動脈粥樣硬化斑塊破裂的關(guān)鍵免疫相關(guān)基因和潛在治療藥物的識別

尚莎莎，陳玉善，李曉輝，王建茹

（河南中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 心臟中心，河南 鄭州 450000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種涉及免疫反應(yīng)的慢性炎癥性疾病，可引起許多臨床并發(fā)癥，如冠狀動脈疾病、外周動脈疾病和缺血性腦卒中［1-3］。近幾十年來，能夠有效預(yù)防或抑制AS病理過程的臨床治療方法有了長足的進(jìn)展。然而，由動脈粥樣硬化斑塊破裂引起的急性心肌梗死和缺血性卒中仍是世界上相當(dāng)大的死亡原因［4-6］。盡管，諸多研究者對AS的病理機(jī)制進(jìn)行了大量的探索研究，但對其仍知之甚少，尤其是斑塊破裂的機(jī)制。免疫系統(tǒng)在AS的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，是研究防治AS的重要切入點(diǎn)［3］。然而，參與動脈粥樣硬化斑塊破裂（atherosclerotic plaque rupture，APR）的特異性免疫機(jī)制尚不完全明確，斑塊破裂的生物學(xué)標(biāo)記物也缺乏。在此背景下，研究APR病理進(jìn)展的免疫機(jī)制，尋找合適的靶點(diǎn)防治斑塊破裂引起的臨床并發(fā)癥具有重要意義。

現(xiàn)階段，已有諸多學(xué)者對人類AS不同階段和病變部位的表達(dá)譜進(jìn)行了研究，包括頸動脈AS斑塊（GSE24495、GSE118481和GSE43292）、外周血管AS斑塊（GSE23304、GSE24702）、冠狀動脈AS 斑 塊（GSE11138）、頸動脈鈣化斑塊（GSE125771，GSE159677）、頸動脈早期和晚期AS斑塊（GSE28829）、頸動脈晚期AS斑塊（GSE97210）、頸動脈破裂和穩(wěn)定 AS斑塊（GSE120521，GSE41571和E-MTAB-2055）等。同時，許多研究也通過將基因芯片和高通量測序數(shù)據(jù)與生物信息學(xué)分析相結(jié)合的方法，來探索AS可能的病理進(jìn)展機(jī)制，并取得了一些進(jìn)展［7-16］。然而，有關(guān)APR的潛在免疫機(jī)制的研究相對較少。因此，積極探索穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展為破裂斑塊的免疫景觀，挖掘能夠早期診斷ARP的免疫相關(guān)診斷標(biāo)志物非常重要。

本研究從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）和ArrayExpress數(shù)據(jù)庫中下載與穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊（stable atherosclerotic plaque，SAP）和破裂動脈粥樣硬化斑塊（ruptured atherosclerotic plaque，RAP）相關(guān)的數(shù)據(jù)集（GSE120521、GSE41571和E-MTAB-2055）。利用SVA包將3個數(shù)據(jù)集合并為一個數(shù)據(jù)集，并利用Limma包篩選合并數(shù)據(jù)集中SAP和RAP樣本間的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），再與免疫相關(guān)基因（immune-related genes，IRGs）取交集，獲取差異表達(dá)的免疫相關(guān)基因（differentially expressed immune-related gene，DEIRGs）。然 后，構(gòu) 建DEIRGs的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，再利用分子復(fù)合物檢測（molecular complex detection，MCODE）插件篩選hub基因。利用連接圖譜（connectivity Map，cMap）預(yù)測了靶向DEIRGs，治療AS斑塊破裂的候選化合物，并將其與hub基因進(jìn)行了分子對接，來評價他們之間的作用關(guān)系。同時，評價了hub基因的診斷效能，并開展了hub基因的單基因基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。本研究的思路流程見圖1。本研究將有助于了解SAP和RAP病理過程中潛在的生物標(biāo)志物及免疫分子機(jī)制，指導(dǎo)更精確的靶向免疫治療，從而進(jìn)一步為其防治提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。

