香榧癭螨物種鑒定及防控技術(shù)研究

耿顯勝，葉碧歡，張威，陳友吾，舒金平，林明

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023）

榧樹Torreya grandis是紅豆杉科Taxaceae 榧樹屬Torreya常綠針葉樹種，也是國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物[1]。榧樹自然變異類型或單株中選出的優(yōu)良栽培品種香榧T.grandis‘Merrillii’是我國(guó)東南部的重要經(jīng)濟(jì)樹種，在當(dāng)?shù)亓謽I(yè)經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著重要作用[2-3]。香榧種子不僅富含蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、角鯊烯、植物甾醇、生育酚、煙酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分，而且風(fēng)味獨(dú)特、香氣誘人，深受中國(guó)消費(fèi)者歡迎，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1,4-7]。香榧的種植面積和堅(jiān)果年產(chǎn)量均不大，產(chǎn)品供不應(yīng)求，市場(chǎng)價(jià)格高達(dá)120～200 元·kg-1，是目前價(jià)格最高的干果之一[2-3,8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，浙江省諸暨市趙家鎮(zhèn)和東白湖鎮(zhèn)每年生產(chǎn)香榧堅(jiān)果1 000 多噸，年收入約4 億元人民幣[3,8]。目前，中國(guó)有超過5 萬農(nóng)民以種植香榧和生產(chǎn)香榧堅(jiān)果作為主要的經(jīng)濟(jì)收入來源，香榧已成為農(nóng)民發(fā)家致富的潛力樹種[3,8]。

癭螨Eriophyoidea 是植食性螨類中經(jīng)濟(jì)重要性僅次于葉螨Tetranychoidea 的一類害螨[9]。癭螨不僅直接刺吸危害植物，危害造成蟲癭、毛氈、水皰、叢生、器官變色和卷曲畸形、器官脫落等癥狀，同時(shí)還能傳播植物病毒病，造成間接危害。我國(guó)危害香榧的癭螨最早報(bào)道于1988 年[10]，而浙江省香榧受癭螨危害的報(bào)道最早是在2002 年[11]。目前，浙江省的各香榧產(chǎn)區(qū)均發(fā)現(xiàn)有癭螨危害，癭螨已成為香榧的主要害蟲。癭螨群聚于香榧葉片上吸取細(xì)胞汁液和葉綠體，輕則造成葉片失綠呈黃褐色，影響葉片的光合作用，重則引起大量落葉，甚至整株樹木死亡[11-12]。如何高效地防控癭螨，保障香榧林的健康經(jīng)營(yíng)，成為生產(chǎn)中需要解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。

癭螨由于個(gè)體小，形態(tài)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，用于分類的外部形態(tài)特征少，并且有些形態(tài)特征存在同塑性進(jìn)化（Homoplastic evolution）現(xiàn)象，這給傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定帶來了困難和挑戰(zhàn)[9,13-14]。基于分子生物學(xué)的鑒定技術(shù)具有鑒定速度快、精確度高、重復(fù)性好、對(duì)樣品完整性要求低等特點(diǎn)，已成為物種鑒定的重要方法[15-16]。而將形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)與分子生物學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合的鑒定方法，已成為癭螨物種鑒定最有效的方法[9,13-14,17]。本研究擬采用形態(tài)學(xué)鑒定法對(duì)香榧癭螨進(jìn)行物種鑒定，采用林間生物測(cè)定法測(cè)定了4 種殺螨劑和1 種捕食螨的防治效果，以期為香榧癭螨的物種鑒定及高效防控提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 香榧癭螨的形態(tài)學(xué)鑒定

2020 年6 月，于浙江省杭州市富陽(yáng)區(qū)癭螨危害的香榧林（30°2′2" N，119°42′32" E），用枝剪剪取香榧枝條，裝于自封袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室。從枝條上剪取香榧葉片，置于VHX-5000 超景深三維顯微鏡下觀察，初步確定葉片上存在大量的癭螨。使用毛筆挑取葉片上的癭螨，制備成玻片標(biāo)本，用于形態(tài)學(xué)鑒定和繪圖。

