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    GSK-J4對人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用

    2022-09-08 02:10:22鄭穩(wěn)穩(wěn)李安祺劉子建張存龍
    關(guān)鍵詞:貨號細(xì)胞周期甲基化

    鄭穩(wěn)穩(wěn),李安祺,劉子建,張存龍

    (1.暨南大學(xué) 藥學(xué)院,廣東 廣州 510632;2.深圳市坤健創(chuàng)新藥物研究院,廣東 深圳 518110;3.清華大學(xué) 深圳國際研究生院,廣東 深圳 518000)

    結(jié)直腸癌是一種消化道腫瘤,根據(jù)2022年美國癌癥協(xié)會(huì)(American Cancer Society,ACS)的統(tǒng)計(jì),其新發(fā)病率處于所有癌癥中的前3位,且發(fā)病年齡日趨年輕化,嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]。表觀遺傳調(diào)控異常作為癌癥的重要特征[2],在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色[3-4],因此靶向表觀遺傳靶點(diǎn)是結(jié)直腸癌治療的重要手段。

    組蛋白的甲基化修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要組成部分,它主要由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(histone lysine methyltransferases,HMT)和組蛋白去甲基化酶(histone lysine demethylases,KDM)來執(zhí)行[5]。JMJD3(Jumonji domain-containing protein 3)也稱KDM6B,是組蛋白去甲基化酶KDM6家族的一種亞型,可以特異性催化組蛋白H3上第27位賴氨酸(H3K27)側(cè)鏈的去甲基化,增強(qiáng)原癌基因的轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展[6-7]。H3K27上的甲基化水平異常和JMJD3蛋白的表達(dá)異常在多種腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn),并在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及去分化過程中起促進(jìn)作用[8-9]。因此,開發(fā)JMJD3的小分子抑制劑是相關(guān)癌癥靶向治療的可行方案。

    現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的JMJD家族的抑制劑包括琥珀酸[10]、戊鄰?fù)犷悾?1]、銠金屬絡(luò)合物[12]及黃酮醇類似物[13]等。2012年Kruidenier等[14]報(bào)道了JMJD3抑制劑GSK-J1,并改造出細(xì)胞膜穿透效率更高的乙酯側(cè)鏈化合物GSK-J4?,F(xiàn)有研究顯示,化合物GSK-J4可以有效地抑制JMJD3的活性,并且在兒童腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤[15]、急性淋巴細(xì)胞白血病[9]、成神經(jīng)細(xì)胞瘤[16]、乳腺癌[17]及肺腺癌[18]等癌癥的治療中發(fā)揮了一定的效果。

    以上研究表明JMJD3抑制劑GSK-J4對多種癌癥有抑制作用,但是其在結(jié)直腸癌的研究依然相對欠缺。因此,本文將研究GSK-J4對人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用,對癌細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡、細(xì)胞周期等進(jìn)行分析,并通過細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白水平的檢測探討其中的作用機(jī)理。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    細(xì)胞:人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、DLD-1、SW480、SW620、LoVo和HT-29均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

    藥品與試劑:GSK-J4,CAS:1797983-09-5,購于Selleck公司。噻唑藍(lán)(MTT),CAS:298-93-1,購于上海生工生物科技有限公司。Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit(貨號:40302ES20)和細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號:40301ES100)均購于上海翊圣生物科技有限公司。McCoy's 5a(貨號:PM150710)、Ham's F-12K(貨號:PM150910)和Leibovitz's L-15(貨號:PM151010)培養(yǎng)基,購于武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號:10-040-CVRC)購于CORNING公司。胎牛血清(FBS):購于默克Sigma公司。β-Actin抗體,貨號AA128,購于碧云天公司。Histone H3(貨號:4499S)、Mono-Methyl-Histone H3(Lys27,貨號:84932S)、Di-Methyl-Histone H3(Lys27,貨 號:9728S)、Tri-Methyl-Histone H3(Lys27,貨號:9733S)、p27 Kip1(貨號:2552P)、Cleaved Caspase-7(Asp198,貨號:9491S)、Cleaved PARP(Asp214,貨號:9541S)抗體均購于Cell Signaling Technology公司。

    儀器:DTX880 型多功能檢測酶標(biāo)儀(Beckman Coulter公司)、MoFlo XDP流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)、BIO-RAD GelDoc XR凝膠成像儀(BIO-RAD公司)。

    1.2 研究方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    HCT116和HT-29使用McCoy's 5a培養(yǎng)基,DLD-1使用RPMI-1640培養(yǎng)基,LoVo使用Ham's F-12K培養(yǎng)基,以上細(xì)胞的培養(yǎng)條件為37℃,CO2濃度為5%。SW480和SW620使用Leibovitz's L-15培養(yǎng)基,條件為37℃,無須補(bǔ)充CO2。所有的培養(yǎng)基中均加入10% FBS使用。

