何首烏及首烏藤中二蒽酮類成分研究進(jìn)展△

楊建波，汪祺a，高慧宇，王雪婷，宋云飛，王瑩，程顯隆，魏鋒*，靳洪濤，段寶忠，馬雙成*

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所，北京 100050；3.大理大學(xué) 藥學(xué)院，云南 大理 671000

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根，為著名傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，有生和制何首烏之分，生何首烏具有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便等功效；制何首烏具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨等功效[1]183-184。首烏藤，別名夜交藤，為何首烏的干燥藤莖，秋、冬二季采割，除去殘葉，捆成把或趁鮮切段，干燥，具有養(yǎng)血安神、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，可用于治療失眠多夢(mèng)、血虛身痛、風(fēng)濕痹痛和皮膚瘙癢等[1]277-278。何首烏和首烏藤均為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，其中何首烏為傳統(tǒng)中草藥的“四大仙草”之一，被廣泛應(yīng)用于治療烏發(fā)及脫發(fā)、補(bǔ)肝腎和調(diào)血脂的中藥制劑和保健食品之中[2]。文獻(xiàn)報(bào)道[3-12]，何首烏和首烏藤中主要含有蒽醌類（單核蒽醌和雙核蒽醌）、二苯乙烯類、黃酮類和多酚類等成分。但是，近年來(lái)關(guān)于服用何首烏、首烏藤及其相關(guān)制劑所引發(fā)的肝損傷不良反應(yīng)報(bào)道較多，已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外科研人員的高度關(guān)注[13-14]。

本課題組首次從何首烏中分離得到雙核蒽醌，即二蒽酮類成分，藥理研究結(jié)果顯示其也具有一定的肝毒性[15-17]，提示其可能與何首烏造成肝損傷有一定的相關(guān)性。因此，本文對(duì)何首烏及首烏藤中二蒽酮類成分的提取分離、在線鑒別、安全性評(píng)價(jià)和含量測(cè)定等方面進(jìn)行系統(tǒng)的綜述，為該類成分肝毒性的進(jìn)一步研究提供參考。

1 二蒽酮類成分的提取分離

本課題組采用大孔吸附樹(shù)脂（DM-8 型）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS）、Sephadex LH-20、MCI和半制備液相等多種色譜技術(shù)，對(duì)何首烏70%乙醇提取物進(jìn)行了系統(tǒng)的分離和純化，從中首次分離得到14 個(gè)二蒽酮類成分[6-8]，分別為反式-大黃素-大黃素二蒽酮（1）、順式-大黃素-大黃素二蒽酮（2）、polygonumnolide A1（3）、polygonumnolide A2（4）、polygonumnolide A3（5）、polygonumnolide A4（6）、polygonumnolide B1（7）、polygonumnolide B2（8）、polygonumnolide B3（9）、polygonumnolide C1（10）、polygonumnolide C2（11）、polygonumnolide C3（12）、polygonumnolide C4（13）和polygonumnolide E（14）。薄瑞[18]采用水浴回流提取法對(duì)首烏藤中的二蒽酮類成分進(jìn)行提取，獲得70%乙醇提取物；采用D101型大孔吸附樹(shù)脂法對(duì)首烏藤70%乙醇提取物中的二蒽酮進(jìn)行了選擇性富集；利用正、反相硅膠和半制備液相等多種色譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的分離和純化，從中首次分離得到2 個(gè)二蒽酮苷類成分，分別為PMC-a-1（15）與PMC-a-2（16）。

目前，從何首烏及首烏藤中所分離得到16 個(gè)二蒽酮類成分主要為大黃素-大黃素型二蒽酮和大黃素-大黃素甲醚型二蒽酮，是通過(guò)大黃素的C-10和大黃素甲醚的C-10相互聚合而成，具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 何首烏和首烏藤中分離得到的二蒽酮單體化合物

2 二蒽酮類成分的在線鑒別

Xu 等[19]運(yùn)用高效液相色譜-線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜法（HPLC-LTQ-Orbitrap MS）對(duì)廣東德慶產(chǎn)區(qū)何首烏的70%乙醇提取液進(jìn)行分析，通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜的準(zhǔn)分子離子峰和多級(jí)質(zhì)譜碎片信息推測(cè)出28 個(gè)新的二蒽酮苷類成分，其苷元為大黃素（10→10′）大黃素型二蒽酮（Ⅰ）和大黃素（10→10′）大黃素甲醚型二蒽酮（Ⅱ），其中取代基主要為甲氧基、葡萄糖苷和丙二?；钠咸烟擒盏?。Yang等[20]通過(guò)70%乙醇提取、DM-8型大孔吸附樹(shù)脂純化和Sephadex LH-20 凝膠柱色譜富集等方法富集得到何首烏中微量成分二蒽酮類成分，并進(jìn)一步運(yùn)用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法（HPLC-UV-FTICR-MS）對(duì)該組分和分離得到的7個(gè)二蒽酮對(duì)照品順式-大黃素-大黃素二蒽酮（2）、polygonumnolide A1（3）、polygonumnolide A2（4）、polygonumnolide B1（7）、polygonumnolide C2（11）、polygonumnolide C3（12）和polygonumnolide E（14）進(jìn)行一級(jí)高分辨質(zhì)譜和多級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果表明何首烏中存在45個(gè)二蒽酮類成分，其中30個(gè)二蒽酮苷類成分可能為新化合物，主要分為3 種結(jié)構(gòu)類型，分別為大黃素-大黃素型二蒽酮（Ⅰ）、大黃素-大黃素甲醚型二蒽酮（Ⅱ）及大黃素甲醚-大黃素甲醚型二蒽酮（Ⅲ），其差異主要是取代基和C-10/10′的手型中心構(gòu)型不同，具體見(jiàn)圖2。

