基于小分子化合物庫篩選協(xié)同多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑殺傷卵巢癌細(xì)胞的藥物

李含笑， 李小滿， 羅業(yè)飛， 王嘉東

(北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)系，系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究所，北京 100191)

全球每年約有24萬例新的卵巢癌病例被確診，盡管采取了手術(shù)和鉑類藥物化療這兩種目前常用的治療手段，但是仍然有超過15萬名女性死于該疾病，因此迫切需要找到新的治療手段[1]。近年，隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的迅速發(fā)展，卵巢癌的腫瘤異質(zhì)性已經(jīng)逐漸被人們熟知，這就為靶向治療的應(yīng)用提供了依據(jù)。目前，已知的參與DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)的同源重組修復(fù)(homologous recombination repair，HRR)蛋白乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)和 乳腺癌易感基因2(breast cancer susceptibility gene 2，BRCA2)，在卵巢癌中占有較高的比例，大約有50%的高級別漿液性卵巢癌患者帶有HRR的缺陷[2]。根據(jù)Gao等人對中國卵巢癌胚系BRCA基因變異圖譜的分析，中國卵巢癌的整體人群突變率為21.79%，這一數(shù)字遠(yuǎn)高于國外卵巢癌的BRCA基因突變發(fā)生率(13%)[3]。它們的突變可以導(dǎo)致細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性的增加，從而導(dǎo)致一些抑癌基因的激活或者染色體的融合、雜合缺失等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致BRCA基因突變攜帶者患癌風(fēng)險顯著增加[4]。

HRR 功能缺陷的細(xì)胞對鉑類藥物和新開發(fā)的 PARP 抑制劑都具有敏感性[5]。HRR 功能缺陷的細(xì)胞對PARP抑制劑敏感性增加的現(xiàn)象是經(jīng)典的“合成致死”效應(yīng)。2014年，奧拉帕尼(olaparib)成為第一個被批準(zhǔn)用于治療癌癥的PARP抑制劑[6]。當(dāng)PARP 抑制劑單用時，可通過合成致死選擇性地靶向具有BRCA1 或BRCA2基因突變的腫瘤細(xì)胞。然而，當(dāng)與其他治療藥物一起使用時，PARP 抑制劑也顯示出相當(dāng)大的應(yīng)用前景。3種PARP抑制劑被批準(zhǔn)用于治療卵巢癌：Olaparib[7]、盧卡帕尼(rucaparib)[8]和Niraparib[9]。PARP抑制劑現(xiàn)在也進(jìn)入一線卵巢癌的治療研究，尤其是最新開發(fā)出來的PARP抑制劑Niraparib，其不僅對HRR缺陷的卵巢癌病人有較好的治療作用，而且對HRR陽性的卵巢癌患者具有良好的治療作用[10]。其他HR修復(fù)能力正常的卵巢癌患者通常對單一的PARP抑制劑表現(xiàn)出不敏感。此外，有些細(xì)胞會對PARP抑制劑產(chǎn)生耐藥，例如離子泵相關(guān)蛋白質(zhì)的高表達(dá)導(dǎo)致藥物外流增加[11]、PARP1 捕獲能力的下降[12]、HRR功能的恢復(fù)[13]和復(fù)制叉穩(wěn)定性的增加[14,15]等。因此，這些患者代表了一個相當(dāng)大的群體，其臨床需求尚未得到滿足。

將 PARP抑制劑與能夠降低 HR修復(fù)的藥物相結(jié)合可能會使這些 HR修復(fù)能力正常的卵巢癌人群變得敏感[16]。HR修復(fù)通路是一種多成分途徑，據(jù)報道，一些靶向該途徑成分的藥物可能會抑制 HR修復(fù)。目前，已經(jīng)有許多藥物聯(lián)合使用治療腫瘤的成功案例[17-19]，其中一些可以誘導(dǎo) HR缺陷的表型，從而使癌癥患者對 PARP抑制劑敏感。因此，有必要尋找新的與PARP抑制劑具備協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞作用的新藥物，從而為臨床治療卵巢癌等腫瘤提供臨床前的參考依據(jù)。本文通過對379種抗腫瘤小分子化合物進(jìn)行初步篩選，最終獲得8個潛在的與PARP抑制劑具有協(xié)同殺傷作用的小分子化合物，本文對其中的TrKA激酶抑制劑與PARP抑制劑協(xié)同殺死卵巢癌細(xì)胞的分子機(jī)制進(jìn)行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體