    1.2.2 MTT法測定細(xì)胞抑制率

    將細(xì)胞懸液接種于96孔板中,每孔100μL,細(xì)胞數(shù)為5 000個(gè)。過夜培養(yǎng),向孔板中加入不同濃度的GSK-J4,培養(yǎng)72 h。每孔加入10μL 5 mg/mL的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。除去培養(yǎng)液,每孔加入100μL DMSO溶解結(jié)晶物,在酶標(biāo)儀490 nm處測量各孔的吸光值。細(xì)胞抑制率=1-(D實(shí)驗(yàn)組-D空白組)/(D對照組-D空白組),實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,并重復(fù)3次。

    1.2.3 Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平

    在對數(shù)期細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入不同濃度的GSK-J4,培養(yǎng)24 h后,裂解細(xì)胞并提取總蛋白。使用二辛可寧酸法(BCA)測定蛋白的濃度,并煮沸變性,以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)膜到硝化纖維膜,以5%脫脂牛奶封閉,之后加入所檢測蛋白的抗體(一抗)孵育,TBST洗滌后加入對應(yīng)的二抗,洗滌后加入顯影液,在BIO-RAD GelDoc XR凝膠成像儀上檢測并拍照,獲得對應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。

    1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

    藥物處理細(xì)胞24 h后,收集(1~5)×105個(gè)細(xì)胞,用PBS清洗兩遍后,加入100μL Binding Buffer及5μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙啶(PI)染液,10~15 min后加入400μL Binding Buffer并進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

    1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

    藥物處理細(xì)胞36 h后,收集(1~10)×105個(gè)細(xì)胞,用PBS清洗一遍后,在乙醇中固定細(xì)胞。用PBS清洗后加入0.5 mL染色緩沖液、10μL碘化丙啶儲(chǔ)液及10μL RNase A,37℃孵育0.5 h,通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

    1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

    在6孔板中每孔接種約500個(gè)細(xì)胞,過夜培養(yǎng),加入藥物進(jìn)行處理,每2 d更換一次培養(yǎng)基,數(shù)天后,用PBS洗去培養(yǎng)基,加入福爾馬林進(jìn)行固定,之后加入結(jié)晶紫染液染色,清洗干凈,晾干并在顯微鏡下拍照。

    1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲

    使用8.0μm的Transwell小室,上室接種細(xì)胞、無血清培養(yǎng)液及加入GSK-J4,下室加入含血清培養(yǎng)液,培養(yǎng)數(shù)天后,用福爾馬林固定,結(jié)晶紫染色并在顯微鏡下拍照。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用GraphPad Prism 8對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,組間差異采用兩樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 GSK-J4對人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制能力

    現(xiàn)有的小分子化合物中,GSK-J1(圖1A)是最有效的JMJD3抑制劑,其JMJD3半抑制濃度(IC50)約為60 nmol/L,但它存在一個(gè)羧酸側(cè)鏈,增大了化合物的極性,使其無法有效的穿透細(xì)胞膜,因而難以發(fā)揮活性。通過前藥策略,Kruidenier等[14]將GSK-J1的羧酸側(cè)鏈改造成乙酯側(cè)鏈,得到了化合物GSK-J4(圖1B),這樣大大提高了化合物的穿透細(xì)胞膜效率,但對JMJD3的IC50從60 nmol/L提升到8.6μmol/L,盡管如此,仍然獲得了較好的藥物活性[14]。

    圖1 JMJD3的抑制劑GSK-J1和GSK-J4Figure 1 GSK-J4 and GSK-J1 are JMJD3 inhibitors

    本研究使用MTT方法評價(jià)GSK-J4對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響。分別用不同濃度梯度的GSK-J4處理細(xì)胞72 h,并獲得對應(yīng)的細(xì)胞抑制率,進(jìn)而計(jì)算出GSK-J4對結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50。GSK-J4對HCT116、DLD-1、SW480、SW620、LoVo和HT-29的IC50分別為(2.07±0.71)、(1.17±0.21)、(0.71±0.31)、(0.72±0.81)、(4.37±0.43)和(4.57±1.09)μmol/L。說明GSK-J4具有良好的抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的能力。下文將選擇HCT116和DLD-1兩種結(jié)腸癌細(xì)胞對GSK-J4的抑制作用進(jìn)行評價(jià)。

    2.2 GSK-J4對HCT116和DLD-1細(xì)胞的克隆形成、侵襲、凋亡及細(xì)胞周期的影響

    首先,使用細(xì)胞克隆形成方法評價(jià)HCT116和DLD-1細(xì)胞的增殖能力。分別用0.2、0.5、1μmol/L濃度的GSK-J4處理細(xì)胞,與對照組相比,隨著藥物濃度的增加,HCT116和DLD-1細(xì)胞的克隆形成能力被逐步抑制(圖2A)。隨后,使用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評價(jià)HCT116和DLD-1的細(xì)胞侵襲能力,1或2μmol/L的GSK-J4都能很好地抑制細(xì)胞的侵襲(圖2B)。

    圖2 GSK-J4對HCT116和DLD-1細(xì)胞克隆、侵襲、凋亡和細(xì)胞周期的影響Figure 2 The effect on cell clone,invasion,apoptosis and cell cycle of HCT116 and DLD-1 by GSK-J4