圖2 何首烏和首烏藤中不同類型二蒽酮類成分及其不同取代基類型

薄瑞[18]采用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF-MS/MS）對(duì)富集得到的首烏藤70%乙醇提取物中的二蒽酮類成分進(jìn)行定性分析，首次從首烏藤中推測(cè)出72 個(gè)二蒽酮苷類成分和5個(gè)二蒽酮苷元成分，主要也分為3種結(jié)構(gòu)類型，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中有29 個(gè)二蒽酮苷類成分可能為新化合物。

3 二蒽酮類成分的毒性研究

3.1 不同細(xì)胞水平的毒性評(píng)價(jià)

Yang等[6]對(duì)從何首烏中分離得到polygonumnolides A1～A4、polygonumnolides B1～B3（3～9）7個(gè)二蒽酮化合物，進(jìn)行人口腔表皮癌細(xì)胞KB 的細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其半數(shù)抑制濃度（IC50）值分別為29.7、35.6、36.8、31.1、82.4、88.6、95.8 μmol·L-1，均表現(xiàn)中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒活性。Yang 等[7]對(duì)從何首烏中分離得到反式-大黃素-大黃素二蒽酮（1）、順式-大黃素-大黃素二蒽酮（2）和polygonumnolides C1～C4（10～13）6 個(gè)二蒽酮類化合物進(jìn)行人正常肝細(xì)胞L02的細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物10～13作用24 h對(duì)L02細(xì)胞的IC50值分別為313.05、205.20、294.20、207.35 μmol·L-1，表現(xiàn)中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒活性。Yang等[21]還對(duì)反式-大黃素-大黃素二蒽酮（1）和順式大黃素-大黃素二蒽酮（2）進(jìn)行人肝癌細(xì)胞HepaRG 的細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其IC50值分別為10.98、15.45 μmol·L-1。薄瑞[18]對(duì)從首烏藤分離得到的PMC-a-1（15）進(jìn)行L02、HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有中等強(qiáng)度的抑制作用，作用48 h 的IC50值分別為45.25、72.78 μmol·L-1；PMC-a-2 未對(duì)HepG2 細(xì)胞表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制活性，而對(duì)L02細(xì)胞表現(xiàn)一定的細(xì)胞毒活性，作用48 h的IC50值為61.11 μmol·L-1，從而提示二蒽酮類成分可能是何首烏產(chǎn)生肝毒性的組分之一。

3.2 酶水平的抑制作用

膽紅素的異常代謝也是何首烏的臨床不良反應(yīng)之一。由于尿苷二磷酸（UDP）-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1（UGT1A1）是唯一負(fù)責(zé)膽紅素代謝的酶，因此Wang 等[17]研究了二蒽酮化合物對(duì)大鼠肝微粒體中UGT1A1的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反式-大黃素-大黃素二蒽酮（1）、順式-大黃素-大黃素二蒽酮（2）和polygonumnolide C2（11）均具有肝微粒體酶的抑制活性，表觀抑制常數(shù)（Ki）值分別為0.863、1.083、4.291 μmol·L-1，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)二蒽酮類化合物的6/6′位羥基為其潛在的活性基團(tuán)。汪祺等[22]運(yùn)用分子對(duì)接等技術(shù)對(duì)何首烏中分離得到的16 個(gè)二蒽酮類成分進(jìn)行了毒性預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些二蒽酮類成分的大鼠經(jīng)口服給藥的半數(shù)致死量（LD50）為125.3～1 239.6 mg·kg-1，從而提示該類成分可能具有潛在的肝毒性。

3.3 模式生物斑馬魚(yú)的毒性評(píng)價(jià)

Yang 等[15]以斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育為評(píng)價(jià)模型，將受精后2～4 h（2～4 hpf）的斑馬魚(yú)胚胎暴露于反式-大黃素-大黃素二蒽酮（1）、順式-大黃素-大黃素二蒽酮（2）和polygonumnolides C1～C4（10～13）等二蒽酮類化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其96 hpf 的LD50值分別為（0.87±0.27）、（0.92±0.37）、（1.13±0.06）、（1.55±0.49）、（14.31±0.00）、（1.73±0.33）mg·L-1，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)化合物1、2、10、11和13所觀察到最低作用劑量（LOEL）分別為0.500、0.500、0.250、2.000、2.000 mg·L-1，表明該類成分具有一定的斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育毒性。Li 等[16]采用斑馬魚(yú)肝毒性評(píng)價(jià)模型，以斑馬魚(yú)肝區(qū)面積、肝區(qū)灰度值和卵黃囊的吸收面積等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)從何首烏中分離得到的反式-大黃素-大黃素二蒽酮（1）、順式-大黃素-大黃素二蒽酮（2）、polygonumnolide C1（10）和polygonumnolide C4（13）進(jìn)行肝毒性評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)游離二蒽酮較結(jié)合二蒽酮具有更強(qiáng)的肝毒性，推測(cè)二蒽酮類成分可能是何首烏潛在誘發(fā)肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