圖1 研究思路流程圖Figure 1 Flowchart of the study design

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的來源和預(yù)處理

為了獲得與AS進(jìn)展相關(guān)的基因，從GEO數(shù)據(jù) 庫（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo）和ArrayExpress數(shù)據(jù)庫（https：／／www.ebi.ac.uk／arrayexpress／）中下載由SAP和破裂動脈粥樣硬化斑塊組成的數(shù)據(jù)集。GSE120521，GSE41571和E-MTAB-2055 3個數(shù)據(jù)集被采用，AS斑塊來自人頸動脈。3個數(shù)據(jù)集的詳細(xì)信息詳見表1。分別下載3個數(shù)據(jù)集的矩陣文件和平臺注釋文件。將GSE120521數(shù)據(jù)集的FPKM數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為TPM數(shù)據(jù)。根據(jù)平臺注釋文件，通過Perl腳本將GSE41571和E-MTAB-2055數(shù)據(jù)集中的探針名稱轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的基因名。如果多個探針對應(yīng)一個基因，則這些探針的平均值即是該基因的最終表達(dá)量。將3個數(shù)據(jù)集合并為一個數(shù)據(jù)集（即合并數(shù)據(jù)集），并使用SVA包消除批次效應(yīng)。

表1 3個選定的數(shù)據(jù)集的相關(guān)信息Table 1 The relevant information of three selected datasets

1.2 DEGs基因的鑒定及其功能富集分析

利用limma包，以｜log2（fold change，F(xiàn)C）｜＞1和P＜0.05為閾值標(biāo)準(zhǔn)對合并數(shù)據(jù)集的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，篩選DEGs［17］。然后，再利用clusterProfiler包對DEGs進(jìn)行基因本體論-生物過程（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。P＜0.05被認(rèn)為是顯著的富集。

1.3 DEIRGs的鑒定

分別從import數(shù)據(jù)庫（https：／／www.immport.org／shared／genelists）和MsigDB數(shù)據(jù)庫（http：／／www.gsea-msigdb.org／gsea／index.jsp）提取IRGs。將篩選出的DEGs和獲取的IRGs取交集，獲取DEIRGs。

1.4 DEIRGs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、模塊分析及hub基因的篩選

將獲得的DEIRGs上傳至STRING數(shù)據(jù)庫（https：／／string-db.org／），選擇“Multiple proteins”模式，互作得分設(shè)置為最高置信度≥0.400，進(jìn)行PPI分析，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。利用MCODE插件并以其默認(rèn)參數(shù)（degree cut-off＝2，node score cut-off＝0.2，Max depth＝100，k-score＝2）對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行Module分析，篩選最重要的子模塊，最重要子模塊中的基因被認(rèn)為是hub基因。利用Pearson相關(guān)分析對hub基因間的相關(guān)性進(jìn)行分析。此外，利用pROC包繪制ROC曲線，并計算曲線下面積（area under the curves，AUC），來評價各hub基因的診斷效能。

1.5 cMap分析和分子對接

依據(jù)GPL96平臺（Affymetrix Human Genome U133A Array），通過Perl腳本將DEIRGs轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的特征集ID，然后將這些ID上傳到cMap數(shù)據(jù) 庫（https：／／portals.broadinstitute.org／cmap／）中。連接性分?jǐn)?shù)（范圍是-1到+1）來評價化合物和DEIRGs之間的相似性。連接性分?jǐn)?shù)負(fù)值越高的化合物代表其對AS進(jìn)展的潛在治療作用越大。篩選閾值設(shè)定為P＜0.01，n≥3，均值＜-0.3。從PubChem（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）數(shù)據(jù)庫中下載化合物的2D結(jié)構(gòu)和分子式；從PDB（http：／／www.rcsb.org／）數(shù)據(jù)庫中下載hub基因的3D結(jié)構(gòu)。最后，利用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對接，獲取結(jié)合能值，對接結(jié)果采用Discovery Studio Visualizer 4.5軟件進(jìn)行可視化。結(jié)合能數(shù)值為負(fù)則提示活性成分與hub基因可自由結(jié)合，數(shù)值越小說明兩者的作用關(guān)系越可靠。