379種抗腫瘤活性小分子化合物購自Selleck公司，PARP抑制劑Niraparib由再鼎醫(yī)藥(上海)有限公司提供，其他常規(guī)化學(xué)試劑均購自北京通廣有限公司。γH2AX抗體(2577 S)購自Cell Signaling Technology公司，RAD51抗體由浙江大學(xué)黃俊教授提供，53BP1抗體(612522)購自BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、OVCAR-8，人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116, 人宮頸癌細(xì)胞系HeLa，人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS均為本實驗室傳代培養(yǎng)，使用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素雙抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2濃度。

1.3 CCK8檢測

每組細(xì)胞6個復(fù)孔，3個復(fù)孔作為0 h時間點的A測量值，3個復(fù)孔作為96 h時間點A測量值；加入10 μL CCK8；培養(yǎng)2 h，測定A450吸光度值，作為0 h時間點值；剩下的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)96 h，再加入10 μL CCK8，孵育2 h，測定A450吸光度值，作為96 h時間點值。之后分析合成致死的結(jié)果，利用CalcuSyn軟件中的Chou-Talalay方程計算2種化合物的藥物聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)，該方程考慮了半數(shù)抑制濃度(median inhibition concentration，IC50)和劑量-效應(yīng)曲線的形狀[20]。CI<1表示協(xié)同作用，CI=1表示加和作用，CI>1表示拮抗作用。

1.4 考馬斯亮藍(lán)染色檢測細(xì)胞增殖

按照Zamoner 等人的方法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測[21]。SKOV3卵巢癌細(xì)胞以1×105個/mL細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿，在藥物處理前2 h更換培養(yǎng)基。處理分為4組：DMSO處理組，2.25 μmol/L的Niraparib處理組，6.3 μmol/L的TrKA抑制劑GW441756 處理組以及2種藥物的聯(lián)合處理組。之后每隔24 h用考馬斯亮藍(lán)染色觀察細(xì)胞的生長情況，并拍照留存。

1.5 免疫熒光分析

為了檢測DNA損傷修復(fù)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位變化，本文在不同處理條件下使用免疫熒光檢測細(xì)胞的損傷或者修復(fù)情況。具體如下：在35 mm鋪有蓋玻片的細(xì)胞皿中鋪板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到30%～40%時進(jìn)行相應(yīng)的處理；吸掉培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，加入預(yù)冷的4%多聚甲醛，固定15 min；PBS洗滌細(xì)胞3次，加入1 mL終濃度為0.25%的Triton 100處理5 min；PBS洗滌3次，加入1 mL 終濃度為2%的BSA室溫封閉5 min；加入一抗(2% BSA稀釋)，室溫孵育1 h；PBS洗滌細(xì)胞3次，加入二抗(2% BSA稀釋)，室溫避光孵育30 min；PBS洗滌細(xì)胞3次，加入DAPI(1∶10 000，PBS稀釋)染核5 min；PBS洗滌細(xì)胞3次，封片劑封片，共聚焦顯微鏡下分析結(jié)果。統(tǒng)計每個細(xì)胞中 γH2AX 和 RAD51 foci的數(shù)量，并使用 GraphPad Prism繪制數(shù)據(jù)。