4 二蒽酮類成分的含量分析

Yang 等[21]運(yùn)用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法（UHPLC-QQQ-MS/MS）對(duì)從不同產(chǎn)地和市場(chǎng)收集的90 批生何首烏中6 個(gè)二蒽酮類成分polygonumnolide C4（13）、polygonumnolide C3（12）、polygonumnolide C1（10）、polygonumnolide C2（11）、反式-大黃素-大黃素二蒽酮（1）和順式-大黃素-大黃素二蒽酮（2）的含量進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，何首烏中二蒽酮類成分含量差異較大，6 個(gè)二蒽酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.03～19.04、0.02～13.86、0.07～15.53、0.034～23.35、0.38～83.67、0.29～67.00 μg·g-1。選擇其中15 批何首烏樣品，按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版制何首烏項(xiàng)下“清蒸工藝”進(jìn)行炮制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)24 h炮制后何首烏中6 個(gè)二蒽酮類成分的含量下降幅度均超過(guò)80%，表明合理和規(guī)范炮制的制何首烏中二蒽酮類成分含量大幅下降。對(duì)從市場(chǎng)收集的86 批制首烏中6個(gè)二蒽酮類成分含量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.02～13.03、0.05～8.94、0.02～7.23、0.03～12.75、0.10～28.54、0.14～27.79 μg·g-1。如果以炮制24 h 制何首烏中6 個(gè)二蒽酮類成分的含量來(lái)分析市場(chǎng)中制何首烏的質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)65%以上市場(chǎng)中銷售的制何首烏可能存在炮制不規(guī)范的問(wèn)題，需要進(jìn)一步深入調(diào)查與研究。

薄瑞[18]發(fā)現(xiàn)首烏藤中所存在的72 個(gè)二蒽酮苷類成分主要分為3 種類型，其中大黃素-大黃素二蒽酮和大黃素-大黃素甲醚二蒽酮具有m/z254、416、458的特征離子，而大黃素甲醚-大黃素甲醚二蒽酮具有m/z268、537 的特征離子，運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS/MS，以半定量的方式初步評(píng)價(jià)了首烏藤中各類型的二蒽酮的相對(duì)含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在首烏藤中Ⅰ和Ⅱ型的二蒽酮類成分的含量占比相對(duì)較高，分別為54.69%和41.58%，而Ⅲ型的二蒽酮類成分的含量占比較低，為3.73%。

5 討論

何首烏及首烏藤中二蒽酮類成分主要為2 個(gè)分子大黃素和/或大黃素甲醚蒽酮通過(guò)蒽環(huán)碳原子連接而成的化合物，主要通過(guò)C-10 和C-10′中位連接，多以單鍵連接。本課題組通過(guò)傳統(tǒng)的提取分離與純化技術(shù)首次從何首烏中分離得到二蒽酮類成分，并對(duì)其進(jìn)行了L02、HepG2、HepRG 等細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)及UGT1A1 酶、模式生物斑馬魚(yú)等毒性評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該類成分具有潛在的肝毒性，可能為何首烏中肝毒性組分之一。然而該類成分為何首烏及首烏藤中微量成分，具有數(shù)量多和單一成分含量低等特點(diǎn)，所以通過(guò)傳統(tǒng)的提取與分離獲得較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，故有必要對(duì)其開(kāi)展全合成研究，解決樣品量不足的問(wèn)題。目前，對(duì)何首烏及首烏藤中二蒽酮類成分的毒性評(píng)價(jià)主要集中在體外細(xì)胞和模式生物斑馬魚(yú)模型，這些模型與哺乳動(dòng)物模型存在一定的差異，所以有必要對(duì)其進(jìn)行小鼠急性毒性與大鼠長(zhǎng)期毒性評(píng)價(jià)等實(shí)驗(yàn)，有助于進(jìn)一步系統(tǒng)地闡明該類成分的肝毒性。

與此同時(shí)，二蒽酮類成分還廣泛存在于蓼科植物大黃、豆科植物番瀉葉和藤黃科植物貫葉連翹中，該類成分還具有較好的瀉下作用[23]，且具有抗腫瘤[24]、抗病毒[25]和抗抑郁[26]等活性，所以有必要對(duì)何首烏及首烏藤中的二蒽酮類成分進(jìn)行系統(tǒng)的提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定，進(jìn)一步對(duì)其有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而有助于評(píng)價(jià)含二蒽酮類成分中藥的安全性與有效性，為臨床安全、合理用藥提供參考。