shí)施實(shí)驗(yàn)步驟：稀釋IL-4、IL-13、IFN-γ、IL-10標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，設(shè)立各組，加樣，溫育，洗板，加酶，顯色，利用酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光值A(chǔ)（450 nm），根據(jù)A（450 nm）值繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出方程式計(jì)算待測結(jié)腸標(biāo)本的細(xì)胞因子濃度。

1.2.5 檢測幼鼠結(jié)腸PLZF的蛋白表達(dá)

結(jié)腸標(biāo)本加入裂解液，破碎后取0.5 mL組織勻漿液轉(zhuǎn)移到潔凈的1.5 mL離心管，加入1 mL抽提試劑充分混勻，室溫靜置10 min，4℃，10 000 g離心10 min，吸去上下層液體，敞開管口，干燥蛋白沉淀；BCA蛋白定量法測定結(jié)腸組織總蛋白質(zhì)量濃度；制備SDS-PAGE電泳膠放入電泳槽中，將提取到的總蛋白上樣20μg，通電開始電泳分離樣品：跑濃縮膠的電壓在80 V，約30 min，跑分離膠的電壓在120 V，約60 min，當(dāng)溴芬藍(lán)跑至離膠底端1～2 cm左右停止電泳。將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，然后倒掉封閉液、TBST緩沖液洗膜（5 min／次，共6次）、加入PLZF一抗溶液（VPLZF一抗∶V抗體稀釋液＝1∶500）4℃孵育過夜，同樣TBST緩沖液洗膜、加入二抗溶液（V二抗∶V抗體稀釋液＝1∶4 000），室溫孵育2 h，洗膜后用ECL顯色試劑盒顯色，洗片進(jìn)行顯影和定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，方差齊性選用Levene F檢驗(yàn)，方差齊者，以LSD法進(jìn)行組間兩兩比較，方差不齊則選用Dunnet T3檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布者以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25～P75）］表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis H法）；檢驗(yàn)以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)過程中，空白組死亡16只，參苓白術(shù)散高劑量組死亡17只、中劑量組死亡17只、低劑量組死亡14只，益生菌組死亡16只，模型組死亡15只，共死亡95只。最終用于實(shí)驗(yàn)分析55只。

2.1 幼鼠灌腸后一般情況及DAI評分結(jié)果

空白組：幼鼠體毛細(xì)軟，光澤度好，精神活力良好，體質(zhì)量平穩(wěn)增長，大便呈干燥顆粒狀，便隱血試驗(yàn)陰性。

模型組：從灌腸后至處死前，毛發(fā)散亂無光澤，大便性狀由干燥顆粒狀轉(zhuǎn)為松軟半成形，體質(zhì)量未見明顯減輕，但活力差，懶動多臥，便隱血試驗(yàn)多數(shù)為陽性。

參苓白術(shù)散高劑量組：灌腸后第1天體質(zhì)量明顯下降，第2天開始逐漸回升，活力一般，喜扎堆，大便性狀與灌腸前基本無異，呈干爽顆粒狀，但便隱血試驗(yàn)多數(shù)為陽性。

參苓白術(shù)散中劑量組：灌腸后體質(zhì)量基本維持穩(wěn)定增加，大便松軟半成形、次數(shù)正常，但便隱血試驗(yàn)基本為陽性。

參苓白術(shù)散低劑量組：大便性狀由干轉(zhuǎn)稀、次數(shù)增多，潛血試驗(yàn)陽性持續(xù)存在，灌腸后第1天有明顯的體質(zhì)量下降，之后體質(zhì)量恢復(fù)增加，精神活力反應(yīng)亦有所好轉(zhuǎn)。

益生菌組：體質(zhì)量減輕情況較輕微，大便性狀與灌腸前無異，多為干燥顆粒狀，便隱血試驗(yàn)偶有陽性。

灌腸后第1天，模型組DAI評分高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示造模成功。參苓白術(shù)散高、中、低劑量組DAI評分均高于模型組，益生菌組DAI評分低于模型組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。灌腸后第2天，模型組DAI評分高于空白組，參苓白術(shù)散高劑量組及益生菌組DAI評分均低于模型組，而參苓白術(shù)散中、低劑量組DAI評分高于模型組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。灌腸后第3天，模型組DAI評分高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），參苓白術(shù)散高、中、低劑量組DAI評分均高于模型組，益生菌組DAI評分低于模型組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），如表3、圖2所示。

