GSK-J4對人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用

鄭穩(wěn)穩(wěn)，李安祺，劉子建，張存龍

（1.暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.深圳市坤健創(chuàng)新藥物研究院，廣東 深圳 518110；3.清華大學(xué) 深圳國際研究生院，廣東 深圳 518000）

結(jié)直腸癌是一種消化道腫瘤，根據(jù)2022年美國癌癥協(xié)會(huì)（American Cancer Society，ACS）的統(tǒng)計(jì)，其新發(fā)病率處于所有癌癥中的前3位，且發(fā)病年齡日趨年輕化，嚴(yán)重威脅著人類的健康［1］。表觀遺傳調(diào)控異常作為癌癥的重要特征［2］，在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色［3-4］，因此靶向表觀遺傳靶點(diǎn)是結(jié)直腸癌治療的重要手段。

組蛋白的甲基化修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要組成部分，它主要由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone lysine methyltransferases，HMT）和組蛋白去甲基化酶（histone lysine demethylases，KDM）來執(zhí)行［5］。JMJD3（Jumonji domain-containing protein 3）也稱KDM6B，是組蛋白去甲基化酶KDM6家族的一種亞型，可以特異性催化組蛋白H3上第27位賴氨酸（H3K27）側(cè)鏈的去甲基化，增強(qiáng)原癌基因的轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展［6-7］。H3K27上的甲基化水平異常和JMJD3蛋白的表達(dá)異常在多種腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，并在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及去分化過程中起促進(jìn)作用［8-9］。因此，開發(fā)JMJD3的小分子抑制劑是相關(guān)癌癥靶向治療的可行方案。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的JMJD家族的抑制劑包括琥珀酸［10］、戊鄰?fù)犷悾?1］、銠金屬絡(luò)合物［12］及黃酮醇類似物［13］等。2012年Kruidenier等［14］報(bào)道了JMJD3抑制劑GSK-J1，并改造出細(xì)胞膜穿透效率更高的乙酯側(cè)鏈化合物GSK-J4?，F(xiàn)有研究顯示，化合物GSK-J4可以有效地抑制JMJD3的活性，并且在兒童腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤［15］、急性淋巴細(xì)胞白血病［9］、成神經(jīng)細(xì)胞瘤［16］、乳腺癌［17］及肺腺癌［18］等癌癥的治療中發(fā)揮了一定的效果。

以上研究表明JMJD3抑制劑GSK-J4對多種癌癥有抑制作用，但是其在結(jié)直腸癌的研究依然相對欠缺。因此，本文將研究GSK-J4對人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用，對癌細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡、細(xì)胞周期等進(jìn)行分析，并通過細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白水平的檢測探討其中的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

細(xì)胞：人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、DLD-1、SW480、SW620、LoVo和HT-29均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

藥品與試劑：GSK-J4，CAS：1797983-09-5，購于Selleck公司。噻唑藍(lán)（MTT），CAS：298-93-1，購于上海生工生物科技有限公司。Annexin V-FITC／PI Apoptosis Detection Kit（貨號：40302ES20）和細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（貨號：40301ES100）均購于上海翊圣生物科技有限公司。McCoy's 5a（貨號：PM150710）、Ham's F-12K（貨號：PM150910）和Leibovitz's L-15（貨號：PM151010）培養(yǎng)基，購于武漢普諾賽（Procell）生命科技有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基（貨號：10-040-CVRC）購于CORNING公司。胎牛血清（FBS）：購于默克Sigma公司。β-Actin抗體，貨號AA128，購于碧云天公司。Histone H3（貨號：4499S）、Mono-Methyl-Histone H3（Lys27，貨號：84932S）、Di-Methyl-Histone H3（Lys27，貨 號：9728S）、Tri-Methyl-Histone H3（Lys27，貨號：9733S）、p27 Kip1（貨號：2552P）、Cleaved Caspase-7（Asp198，貨號：9491S）、Cleaved PARP（Asp214，貨號：9541S）抗體均購于Cell Signaling Technology公司。

儀器：DTX880 型多功能檢測酶標(biāo)儀（Beckman Coulter公司）、MoFlo XDP流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司）、BIO-RAD GelDoc XR凝膠成像儀（BIO-RAD公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT116和HT-29使用McCoy's 5a培養(yǎng)基，DLD-1使用RPMI-1640培養(yǎng)基，LoVo使用Ham's F-12K培養(yǎng)基，以上細(xì)胞的培養(yǎng)條件為37℃，CO2濃度為5%。SW480和SW620使用Leibovitz's L-15培養(yǎng)基，條件為37℃，無須補(bǔ)充CO2。所有的培養(yǎng)基中均加入10% FBS使用。