1.2 香榧癭螨的系統(tǒng)發(fā)育分析

顯微鏡下使用毛筆挑取香榧葉片上的癭螨，置于含180 μL Buffer GL 的2 mL 離心管內(nèi)，每管挑30 頭癭螨，共挑3 管。依據(jù)通用型基因組提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0,TaKaRa）的方法提取基因組總DNA。

以提取的總DNA 為模板，采用3 對(duì)引物（表1）擴(kuò)增28S rDNA、18S rDNA 和COI基因片段。28S rDNA和18S rDNA 基因片段PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 10 μL，10 μmol·L-1的正、反向引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，加ddH2O 補(bǔ)足20 μL。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。COI基因片段PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系和條件參考Xue 等[18]的方法，具體的反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的正、反向引物各1 μL，DNA 模板2 μL，加ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：96 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR 擴(kuò)增為陽(yáng)性的產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序序列使用DNAMAN 9.0 進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，并使用NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線比對(duì)分析，下載與候選序列具有很高同源性的GenBank 序列。

表1 本研究使用的引物序列Table 1 Primer sequences

使用PhyloSuite v.1.2.2 軟件對(duì)癭螨總科26 個(gè)物種/憑證樣本的28S rDNA-18S rDNA 序列聯(lián)合構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹[19]，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)使用的外群為葉螨總科Tetranychoidea 的神澤葉螨Tetranychus kanzawai。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的具體方法和參數(shù)設(shè)置參見Geng 等[20]的方法和參數(shù)設(shè)置。構(gòu)建好的系統(tǒng)發(fā)育樹使用FigTree v.1.4.3及Adobe Illustrator CS6 查看和美化。

1.3 香榧癭螨防控技術(shù)研究

1.3.1 供試藥劑和捕食螨 15% 噠螨靈（廣西田園生化股份有限公司），3%甲維·虱螨脲和5%阿維菌素（浙江世佳科技有限公司），21%阿維·螺螨酯（浙江永農(nóng)生物科學(xué)有限公司）；加州新小綏螨Neoseiulus californicus（福建福州冠農(nóng)生物科技有限公司）。

1.3.2 化學(xué)農(nóng)藥林間防治效果測(cè)定 2021 年10 月15 日，在浙江省衢州市衢江區(qū)選取冷杉納氏癭螨Nalepella abiesis危害的12 年生香榧人工林（29°07′16" N，118°58′21" E）開展林間防治效果測(cè)定。參考農(nóng)藥使用說明書推薦的施用濃度，用自來水將15%噠螨靈、3% 甲維·虱螨脲、5%阿維菌素和21%阿維·螺螨酯4 種化學(xué)農(nóng)藥分別配制成高濃度（1 500 倍、1 000 倍、1 000 倍和2 500 倍）和推薦濃度（3 000 倍、2 000 倍、2 000 倍和5 000 倍）2 個(gè)濃度梯度。采用噴霧法施藥，每個(gè)處理噴霧4 株香榧，每株香榧的平均噴霧量為5 L。試驗(yàn)以噴霧清水為對(duì)照處理。噴霧前和噴霧后7 d，每株香榧從東南西北4 個(gè)方向各剪取1 個(gè)枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室。每個(gè)枝條上取新葉和老葉各1 片，在VHX-5000 顯微鏡下統(tǒng)計(jì)施藥前后每片葉子上冷杉納氏癭螨的蟲口數(shù)量，計(jì)算每個(gè)處理的蟲口減退率和防治效果。蟲口減退率和防治效果的計(jì)算公式如下：

1.3.3 加州新小綏螨室內(nèi)和林間捕食效果測(cè)定 在室內(nèi)使用培養(yǎng)皿搭建水阻隔平臺(tái)，進(jìn)行加州新小綏螨室內(nèi)捕食實(shí)驗(yàn)。采集冷杉納氏癭螨危害的香榧葉片，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)葉片上癭螨的數(shù)量，之后將葉片放置于培養(yǎng)皿中，接入加州新小綏螨，實(shí)驗(yàn)共用9 片香榧葉片。接螨后的水阻隔平臺(tái)放置于人工氣候箱內(nèi)。人工氣候箱的設(shè)置為：溫度25℃，相對(duì)濕度85%，光照強(qiáng)度2 000 lx，光周期12D:12L。48 h 后統(tǒng)計(jì)香榧葉片上的冷杉納氏癭螨數(shù)量，計(jì)算捕食率。捕食率的計(jì)算公式如下：