表3 灌腸后各組幼鼠DAI評分Table 3 DAI scores of juvenile mice in each group after enema［M（P25～P75）］／分

2.2 幼鼠灌腸后的體質(zhì)量變化

灌腸后各組小鼠體質(zhì)量整體呈增長趨勢，但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組幼鼠灌腸后的體質(zhì)量變化如表4和圖3所示。

圖2 灌腸后3 d各組幼鼠DAI評分的變化Figure 2 Changes of DAI scores of juvenile mice in each group 3 days after enema

圖3 1%噁唑酮50%乙醇液灌腸后各組幼鼠體質(zhì)量變化Figure 3 Change in body weight of juvenile mice in each group after enema by 1% oxazolone 50% ethanol

表4 各組幼鼠灌腸后的體質(zhì)量變化Table 4 Change in body weight of juvenile mice in each group after enema（）／g

表4 各組幼鼠灌腸后的體質(zhì)量變化Table 4 Change in body weight of juvenile mice in each group after enema（）／g

2.3 幼鼠結(jié)腸組織鏡下病理改變情況

空白組：黏膜結(jié)構(gòu)完整，各細(xì)胞排列整齊，上皮無損傷，無潰瘍形成，黏膜下層見少量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞輕度浸潤，無嗜酸性粒細(xì)胞浸潤（圖4）。

參苓白術(shù)散高劑量組：黏膜上皮損傷情況輕，腺窩結(jié)構(gòu)基本正常，輕度水腫，肌層見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等中度浸潤，無嗜酸性粒細(xì)胞浸潤（圖4）。

參苓白術(shù)散中劑量組：上皮損傷，無潰瘍形成，輕度水腫，個別腺窩結(jié)構(gòu)消失，有大量炎性細(xì)胞浸潤至肌層，未見嗜酸性粒細(xì)胞浸潤（圖4）。

參苓白術(shù)散低劑量組：黏膜存在上皮損傷，未見潰瘍，偶發(fā)腺窩結(jié)構(gòu)消失，輕度水腫，炎性細(xì)胞浸潤情況較中劑量組輕（圖4）。

益生菌組：黏膜上皮結(jié)構(gòu)較整齊，腺窩結(jié)構(gòu)正常，肌層見少量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，無嗜酸性粒細(xì)胞浸潤（圖4）。

模型組：黏膜上皮損傷，但未形成潰瘍，輕度水腫，大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、漿細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤至漿膜層，未見嗜酸性粒細(xì)胞浸潤（圖4）。

圖4 幼鼠結(jié)腸組織鏡下病理改變Figure 4 The microscopic pathological changes of colonic tissue

空白組幼鼠HPS有分值，鏡下顯示有炎癥細(xì)胞浸潤，考慮為灌腸操作本身對幼鼠是一種炎癥刺激因素，會對幼鼠的病理變化造成一定的影響?？瞻捉M與模型組比較，模型組HPS評分高于空白組，參苓白術(shù)散高、中、低劑量組和益生菌組HPS評分均高于模型組，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。如表5、圖5所示。

圖5 各組幼鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分（HPS）Figure 5 HPSof juvenile mice colonic tissue in each group

表5 各組幼鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分（HPS）Table 5 HPSof juvenile mice colonic tissue in each group［M（P25～P75）］／分

2.4 參苓白術(shù)散對幼鼠結(jié)腸IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ含量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，參苓白術(shù)散改善結(jié)腸炎動物模型病理損傷及降低DAI評分的作用，可呈現(xiàn)劑量依賴性特點(diǎn)，但其對細(xì)胞因子等的影響則常常無此表現(xiàn)［10-12］，故本研究只選取參苓白術(shù)散高劑量組進(jìn)行后續(xù)研究。隨機(jī)選擇空白組、參苓白術(shù)散高劑量組、益生菌組及模型組各5個樣本，檢測結(jié)腸IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ含量。模型組的IL-4、IL-10、IL-13和IFN-γ含量與空白組比較無顯著差異（P＞0.05）。參苓白術(shù)散高劑量組IL-4、IL-10、IL-13和IFN-γ含量均高于模型組，其中IL-10、IFN-γ的增高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.05）。此外，參苓白術(shù)散高劑量組的上述4種細(xì)胞因子含量均高于益生菌組，其中IL-10、IFN-γ的增高有顯著性差異（均為P＜0.01），如表6、圖6所示。