1.6 單個hub基因的GSEA

以單個hub基因在合并數(shù)據(jù)集所有樣本表達(dá)量的中位數(shù)為依據(jù)，將數(shù)據(jù)集中的基因分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。然后，利用GSEA4.1.0軟件，將排列的數(shù)目設(shè)置為1 000，選擇c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt作為參考基因集進(jìn)行GSEA。最后，按照｜NES｜＞1、P＜0.05和FDR＜0.25為閾值篩選陽性基因集。

2 結(jié)果

2.1 DEGs的鑒定及其功能富集分析

由圖2可知SVA包合并后數(shù)據(jù)間的批次效應(yīng)已不是很明顯。共鑒定出93個下調(diào)和98個上調(diào)基因。GO分析結(jié)果顯示，依據(jù)P＜0.05確定了191個GO條目，其中DEGs在嗜中性粒細(xì)胞脫粒、嗜中性粒細(xì)胞活化參與免疫應(yīng)答、嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)免疫、抗原加工和呈遞等過程中顯著富集（圖3A）。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，依據(jù)P＜0.05共映射出了35條信號通路，主要涉及溶酶體、吞噬體、膽固醇代謝、抗原加工和呈遞、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、細(xì)胞黏附分子、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等（圖3B）。

圖2 3個數(shù)據(jù)集合并前后的結(jié)果Figure 2 The results of three datasets before and after merging

圖3 DEGs的功能富集分析的結(jié)果Figure 3 The results of functional enrichment analyses of DEGs

2.2 DEIRGs的鑒定

從MSigDB數(shù)據(jù)庫中的獲得Immune_response（M19817）和Immune_system_process（M13664）兩個免疫相關(guān)基因集合，分別包含235和332個IRGs；從ImmPort數(shù)據(jù)庫中獲得1793個IRGs；合并并剔除重復(fù)后共獲得1959個IRGs。將191個DEGs和1959個IRGs取交集后，共獲得29個DEIRGs，其中上調(diào)基因26個，下調(diào)基因3個（圖4）。

圖4 DEIRGs的韋恩圖Figure 4 Venn diagram of DEIRGs.

2.3 cMap分析

將DEIRGs上傳到cMap數(shù)據(jù)庫，結(jié)果共獲得1309個化合物，其中有9個候選化合物滿足篩選的條件（表2）。9個候選化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖5。

圖5 候選化合物的2D結(jié)構(gòu)Figure 5 2Dstructure of the candidate compounds

表2 通過cMap數(shù)據(jù)庫鑒定出的潛在化合物Table 2 The potential compounds identified by the cMap database.

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、模塊分析及hub基因的鑒定

29個DEIRGs所構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)包括72條邊和27個節(jié)點(diǎn)（圖6A）。利用MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類并構(gòu)建功能模塊，結(jié)果共篩選出1個重要的子模塊，該模塊包括8個節(jié)點(diǎn)和25條邊（圖6B）。這8個節(jié)點(diǎn)即是hub基因，包括單核細(xì)胞分化抗原CD14（monocyte differentiation antigen CD14，CD14）、集落刺激因子1受體（colonystimulating factor 1 receptor，CSF1R）、高親和力免疫球蛋白受體γ亞型（high-affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma，F(xiàn)CER1G）、S100鈣結(jié)合蛋白A9（s100 calcium-binding protein A9，S100A9）、低親和力免疫球蛋白γFc區(qū)受體iii-A（low-affinity immunoglobulin gamma Fc region receptorⅢ-A，F(xiàn)CGR3A）、造血細(xì)胞信號轉(zhuǎn)換器（hematopoietic cell signal transducer，HCST）、TYRO蛋白酪氨酸激酶結(jié)合蛋白（TYRO protein tyrosine kinase binding protein，TYROBP）、整合素亞基β-2（integrin beta 2，ITGB2）。所有hub基因均呈正相關(guān)，其中ITGB2與TYROBP的相關(guān)性最強(qiáng)（圖6C）。AUCs結(jié)果表明，所有hub基因在區(qū)分SAP和RAP方面均表現(xiàn)出良好的診斷性能，可作為AS斑塊破裂的潛在診斷生物標(biāo)志物（圖6D）。