1.2.2 MTT法測定細(xì)胞抑制率

將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL，細(xì)胞數(shù)為5 000個(gè)。過夜培養(yǎng)，向孔板中加入不同濃度的GSK-J4，培養(yǎng)72 h。每孔加入10μL 5 mg／mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。除去培養(yǎng)液，每孔加入100μL DMSO溶解結(jié)晶物，在酶標(biāo)儀490 nm處測量各孔的吸光值。細(xì)胞抑制率＝1-（D實(shí)驗(yàn)組-D空白組）／（D對照組-D空白組），實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并重復(fù)3次。

1.2.3 Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平

在對數(shù)期細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入不同濃度的GSK-J4，培養(yǎng)24 h后，裂解細(xì)胞并提取總蛋白。使用二辛可寧酸法（BCA）測定蛋白的濃度，并煮沸變性，以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)膜到硝化纖維膜，以5%脫脂牛奶封閉，之后加入所檢測蛋白的抗體（一抗）孵育，TBST洗滌后加入對應(yīng)的二抗，洗滌后加入顯影液，在BIO-RAD GelDoc XR凝膠成像儀上檢測并拍照，獲得對應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

藥物處理細(xì)胞24 h后，收集（1～5）×105個(gè)細(xì)胞，用PBS清洗兩遍后，加入100μL Binding Buffer及5μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙啶（PI）染液，10～15 min后加入400μL Binding Buffer并進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

藥物處理細(xì)胞36 h后，收集（1～10）×105個(gè)細(xì)胞，用PBS清洗一遍后，在乙醇中固定細(xì)胞。用PBS清洗后加入0.5 mL染色緩沖液、10μL碘化丙啶儲(chǔ)液及10μL RNase A，37℃孵育0.5 h，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

在6孔板中每孔接種約500個(gè)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，加入藥物進(jìn)行處理，每2 d更換一次培養(yǎng)基，數(shù)天后，用PBS洗去培養(yǎng)基，加入福爾馬林進(jìn)行固定，之后加入結(jié)晶紫染液染色，清洗干凈，晾干并在顯微鏡下拍照。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲

使用8.0μm的Transwell小室，上室接種細(xì)胞、無血清培養(yǎng)液及加入GSK-J4，下室加入含血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)數(shù)天后，用福爾馬林固定，結(jié)晶紫染色并在顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，組間差異采用兩樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSK-J4對人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制能力

現(xiàn)有的小分子化合物中，GSK-J1（圖1A）是最有效的JMJD3抑制劑，其JMJD3半抑制濃度（IC50）約為60 nmol／L，但它存在一個(gè)羧酸側(cè)鏈，增大了化合物的極性，使其無法有效的穿透細(xì)胞膜，因而難以發(fā)揮活性。通過前藥策略，Kruidenier等［14］將GSK-J1的羧酸側(cè)鏈改造成乙酯側(cè)鏈，得到了化合物GSK-J4（圖1B），這樣大大提高了化合物的穿透細(xì)胞膜效率，但對JMJD3的IC50從60 nmol／L提升到8.6μmol／L，盡管如此，仍然獲得了較好的藥物活性［14］。

圖1 JMJD3的抑制劑GSK-J1和GSK-J4Figure 1 GSK-J4 and GSK-J1 are JMJD3 inhibitors

本研究使用MTT方法評價(jià)GSK-J4對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響。分別用不同濃度梯度的GSK-J4處理細(xì)胞72 h，并獲得對應(yīng)的細(xì)胞抑制率，進(jìn)而計(jì)算出GSK-J4對結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50。GSK-J4對HCT116、DLD-1、SW480、SW620、LoVo和HT-29的IC50分別為（2.07±0.71）、（1.17±0.21）、（0.71±0.31）、（0.72±0.81）、（4.37±0.43）和（4.57±1.09）μmol／L。說明GSK-J4具有良好的抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的能力。下文將選擇HCT116和DLD-1兩種結(jié)腸癌細(xì)胞對GSK-J4的抑制作用進(jìn)行評價(jià)。

2.2 GSK-J4對HCT116和DLD-1細(xì)胞的克隆形成、侵襲、凋亡及細(xì)胞周期的影響

首先，使用細(xì)胞克隆形成方法評價(jià)HCT116和DLD-1細(xì)胞的增殖能力。分別用0.2、0.5、1μmol／L濃度的GSK-J4處理細(xì)胞，與對照組相比，隨著藥物濃度的增加，HCT116和DLD-1細(xì)胞的克隆形成能力被逐步抑制（圖2A）。隨后，使用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評價(jià)HCT116和DLD-1的細(xì)胞侵襲能力，1或2μmol／L的GSK-J4都能很好地抑制細(xì)胞的侵襲（圖2B）。

圖2 GSK-J4對HCT116和DLD-1細(xì)胞克隆、侵襲、凋亡和細(xì)胞周期的影響Figure 2 The effect on cell clone，invasion，apoptosis and cell cycle of HCT116 and DLD-1 by GSK-J4