圖6 各組幼鼠結(jié)腸IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ水平Figure 6 Contents of IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γin colon of juvenile mice in each group

表6 各組幼鼠結(jié)腸細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ水平變化Table 6 Contents of IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γin colon of juvenile mice in each group（）／（pg·mL-1）

表6 各組幼鼠結(jié)腸細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ水平變化Table 6 Contents of IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γin colon of juvenile mice in each group（）／（pg·mL-1）

1）與模型組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.01；3）與益生菌組比較，P＜0.011）Compared with model group，P＜0.05；2）Compared with model group，P＜0.01；3）Compared with C.butyricum group，P＜0.01

2.5 參苓白術(shù)散對幼鼠結(jié)腸PLZF蛋白表達(dá)的影響

隨機(jī)選擇空白組、參苓白術(shù)散高劑量組、益生菌組及模型組各5個樣本，檢測調(diào)控iNKT細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子——早幼粒白血病鋅指蛋白（PLZF）表達(dá)水平。與空白組比較，模型組的PLZF蛋白表達(dá)水平增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。參苓白術(shù)散高劑量組的PLZF蛋白表達(dá)水平高于模型組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。益生菌組的PLZF蛋白表達(dá)水平低于模型組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），如圖7所示。

圖7 各組幼鼠結(jié)腸PLZF蛋白表達(dá)Figure 7 The expression of PLZF in colon of juvenile mice in each group

3 討論

AC因主要累及直腸和乙狀結(jié)腸，又稱食物蛋白誘發(fā)的過敏性直結(jié)腸炎（food protein-induced allergic proctocolitis，F(xiàn)PIAP）。AC多見于母乳喂養(yǎng)兒，因母親攝入可疑致敏食物，含有過敏源的乳汁被患兒吸收到消化道，發(fā)生異常的免疫反應(yīng)而導(dǎo)致過敏癥狀［13］。隨著配方奶粉在嬰幼兒喂養(yǎng)中的廣泛應(yīng)用，牛奶蛋白或大豆蛋白過敏導(dǎo)致過敏性腸道疾病發(fā)生的患兒數(shù)量亦有增多的趨勢。牛奶作為嬰幼兒主要的食物來源，也是常見的過敏源［14］。由于迄今尚無非入侵性、特異性強(qiáng)的診斷方法，臨床容易漏診、誤診AC，也使得回避可疑致敏食物的防治方法難以實(shí)現(xiàn)。AC被認(rèn)為是一種非IgE介導(dǎo)的食物過敏反應(yīng)［15］，發(fā)病可能與腸道微生物-黏膜免疫失調(diào)［16-18］、口服耐受被打破［19］、嬰幼兒腸道機(jī)械屏障發(fā)育不成熟［20］、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤結(jié)腸黏膜［21］、食物因素及某些遺傳易感因素有關(guān)，但其確切的病理生理機(jī)制目前尚未明確。