    除此之外,流式細(xì)胞術(shù)可以分析細(xì)胞凋亡比例及細(xì)胞周期分布。用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒測試細(xì)胞的凋亡狀態(tài),其中Annexin V-FITC可以將早期凋亡的細(xì)胞染色,而PI可以將晚期凋亡的細(xì)胞染色。由圖2C和2D中可以看到,當(dāng)加入的GSK-J4濃度增加時(shí),HCT116和DLD-1的凋亡細(xì)胞比例在增加,5和10μmol/L的GSK-J4處理后,與未處理組的凋亡細(xì)胞比例存在顯著差異。另外,以PI對細(xì)胞核內(nèi)的DNA進(jìn)行染色,并根據(jù)染色強(qiáng)度得到細(xì)胞內(nèi)DNA的相對量,進(jìn)而獲得處于不同細(xì)胞周期內(nèi)的細(xì)胞比例。圖2E和2F中可以看到,在1、2、5 μmol/L濃度下,S期的細(xì)胞比例在不斷增加,GSK-J4處理后與未處理組相比,S期細(xì)胞所占比例存在明顯差異。

    2.3 GSK-J4對HCT116和DLD-1細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

    GSK-J4可以抑制HCT116和DLD-1細(xì)胞的生長,但相關(guān)的分子機(jī)理仍不清楚。使用0.5、2、10μmol/L的GSK-J4處理HCT116和DLD-1細(xì)胞24 h后,以蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)評價(jià)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)情況,并以β-actin作為內(nèi)參(圖3)。其中Histone H3為細(xì)胞內(nèi)包含甲基化和非甲基化的總組蛋白H3水平,而Mono-Methyl-Histone H3(Lys27)、Di-Methyl-Histone H3(Lys27)和Tri-Methyl-Histone H3(Lys27)分別代表組蛋白H3的27位賴氨酸(Lys)被修飾1個(gè)、2個(gè)和3個(gè)甲基基團(tuán)。通過檢測組蛋白H3上27位Lys甲基化的水平,發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加,組蛋白H3K27上單甲基化和二甲基化的水平無明顯變化,三甲基化的比例有所增加。

    圖3 GSK-J4對HCT116和DLD-1細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的影響Figure 3 The effect on proteins expression in HCT116 and DLD-1 cell by GSK-J4

    Caspase-7是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者之一[19],裂解后形成Cleaved Caspase-7成熟亞基,并裂解下游底物[20],其中就包括PARP,因此Cleaved PARP也是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[21]。圖3顯示,隨著GSK-J4濃度的增加,檢測到Cleaved Caspase-7和Cleaved PARP的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào),說明GSK-J4通過內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)了HCT116和DLD-1細(xì)胞的凋亡。p27 Kip1是一種周期依賴性激酶抑制蛋白,可強(qiáng)化細(xì)胞周期的抑制[22-23],p27 Kip1的上調(diào)(圖3)與前面S期細(xì)胞周期阻滯一致,說明GSK-J4抑制了HCT116和DLD-1細(xì)胞的無限增殖能力。

    3 討論

    癌癥是一種多基因疾病,現(xiàn)有研究認(rèn)為表觀遺傳調(diào)控的異常與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中JMJD3催化的組蛋白27位賴氨酸的去甲基化異常在多種癌癥細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn),并促進(jìn)癌癥的發(fā)展和惡化。本文針對JMJD3靶向抑制劑GSK-J4影響多種結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移、凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)行研究,結(jié)果顯示GSK-J4對結(jié)直腸癌細(xì)胞有顯著的抑制作用。使用GSK-J4處理多種結(jié)腸癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),GSK-J4可有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長,其72 h的IC50在0~5μmol/L級別;克隆形成和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明 GSK-J4 可抑制HCT116和DLD-1細(xì)胞的增殖和侵襲;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),GSK-J4可降低HCT116和DLD-1細(xì)胞H3K27me3的水平。GSK-J4通過上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p27 Kip1的表達(dá),使細(xì)胞阻滯在S期,抑制HCT116和DLD-1增殖。HCT116和DLD-1的凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved Caspase-7和凋亡標(biāo)志物Cleaved PARP也出現(xiàn)上調(diào),證明GSK-J4是通過內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。

    JMJD3對于不同腫瘤、同一腫瘤不同細(xì)胞的作用可能存在差異,本研究僅針對部分結(jié)腸癌細(xì)胞,對其他種類的腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用仍有待研究。并且本研究僅在體外細(xì)胞水平進(jìn)行了評價(jià),進(jìn)一步的體內(nèi)研究也是必要的。

    作者貢獻(xiàn)聲明

    鄭穩(wěn)穩(wěn):設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、開展實(shí)驗(yàn),統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù),撰寫論文;李安祺:共同開展實(shí)驗(yàn),撰寫論文;劉子建:提出研究思路和框架,指導(dǎo)實(shí)驗(yàn),修改論文;張存龍:提出研究思路和框架,修改論文。

    利益沖突聲明

    本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助,不存在潛在利益沖突。

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