圖6 hub基因的鑒定Figure 6 Identification of hub genes

2.5 分子對接的結(jié)果

為了驗證cMap的分析結(jié)果，將hub基因與其對應(yīng)的潛在化合物進(jìn)行分子對接。圖7A所示，共有72對“潛在化合物-作用靶點(diǎn)”關(guān)系對，且結(jié)合自由能均小于-5 kcal／moL，這提示篩選出來的hub基因與其對應(yīng)的潛在化合物具有良好的親和力，表明cMap分析結(jié)果具有一定的可信度。圖7B-E展示了結(jié)合能小于-8 kcal／moL的對接結(jié)果。

圖7 hub基因與其對應(yīng)潛在化合物分子對接的3D和2D示意圖Figure 7 Schematic（3D and 2D）representation that molecular docking of the hub genes with its corresponding components

2.6 單基因GSEA結(jié)果

為了進(jìn)一步闡釋hub基因在AS斑塊破裂進(jìn)展過程中可能的作用機(jī)制，本研究在合并數(shù)據(jù)集中分別以單個hub基因開展了GSEA。研究結(jié)果顯示，8個hub基因在其低表達(dá)組中均未富集到陽性基因集；在CD14、CSF1R、FCER1G、FCGR3A、HCST、ITGB2、S100A9和TYROBP的高表達(dá)組中分別富集到了42、42、34、43、44、39、43和38個陽性基因集，取交集后共有16個共同基因集，主要包括自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、抗原加工和呈遞、γ介導(dǎo)的吞噬作用、B細(xì)胞受體信號通路、趨化因子信號通路、NOD樣受體信號通等（圖8）。

圖8 單個hub基因GSEA的upset圖Figure 8 The upset plot of single-gene GSEA of hub genes

3 討論

AS是冠狀動脈疾病、缺血性中風(fēng)等許多動脈粥樣硬化性疾病的共同病理生理機(jī)制的基礎(chǔ)，這些疾病是世界上相當(dāng)多的死亡和發(fā)病的主要原因。AS的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與、多步驟的復(fù)雜病理過程。既往大量研究表明，先天免疫和適應(yīng)性免疫機(jī)制均可加速或抑制AS，其已成為近年來研究AS病理過程的熱點(diǎn)［1、3、18］。因此，在這一研究領(lǐng)域應(yīng)深入探索，以便發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的新的防治措施。

為了避免單數(shù)據(jù)集分析存在個體偏倚的情況，本研究使用SVA包將3個符合條件的數(shù)據(jù)集合并為了1個數(shù)據(jù)集，并在合并數(shù)據(jù)集中鑒定出191個DEGs。GO和KEGG富集分析結(jié)果表明，DEGs主要參與了免疫應(yīng)答、抗原加工遞呈、細(xì)胞黏附和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等通路和功能。研究顯示，中心粒細(xì)胞的活化脫顆粒及其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、抗原加工和呈遞等炎癥免疫機(jī)制參與了AS的病理過程［19-20］，這些結(jié)果與本次研究的結(jié)果相似。以上結(jié)果提示，DEGs調(diào)控AS惡化的機(jī)制與免疫相關(guān)的生物學(xué)過程和通路有關(guān)。

眾所周知，與APR相關(guān)的hub基因的識別對嚴(yán)重AS疾病的診斷和防治非常重要。本研究共發(fā)現(xiàn)了29個DEIRGs，從中篩選出了8個hub基因。AUCs結(jié)果表明，8個hub基因在區(qū)分SAP和RAP方面均表現(xiàn)出了良好的診斷性能，是APR的候選診斷生物標(biāo)志物。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，8個hub基因中只有CD14和S100A9被報道參與了APR。Hermansson等［21］報道CD14在血栓性頸動脈斑塊中的表達(dá)顯著增加。已有研究表明，S100A9（又稱MRP-14）被鑒定為易破裂動脈粥樣硬化斑塊的局部標(biāo)記物；S100A8／A9復(fù)合體是急性心肌梗死后局部炎癥反應(yīng)的生物標(biāo)記物，與冠狀動脈和頸動脈粥樣硬化程度具有一定的相關(guān)［22-24］。此外，HCST在AS病理過程中的作用機(jī)制尚未見相關(guān)報道。雖然，已有文獻(xiàn)報道了其他hub基因（CSF1R［25］、FCER1G［26］，F(xiàn)CGR3A［27］、ITGB2［28-29］和TYROBP［29］）介導(dǎo)了AS的病理過程。但是，它們在斑塊破裂中的致病作用機(jī)制尚未被報道。