噁唑酮是一種經(jīng)典的半抗原，可與正常腸道菌群產(chǎn)生的糖脂類大分子結(jié)合成為完全抗原，用其灌腸能誘導(dǎo)小鼠發(fā)生結(jié)腸炎，出現(xiàn)體質(zhì)量損失、腹瀉、便血等類似于兒童AC的臨床表現(xiàn)，而且恢復(fù)快，有自愈性特點(diǎn)［22］，與AC由接觸食物源性致敏物質(zhì)而發(fā)病、一旦停止接觸致敏原則可快速痊愈的特點(diǎn)非常相似。因此用噁唑酮誘導(dǎo)法建立幼年小鼠的過敏性結(jié)腸炎模型，符合本實(shí)驗(yàn)探索中醫(yī)藥早期干預(yù)是否能有效防治兒童AC的研究目的。有動物研究表明，噁唑酮誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，IL-4分泌增多，而IFN-γ減少［23］。Heller等［24］則指出，IL-13也是噁唑酮誘導(dǎo)性結(jié)腸炎的重要病理因素，但其被IL-13的中和性抗體（IL-13Rα2-Fc）中和后，小鼠不會發(fā)生結(jié)腸炎癥。另有研究發(fā)現(xiàn)，恒定自然殺傷性T細(xì)胞（iNKT細(xì)胞）相關(guān)缺陷的小鼠不發(fā)生結(jié)腸炎，而iNKT細(xì)胞能在α-半乳糖神經(jīng)酰胺（一種已被證實(shí)能激活CD1d依賴型iNKT細(xì)胞的糖脂類抗原）的刺激下產(chǎn)生IL-13，介導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng)［24］。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的DAI及HPS評分等結(jié)果，參苓白術(shù)散的早期干預(yù)并無法有效減輕AC幼鼠的過敏性炎癥反應(yīng)，減少IL-4、IL-13等促炎細(xì)胞因子的分泌。對此我們考慮以下因素，由于既往尚未見有生育期前幼鼠灌腸惡唑酮致敏的實(shí)驗(yàn)研究，本次灌腸所采用的1%噁唑酮溶液，雖可使幼鼠結(jié)腸出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，與對成年小鼠進(jìn)行的相關(guān)研究類似，但病理學(xué)檢查卻未見明顯嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，其結(jié)腸IL-4、IL-13水平較之空白組增高亦不顯著，說明本實(shí)驗(yàn)所建立的幼鼠AC模型與成年小鼠模型相比存在一定差異。另一方面，對低日齡幼鼠執(zhí)行灌腸操作的難度較大，若按既往文獻(xiàn)所述采用導(dǎo)尿管，發(fā)現(xiàn)無論何種型號，均無法成功插入到結(jié)腸部位。在改用內(nèi)徑適中的PE導(dǎo)管后，雖最終成功地將灌腸液送至結(jié)腸部位，但其硬度高，對低日齡幼鼠腸壁的刺激性強(qiáng)，因此會降低幼鼠對高濃度藥物的耐受性，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與此相對應(yīng)的是，雖然既往研究發(fā)現(xiàn)酪酸梭菌等益生菌的治療能顯著改善噁唑酮誘導(dǎo)的成年AC小鼠的結(jié)腸炎癥反應(yīng)［25］；但本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酪酸梭菌的早期干預(yù)也未能使AC幼鼠的結(jié)腸炎癥得到顯著改善，并減少IL-4、IL-13的表達(dá)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)高劑量參苓白術(shù)散早期干預(yù)的幼鼠，其結(jié)腸IL-10、IFN-γ含量顯著增高，而這兩個細(xì)胞因子能有效抑制過敏性炎癥反應(yīng)。此外，為驗(yàn)證噁唑酮誘導(dǎo)的幼鼠結(jié)腸炎模型及藥物干預(yù)作用是否與iNKT細(xì)胞相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)還選取iNKT細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PLZF進(jìn)行檢測。結(jié)果表明各組間的PLZF表達(dá)水平未出現(xiàn)明顯差異，提示iNKT細(xì)胞可能與此無明顯相關(guān)性。此外，還需要指出的是，本實(shí)驗(yàn)中幼鼠的生存率僅36.7%，既往研究表明，使用噁唑酮誘導(dǎo)法造模的死亡率即使在成年鼠中亦普遍很高，有學(xué)者統(tǒng)計(jì)其平均為35%～40%，甚至也有高達(dá)65%者，其可能原因?yàn)轲つ适АⅢw溫過低和全身性炎癥（涉及血清和脾臟）等［26］，由于幼鼠尚未發(fā)育成熟，對藥物和侵入性操作的耐受性可能更差。

綜上所述，雖然本研究未能在動物實(shí)驗(yàn)層面證實(shí)參苓白術(shù)散早期干預(yù)對防治兒童AC的有效性，但其對IL-10、IFN-γ等抑炎癥因子的影響，提示中醫(yī)藥仍可能存在抑制炎癥的積極作用，但本研究并未明確其具體機(jī)制。這提示在今后的工作中，需進(jìn)一步改進(jìn)研究設(shè)計(jì)，進(jìn)一步優(yōu)化動物模型復(fù)制方法，以利于深入探討兒童AC發(fā)病及中醫(yī)藥防治的相關(guān)機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)聲明

葉麗妍、曾麗盈：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；陳佩文、葉綺娜、賴東蘭：參與部分實(shí)驗(yàn)研究；陳曉剛：提出研究思路和框架，修改論文。

利益沖突聲明

本研究受到國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81674021）資助，不存在任何潛在利益沖突。