捕食率=被捕食的癭螨數(shù)量÷癭螨總數(shù)×100%

2021 年10 月15 日，在浙江省衢州市衢江區(qū)選取冷杉納氏癭螨危害的12 年生香榧人工林開展林間防治效果測(cè)定。每株香榧樹上掛5 袋加州新小綏螨（3 000 頭·袋-1），實(shí)驗(yàn)重復(fù)4 次。釋放捕食螨前和7 d 之后，每株香榧從東南西北4 個(gè)方向各剪取1 個(gè)枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室。依據(jù)1.3.2 的方法統(tǒng)計(jì)葉片上害螨的蟲口數(shù)量，使用1.3.2 的公式計(jì)算蟲口減退率和防治效果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010 和SPSS 23.0 進(jìn)行分析處理。使用SPSS 23.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)、方差齊性檢驗(yàn)和方差分析。方差分析時(shí)，需要對(duì)蟲口減退率和防治效果的原始數(shù)據(jù)做反正旋轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧癭螨的形態(tài)學(xué)鑒定

室內(nèi)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，香榧葉片上存在大量的癭螨。癭螨的卵和若蟲存在于葉片的背面，成蟲活動(dòng)能力強(qiáng)于若蟲，主要存在于葉片的背面，但腹面也有分布。癭螨使用刺吸式口器吸食香榧葉片的汁液和葉綠體，造成受害部位初期呈白色失綠狀，后期呈黃褐色。大量癭螨聚集在香榧葉片上危害，輕則造成葉片發(fā)黃且失去光澤，嚴(yán)重者引起葉片脫落，甚至整株樹木死亡。

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，危害香榧的癭螨為冷杉納氏癭螨。該癭螨隸屬于植羽癭螨科Phytoptidae 納氏癭螨屬Nalepella。冷杉納氏癭螨的主要鑒別特征為：體紡錘形；喙斜下伸，口針略彎曲；須肢端部平截，須肢背膝節(jié)剛毛不分叉；背盾板具前葉突，背瘤發(fā)達(dá)，圓柱形，背毛3 根，包括1 根短的內(nèi)頂毛和2 根長(zhǎng)的背毛；足6 節(jié)，具模式剛毛，羽狀爪完整，9 支，爪端球明顯，足I 脛節(jié)上具小刺，基節(jié)剛毛3 對(duì)；大體無亞背毛，腹剛毛俱全，如圖1。

圖1 冷杉納氏癭螨成螨的形態(tài)特征Figure 1 The morphological characteristics of adult N.abiesis

2.2 香榧癭螨的系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR 擴(kuò)增結(jié)果表明，3 對(duì)引物都能夠擴(kuò)增出特異性條帶，并且擴(kuò)增條帶的大小與預(yù)期大小一致（圖2），初步確定3 對(duì)引物能夠特異性擴(kuò)增出癭螨的28S rDNA、18S rDNA 和COI基因片段。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列分析，得到癭螨28S rDNA的460 bp 序列、18S rDNA 的807 bp 序列和COI基因的658 bp序列。

圖2 PCR 擴(kuò)增冷杉納氏癭螨28S rDNA、18S rDNA 和COI 基因片段Figure 2 PCR amplification of 28S rDNA,18S rDNA,and COI fragment from genomic DNA extracted from N.abiesis on T.grandis ‘Merrillii’

DNAMAN 9.0 多重序列比對(duì)結(jié)果表明，3 個(gè)樣品間18S rDNA 的同源性為99.75%，而3 個(gè)樣品間28S rDNA和COI 基因片段的同源性為100%。測(cè)序序列經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，未在GenBank 中找到同源性很高的癭螨物種序列。本研究獲取了冷杉納氏癭螨28S rDNA、18S rDNA 和COI基因序列，將這些序列提交到GenBank（登錄號(hào)分別為：OM701792、OM717253 和OM692372）。