為了更好地研究hub基因在AS惡化中的潛在生物學(xué)功能，本研究對單個hub基因分別開展了GSEA。GSEA結(jié)果表明，hub基因主要參與了免疫相關(guān)通路，包括自然殺傷（NK）細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、抗原加工和呈遞、細(xì)胞黏附分子、B細(xì)胞受體（BCR）信號通路、核苷酸結(jié)合寡聚域（NOD）樣受體信號通路等。回顧文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)上述提及的一些通路被證實參與了AS的病理過程。NOD1和NOD2是NOD樣受體家族的創(chuàng)始成員，被認(rèn)為是AS因子，尤其是NOD1在APR方面發(fā)揮了突出作用［30-31］。研究表明，NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性功能異常與AS心血管疾病密切相關(guān)［32］。NK細(xì)胞可通過細(xì)胞毒性依賴機(jī)制促進(jìn)AS和AS壞死核的擴(kuò)張［33］。B細(xì)胞通過細(xì)胞間接觸、抗原呈遞和細(xì)胞因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)，進(jìn)而參與促AS病理過程中的免疫反應(yīng)［34］。此外，在AS病理過程中，BCR依賴的信號通過識別氧化特異性抗原表位的相關(guān)抗原而被激活［34］?？傊?，通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，不難發(fā)現(xiàn)這些hub基因富集出的通路與既往文獻(xiàn)報道的結(jié)果存在一些吻合，在一定程度上佐證了本研究結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

隨之，本研究利用cMap數(shù)據(jù)庫篩選了潛在延緩逆轉(zhuǎn)穩(wěn)定斑塊和破裂斑塊之間DEIRGs異常表達(dá)的小分子，并獲得了9個候選化合物，包括阿普萘洛爾（alprenolol）、氟伏沙明（fluvoxamine）、噻嘧啶（pyrantel）、石蒜堿（lycorine）、硫馬唑（sulmazole）、苯海索（trihexyphenidyl）、加貝酯（gabexate）、鏈霉素（streptomycin）、嗎啉胍（moroxydine）。氧化低密度脂蛋白與不穩(wěn)定斑塊壞死核的發(fā)生和進(jìn)展具有很強(qiáng)的相關(guān)性，阿普萘洛爾雖然是一種β受體阻滯劑，也可抑制低密度脂蛋白的氧化修飾，達(dá)到延緩或抑制AS惡化的作用［35］。氟伏沙明作為一種選擇性5-羥色胺再吸收抑制劑型的抗抑郁藥，臨床上已被廣泛用于各種抑郁癥的治療，但其抗AS的確切分子機(jī)制尚不清楚。細(xì)菌、寄生蟲、病毒等病原體感染參與了AS的發(fā)生發(fā)展，為探索AS的病理機(jī)制及干預(yù)措施提供了研究思路［36-37］。基于上述認(rèn)識，嗎啉胍（廣譜抗病毒藥）、噻嘧啶（廣譜驅(qū)蟲藥）、鏈霉素（氨基糖苷類抗生素）雖目前尚未有文獻(xiàn)報道其可防治AS，但表現(xiàn)出了潛在的干預(yù)作用。石蒜堿是藥用石蒜科植物中的重要異喹啉類生物堿，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、調(diào)控脂質(zhì)合成、抗寄生蟲等多種生物學(xué)活性［38］。研究顯示，石蒜堿對心血管疾病也表現(xiàn)出了一定的防治潛力，其不僅可以在體內(nèi)外實驗中有效改善心肌纖維化，還可通過抑制炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等來改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心功能不全［39-40］。加貝酯是一種非肽類的蛋白酶抑制劑，臨床常用于胰腺炎、彌漫性血管內(nèi)凝血等，其在心血管方面的應(yīng)用主要為促進(jìn)心臟缺血后功能的恢復(fù)［41］，左心室輔助裝置安裝后的抗凝治療［42］。硫馬唑作為苯咪唑類衍生物磷酸二酯酶抑制劑，具有明顯的正性肌力和血管擴(kuò)張作用，并能增強(qiáng)心肌對Ca2+的敏感性，可用于充血性心衰等疾病。研究報道，硫馬唑能改善缺血再灌注后頓抑心肌的收縮力及能量代謝，減少心律失常及心肌細(xì)胞損傷［43］。苯海索作為一種中樞抗膽堿類藥物，臨床常用于帕金森病、帕金森綜合征及藥物引起的錐體外系疾病。早期國內(nèi)有研究報道，苯海索可對抗烏頭堿引起的室性心律失常，還可抑制心肌Na+、Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用［44-45］。早期國外學(xué)者曾報道苯海索成功治療嚴(yán)重變異性心絞痛的案例［46］。迄今為止，除了阿普萘洛爾外，其他候選化合物尚未見被報道用于AS的治療，但本研究的結(jié)果可為這些“老藥物”拓展“新用途”提供了一些應(yīng)用思路。此外，本研究分子對接結(jié)果顯示，候選化合物與相應(yīng)hub基因之間具有良好的結(jié)合能力，這從側(cè)面佐證了cMap分析結(jié)果的科學(xué)性和可信性。綜上所述，這些候選化合物表現(xiàn)出了潛在的抑制APR的作用，未來無疑值得深入研究。