除此之外，流式細(xì)胞術(shù)可以分析細(xì)胞凋亡比例及細(xì)胞周期分布。用Annexin V-FITC／PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒測試細(xì)胞的凋亡狀態(tài)，其中Annexin V-FITC可以將早期凋亡的細(xì)胞染色，而PI可以將晚期凋亡的細(xì)胞染色。由圖2C和2D中可以看到，當(dāng)加入的GSK-J4濃度增加時(shí)，HCT116和DLD-1的凋亡細(xì)胞比例在增加，5和10μmol／L的GSK-J4處理后，與未處理組的凋亡細(xì)胞比例存在顯著差異。另外，以PI對細(xì)胞核內(nèi)的DNA進(jìn)行染色，并根據(jù)染色強(qiáng)度得到細(xì)胞內(nèi)DNA的相對量，進(jìn)而獲得處于不同細(xì)胞周期內(nèi)的細(xì)胞比例。圖2E和2F中可以看到，在1、2、5 μmol／L濃度下，S期的細(xì)胞比例在不斷增加，GSK-J4處理后與未處理組相比，S期細(xì)胞所占比例存在明顯差異。

2.3 GSK-J4對HCT116和DLD-1細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

GSK-J4可以抑制HCT116和DLD-1細(xì)胞的生長，但相關(guān)的分子機(jī)理仍不清楚。使用0.5、2、10μmol／L的GSK-J4處理HCT116和DLD-1細(xì)胞24 h后，以蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)評價(jià)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)情況，并以β-actin作為內(nèi)參（圖3）。其中Histone H3為細(xì)胞內(nèi)包含甲基化和非甲基化的總組蛋白H3水平，而Mono-Methyl-Histone H3（Lys27）、Di-Methyl-Histone H3（Lys27）和Tri-Methyl-Histone H3（Lys27）分別代表組蛋白H3的27位賴氨酸（Lys）被修飾1個(gè)、2個(gè)和3個(gè)甲基基團(tuán)。通過檢測組蛋白H3上27位Lys甲基化的水平，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，組蛋白H3K27上單甲基化和二甲基化的水平無明顯變化，三甲基化的比例有所增加。

圖3 GSK-J4對HCT116和DLD-1細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的影響Figure 3 The effect on proteins expression in HCT116 and DLD-1 cell by GSK-J4

Caspase-7是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者之一［19］，裂解后形成Cleaved Caspase-7成熟亞基，并裂解下游底物［20］，其中就包括PARP，因此Cleaved PARP也是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志［21］。圖3顯示，隨著GSK-J4濃度的增加，檢測到Cleaved Caspase-7和Cleaved PARP的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，說明GSK-J4通過內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)了HCT116和DLD-1細(xì)胞的凋亡。p27 Kip1是一種周期依賴性激酶抑制蛋白，可強(qiáng)化細(xì)胞周期的抑制［22-23］，p27 Kip1的上調(diào)（圖3）與前面S期細(xì)胞周期阻滯一致，說明GSK-J4抑制了HCT116和DLD-1細(xì)胞的無限增殖能力。

3 討論

癌癥是一種多基因疾病，現(xiàn)有研究認(rèn)為表觀遺傳調(diào)控的異常與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中JMJD3催化的組蛋白27位賴氨酸的去甲基化異常在多種癌癥細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，并促進(jìn)癌癥的發(fā)展和惡化。本文針對JMJD3靶向抑制劑GSK-J4影響多種結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移、凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)行研究，結(jié)果顯示GSK-J4對結(jié)直腸癌細(xì)胞有顯著的抑制作用。使用GSK-J4處理多種結(jié)腸癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，GSK-J4可有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長，其72 h的IC50在0～5μmol／L級別；克隆形成和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明 GSK-J4 可抑制HCT116和DLD-1細(xì)胞的增殖和侵襲；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GSK-J4可降低HCT116和DLD-1細(xì)胞H3K27me3的水平。GSK-J4通過上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p27 Kip1的表達(dá)，使細(xì)胞阻滯在S期，抑制HCT116和DLD-1增殖。HCT116和DLD-1的凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved Caspase-7和凋亡標(biāo)志物Cleaved PARP也出現(xiàn)上調(diào)，證明GSK-J4是通過內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。

JMJD3對于不同腫瘤、同一腫瘤不同細(xì)胞的作用可能存在差異，本研究僅針對部分結(jié)腸癌細(xì)胞，對其他種類的腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用仍有待研究。并且本研究僅在體外細(xì)胞水平進(jìn)行了評價(jià)，進(jìn)一步的體內(nèi)研究也是必要的。

作者貢獻(xiàn)聲明

鄭穩(wěn)穩(wěn)：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、開展實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；李安祺：共同開展實(shí)驗(yàn)，撰寫論文；劉子建：提出研究思路和框架，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，修改論文；張存龍：提出研究思路和框架，修改論文。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。