使用癭螨總科26 個(gè)物種/憑證樣本的28S rDNA-18S rDNA 串聯(lián)序列采用貝葉斯推斷法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹時(shí)28S rDNA 和18S rDNA 使用的核苷酸替換模型都是GTR+I+G。從貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以看出，26 個(gè)癭螨總科的物種/憑證樣本分成3 個(gè)分支，本研究的冷杉納氏癭螨與三毛癭螨屬Trisetacus、納氏癭螨屬Nalepella、博氏癭螨屬Boczekella和Setoptus屬的7 個(gè)物種/憑證樣本形成Clade I 分支，該分支所有物種/憑證樣本都屬于植羽癭螨科，表明這4 個(gè)屬間的親緣關(guān)系很近（圖3）。分析Clade I 包含物種的寄主植物，所有8個(gè)癭螨物種/憑證樣本的寄主植物都是裸子植物門的針葉樹種，表明寄生在親緣關(guān)系近的寄主植物上的癭螨物種也具有較近的親緣關(guān)系。Clade II 分支包含癭螨科Eriophyidae 和羽爪癭螨科Diptilomiopidae 的16 個(gè)物種/憑證樣本，表明癭螨科和羽爪癭螨科物種間的親緣關(guān)系很近（圖3）。Clade III 分支包含植羽癭螨科的2 個(gè)物種，這2 個(gè)物種都采集于俄羅斯，并且其寄主均為草本的莎草科Cyperaceae 植物（圖3）。

圖3 基于28S rDNA 和18S rDNA 序列聯(lián)合構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Bayesian inference phytogenic tree based on 28S rDNA and 18S rDNA sequences

2.3 冷杉納氏癭螨防控技術(shù)研究

經(jīng)室內(nèi)顯微觀察，浙江省衢州市衢江區(qū)實(shí)驗(yàn)林的香榧葉片上也存在大量的冷杉納氏癭螨（圖4）。由表2 可知，防治前其蟲口密度在16.84～30.84 頭·片葉-1，防治后其蟲口密度降低到3.41～18.31 頭·片葉-1。施藥和釋放加州新小綏螨后冷杉納氏癭螨蟲口密度和蟲口減退率的方差分析結(jié)果表明，不同處理間差異顯著（P＜0.05）。所有9 種處理與對(duì)照處理間的差異都達(dá)到顯著水平（P＜0.05），表明所有的處理均能顯著降低香榧葉片上癭螨的蟲口密度。高濃度和推薦濃度的15%噠螨靈、5%阿維菌素和21% 阿維·螺螨酯施用后，各處理的蟲口密度差異均不顯著（P＞0.05）（表2），表明這3種農(nóng)藥在推薦濃度下即可明顯降低香榧葉片上的癭螨的蟲口密度；施用高濃度（1 000 倍）和推薦濃度的3% 甲維·虱螨脲后，蟲口密度差異顯著（P＜0.05）（表2），表明該藥劑在高濃度時(shí)對(duì)香榧葉片上癭螨的蟲口密度的降低作用更明顯。

圖4 香榧葉片上的冷杉納氏癭螨Figure 4 N.abiesis on T.grandis ‘Merrillii’ leaf

防治效果表明，9 種處理的防治效果在55.93%～88.70%（表2），其中21%阿維·螺螨酯和15% 噠螨靈在推薦濃度下的防治效果在87.00%以上，高于5%阿維菌素和3%甲維·虱螨脲的防治效果，也顯著高于（P＜0.05）捕食螨的防治效果。因此，21%阿維·螺螨酯和15%噠螨靈對(duì)冷杉納氏癭螨的防治效果更好。

表2 施藥和釋放天敵前后香榧葉片上冷杉納氏癭螨的蟲口密度和防治效果Table 2 Population density of N.abiesis on T.grandis ‘Merrillii’ leaves before and after chemical control and natural enemy release

