蜜蜂遺傳育種新技術(shù)（二）
——分子遺傳標(biāo)記

薛運(yùn)波│文

分子標(biāo)記技術(shù)以其共顯性、多態(tài)性和準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的遺傳學(xué)研究，常用的分子標(biāo)記包括以分子雜交為基礎(chǔ)的RFLP標(biāo)記和ISH標(biāo)記，以簡單重復(fù)序列為基礎(chǔ)的SSR標(biāo)記、ISSR標(biāo)記，以PCR為基礎(chǔ)的RAPD標(biāo)記、AFLP標(biāo)記和InDel標(biāo)記，以單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)的SNP標(biāo)記等。這里簡單介紹幾種常用的分子標(biāo)記技術(shù)：

1.RFLP標(biāo)記

限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）是發(fā)展最早的分子標(biāo)記技術(shù)。RFLP技術(shù)的原理是檢測(cè)DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，凡是可以引起酶切位點(diǎn)變異的突變?nèi)琰c(diǎn)突變和一段DNA的重新組織等均可導(dǎo)致RFLP的產(chǎn)生。此技術(shù)及其從中發(fā)展起來的一些變型均包括以下基本步驟：DNA的提取、限制性內(nèi)切酶酶切、凝膠電泳分離、DNA片段轉(zhuǎn)移、特定DNA片段顯影和結(jié)果分析。

2.AFLP標(biāo)記

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）標(biāo)記技術(shù)較其他分子標(biāo)記有著明顯的優(yōu)越性，應(yīng)用廣泛。其原理是基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶充分酶切后，將特定的人工雙鏈接頭連在這些片段的兩端，形成帶接頭的特異片段，根據(jù)接頭序列和酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，對(duì)特異性模板片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，最后根據(jù)凝膠上DNA指紋的特點(diǎn)進(jìn)行分析。AFLP標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，是DNA指紋技術(shù)的重大突破，具有多重優(yōu)點(diǎn)：（1）AFLP分析所需DNA用量少；（2）AFLP技術(shù)能夠獲得更高的信息量；（3）試驗(yàn)重復(fù)性好，可信度高；（4）樣品適用性廣，基因組覆蓋面大；（5）AFLP標(biāo)記表現(xiàn)為典型的孟德爾方式遺傳；（6）AFLP可作為物理圖譜和遺傳圖譜的聯(lián)系橋梁；（7）AFLP分析，不需要預(yù)先知道擴(kuò)增基因組的序列特征等信息。

AFLP標(biāo)記技術(shù)最初用于植物的遺傳育種、種質(zhì)資源鑒定等，現(xiàn)已被大量用于動(dòng)植物和微生物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、醫(yī)療診斷、系統(tǒng)發(fā)育和分類等研究領(lǐng)域。隨著蜜蜂分子生物學(xué)研究的不斷深入和蜜蜂基因組全序列的測(cè)定完成，AFLP分子標(biāo)記技術(shù)也在蜜蜂學(xué)研究中初步應(yīng)用，主要在以下幾個(gè)方面：（1）種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性分析；（2）遺傳圖譜構(gòu)建；（3）基因定位；（4）標(biāo)記輔助選擇育種；（5）蜜蜂疾病檢測(cè)等。

3.SSR標(biāo)記

簡單重復(fù)序列（SSR）也叫微衛(wèi)星序列，是由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz等建立的一種以簡單重復(fù)序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記?；赟SR的分子標(biāo)記技術(shù)具有其自身獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：（1）SSR在生物的基因組中普遍存在，能夠?qū)Χ喾N基因所表現(xiàn)出的多態(tài)性進(jìn)行分析；（2）多種等位形式一般可共存于一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)；（3）SSR標(biāo)記是共顯性的，便于對(duì)隱形基因的選擇；（4）微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)操作簡單，重復(fù)性好，結(jié)果可靠，在DNA量較少的情況下也能完成檢測(cè)。SSR標(biāo)記技術(shù)的缺點(diǎn)是試驗(yàn)流程復(fù)雜，消耗時(shí)間。

4.ISSR標(biāo)記

微衛(wèi)星（SSR）在真核基因組中無處不在，SSR標(biāo)記的開發(fā)存在一個(gè)主要的瓶頸，即側(cè)鏈序列5′端錨定引物必須是已知的。1994年，Zietkiewicz等基于SSR又開發(fā)簡單序列間重復(fù)序列（ISSR）。ISSR分子標(biāo)記具有簡單，快速，可靠并具有更高水平的DNA多態(tài)性的優(yōu)勢(shì)，被用作遺傳研究的新分子標(biāo)記（圖1）。ISSR分子標(biāo)記是基于SSR，利用SSR自身來設(shè)計(jì)引物。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)無需序列知識(shí)，是以重復(fù)序列為基礎(chǔ)的引物。在PCR反應(yīng)中，在SSR的3′端或5′端錨定1～4個(gè)核苷酸，使特定位點(diǎn)發(fā)生退火反應(yīng)并對(duì)反向排列SSR間的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后進(jìn)行電泳、染色，從而分析不同樣品間ISSR標(biāo)記的多態(tài)性。與其他分子標(biāo)記相比較，ISSR標(biāo)記具有操作簡單、安全性高、成本低、模板DNA的用量少、無需測(cè)序和引物設(shè)計(jì)、多態(tài)性豐富、易操作、穩(wěn)定性強(qiáng)、快捷方便以及適用廣泛等諸多優(yōu)勢(shì)。ISSR分子標(biāo)記的不足之處是PCR擴(kuò)增時(shí)的最佳反應(yīng)條件的摸索過程比較艱難，另外，ISSR分子標(biāo)記呈孟德爾式遺傳（顯性遺傳標(biāo)記），并且只是部分共顯性，因此不能有效區(qū)別檢測(cè)位點(diǎn)的顯性純合基因型和雜合基因型。

圖1 用于ISSR分子標(biāo)記的熒光定量PCR設(shè)備

5.SNP標(biāo)記

單核苷酸多態(tài)性（SNP）是指生物基因組上某個(gè)位點(diǎn)存在單個(gè)堿基的變化，包括單個(gè)堿基對(duì)的插入、缺失、轉(zhuǎn)換、顛換等。SNP作為基因組中最廣泛、分布頻率最高的遺傳標(biāo)記，具有密度高、遺傳穩(wěn)定性高和易于自動(dòng)化分析等特點(diǎn)。SNP標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展不斷地推陳出新，包括以單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（CAPS）等基于凝膠電泳技術(shù)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法，以焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing）、微測(cè)序（SNaPshot）等的直接測(cè)序法，以及高分辨率熔解曲線分析技術(shù)（HRM）等新興檢測(cè)技術(shù)。隨著新一代DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展（圖2），用于檢測(cè)SNP的DNA芯片技術(shù)也迅速興起，DNA芯片技術(shù)容易實(shí)現(xiàn)SNP高通量、自動(dòng)化檢測(cè)，已經(jīng)發(fā)展成為非常理想的SNP檢測(cè)技術(shù)。以SNP為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)被認(rèn)為是繼RFLP、RAPD、SSR之后的新一代分子標(biāo)記技術(shù)，因?yàn)槠淇梢詸z測(cè)出基因組DNA上每個(gè)堿基對(duì)的變化，對(duì)生命科學(xué)領(lǐng)域起到重要作用，特別是在動(dòng)物遺傳育種領(lǐng)域的作用也日益凸顯，應(yīng)用前景十分廣闊。

圖2 第三代基因測(cè)序設(shè)備