本研究尚有一些的局限性，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：①本研究納入分析的樣本量有限。盡管本研究使用SVA包合并了3個數(shù)據(jù)集來彌補(bǔ)這個限制，以保證結(jié)果的客觀性；但因為開放的公共數(shù)據(jù)庫中滿足研究條件的數(shù)據(jù)集較少，因此研究結(jié)果仍需進(jìn)一步在大樣本量的數(shù)據(jù)中進(jìn)行驗證。②cMap數(shù)據(jù)庫雖然已被廣泛用于用于揭示小分子化合物、基因以及疾病狀態(tài)的功能聯(lián)系，但仍跟實際情況存在一些偏倚。③本研究沒有對結(jié)果進(jìn)行實驗驗證，因此仍需要后續(xù)的基礎(chǔ)和臨床研究來進(jìn)行佐證。

總之，本研究利用生物信息學(xué)分析和分子對接技術(shù)，鑒定出了8個hub基因在APR的進(jìn)展過程中起關(guān)鍵作用，其可能是APR的潛在診斷生物標(biāo)志物；發(fā)現(xiàn)了9個候選化合物表現(xiàn)出了靶向免疫機(jī)制治療APR的潛在作用。本研究的核心價值和意義主要體現(xiàn)在以下幾個方面：①APR的特異性免疫機(jī)制尚不完全明確，本研究有助于更好地從免疫學(xué)角度來探索APR的病理機(jī)制；②目前，用于診斷APR的生物學(xué)標(biāo)記物尚缺乏，早期或及時的診斷對于APR的防治尤為重要，本研究可為APR潛在臨床診斷標(biāo)志物的開發(fā)提供了一定的借鑒；③靶向免疫機(jī)制來治療AS一直是心血管領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，本研究所挖掘出的DEIRGs，尤其是hub基因為靶向免疫機(jī)制防治APR提供了方向；④本研究所挖掘出的候選化合物，為潛在抑制APR藥物的開發(fā)提供了一定的科學(xué)依據(jù)，同時也為“老藥新用”的應(yīng)用提供了新的方向和思路。

作者貢獻(xiàn)聲明

尚莎莎：數(shù)據(jù)的整理、文章撰寫；陳玉善：提出研究思路，論文審閱及修訂；李曉輝：負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)集的下載、cMap分析和分子對接的工作；王建茹：提出研究思路，完成數(shù)據(jù)的校正、差異基因及關(guān)鍵基因的篩選、功能富集分析等生物信息學(xué)分析工作。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。