室內(nèi)捕食螨的捕食效果表明，加州新小綏螨對(duì)冷杉納氏癭螨的卵、若螨和成螨均具有捕食功能，加州新小綏螨對(duì)9 張葉片上癭螨的捕食率為95.45%～100%。林間釋放加州新小綏螨時(shí)，其蟲口減退率和防治食效果僅為26.25%和55.93%，低于室內(nèi)測(cè)定結(jié)果，也低于4 種化學(xué)農(nóng)藥的林間測(cè)定結(jié)果。很有可能是香榧葉片上冷杉納氏癭螨的蟲口密度太大，釋放加州新小綏螨難以捕食掉所有的害螨。因此，生產(chǎn)中應(yīng)將捕食螨與化學(xué)農(nóng)藥聯(lián)合使用，先施用21%阿維·螺螨酯或15%噠螨靈，將蟲口密度降低下來，然后再釋放加州新小綏螨。

3 結(jié)論與討論

本研究采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法對(duì)香榧癭螨進(jìn)行物種鑒定，明確了危害香榧的癭螨為冷杉納氏癭螨，研究結(jié)果可為冷杉納氏癭螨的快速鑒定提供參考。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，冷杉納氏癭螨與三毛癭螨屬、納氏癭螨屬、博氏癭螨屬和Setoptus屬的7 個(gè)物種/憑證樣本間親緣關(guān)系近，而所有8 個(gè)癭螨物種/憑證樣本的寄主植物都是裸子植物門Gymnospermae 的針葉樹種，揭示癭螨物種的進(jìn)化與寄主植物相關(guān)聯(lián)。

香榧是一種壽命很長(zhǎng)的四季常綠的針葉樹種[2]，長(zhǎng)壽命和冬季不落葉的特性為冷杉納氏癭螨的寄生提供了穩(wěn)定的環(huán)境條件。冷杉納氏癭螨個(gè)體微小，人眼難以觀察到，加上早期的危害癥狀不明顯，這為冷杉納氏癭螨通過種苗或嫁接繁殖體遠(yuǎn)距離傳播和擴(kuò)散創(chuàng)造了條件。自2002 年首次在浙江省發(fā)現(xiàn)冷杉納氏癭螨危害以來，該害螨在浙江省迅速擴(kuò)散和蔓延。目前，浙江省的絕大多數(shù)種植區(qū)的香榧都遭受癭螨的危害。癭螨危害致使香榧葉片失綠，嚴(yán)重者葉片大量脫落，甚至整株死亡[11,17]。如何高效地防控冷杉納氏癭螨，成為生產(chǎn)中需要解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。本研究通過林間生物測(cè)定法，測(cè)定了4 種殺螨劑和1 種捕食螨在林間的防治效果。4 種化學(xué)農(nóng)藥中，21%阿維·螺螨酯和15%噠螨靈在推薦濃度下的防治效果均超過87.00%，高于另外2 種化學(xué)農(nóng)藥。因此，21%阿維·螺螨酯和15%噠螨靈的防治效果更好。生產(chǎn)中可以將這2 種化學(xué)農(nóng)藥交替使用，防止冷杉納氏癭螨產(chǎn)生抗藥性。另外，本研究選擇在香榧果實(shí)采收后施藥，避免了化學(xué)農(nóng)藥對(duì)香榧果實(shí)的污染，保障了可食用林產(chǎn)品的品質(zhì)。

加州新小綏螨對(duì)冷杉納氏癭螨的卵、若螨和成螨均具有捕食功能，其在林間的防治效果為55.93%。生產(chǎn)中應(yīng)將加州新小綏螨與化學(xué)農(nóng)藥聯(lián)合使用，先施用化學(xué)農(nóng)藥降低冷杉納氏癭螨的蟲口密度，然后再釋放加州新小綏螨，利用捕食螨主動(dòng)搜尋獵物的功能，將葉片上殘存的害螨清除掉，從而達(dá)到高效防控冷杉納氏癭螨的目的。

致謝：本研究中癭螨物種的形態(tài)學(xué)鑒定得到廣西大學(xué)王國(guó)全教授和貴州大學(xué)乙天慈教授的幫助，謹(jǐn)此致謝。