1.6 克隆形成實驗

將細(xì)胞梯度稀釋至密度為1 200個/mL；鋪板，每個6 cm培養(yǎng)皿加入1 mL梯度稀釋好的細(xì)胞，再補(bǔ)加3 mL新鮮培養(yǎng)基，振蕩使細(xì)胞分布均勻，培養(yǎng)8～12 h；分為DMSO處理組，GW441756處理組(處理48 h后更換新鮮培養(yǎng)基)，Niraparib處理組(處理24 h后更換新鮮培養(yǎng)基)，以及聯(lián)合處理組(先用含有GW441756的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，再加入Niraparib 培養(yǎng)24 h，最后用僅含有GW441756的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h)?？偣才囵B(yǎng)10～14 d后棄掉培養(yǎng)基，考馬斯亮藍(lán)染色30 min，清水脫色，晾干，拍照及統(tǒng)計克隆數(shù)，相對存活率=處理組實驗細(xì)胞克隆數(shù)/非處理組實驗細(xì)胞克隆數(shù)×100%。

1.7 彗星電泳檢測

取180 μL(質(zhì)量體積比為0.5%)的瓊脂糖液均勻滴加到載玻片上，加蓋玻片，4 ℃放置10 min待瓊脂糖膠凝固后取下蓋玻片；將一定量的單細(xì)胞懸液與1%的低熔點瓊脂糖等體積混合后加到瓊脂糖墊上；加上蓋玻片，4 ℃放置10 min，待瓊脂糖膠凝固；將制備好的凝膠載玻片平放于平皿中，去掉蓋玻片，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(2.5 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA-2Na，10 mmol/L Tris-HCl，pH=10.0，10% DMSO，1% Triton X-100)，4 ℃裂解過夜；用雙蒸水洗滌1次；加入新配制的電泳緩沖液(300 mmol/L NaOH，1 mmol/L EDTA-2Na，pH=13.0)，平衡0.5～1 h；之后用20 V，200 mA，低溫條件下電泳30 min；將載玻片用中和液(0.4 mol/L Tris-HCL，pH=7.50)中和2次，每次15 min; 滴加100 μL PI避光染色10 min；PBS洗滌載玻片1次，熒光顯微鏡下拍照，用Image J軟件統(tǒng)計尾部運動的長度。

1.8 放射線照射實驗

提前8～12 h進(jìn)行細(xì)胞鋪板，將細(xì)胞放入X射線輻射儀中，設(shè)置輻射劑量，進(jìn)行照射，照射完成后根據(jù)實驗?zāi)康氖占?xì)胞或繼續(xù)培養(yǎng)所需時間。

1.9 臨床數(shù)據(jù)分析

使用TCGA數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)分析神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體1(neurotrophic receptor tyrosine kinase 1，NTRK1)基因(TrKA蛋白激酶的編碼基因)在卵巢癌病人的遺傳變異類型；使用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)在蛋白質(zhì)水平上分析TrKA在正常卵巢組織和卵巢癌組織中的表達(dá)情況。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 8種小分子化合物與多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑Niraparib在卵巢癌細(xì)胞中具有合成致死效應(yīng)

為了能夠找到與PARP抑制劑具有合成致死效應(yīng)的小分子抑制劑，本文在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中使用了PARP抑制劑Niraparib與379種小分子化合物進(jìn)行聯(lián)合用藥篩選(Fig.1A)，這些小分子化合物包括激酶抑制劑、天然產(chǎn)物等。利用CCK8實驗將這些小分子化合物與Niraparib進(jìn)行聯(lián)合用藥篩選，初步篩選所用的Niraparib的藥物濃度為2.5 μmol/L, 小分子化合物的藥物濃度為10 μmol/L。最終篩選獲得8種目標(biāo)小分子化合物，它們與Niraparib聯(lián)用對SKOV3細(xì)胞的殺傷作用顯著高于DMSO處理組和單獨使用藥物處理組(*P<0.05，**P<0.01)。因此，這8種小分子化合物是與PARP抑制劑具有潛在合成致死效應(yīng)的小分子化合物(Fig.1B-I)。

Fig.1 Cell viability screens to identify compounds that synergize with Niraparib in SKOV3 cells (A)Screening strategies used to measure synergy of Niraparib with drugs from the small molecular compound library.Plates were seeded(5 000 cells/well)and treated the next day with Niraparib or DMSO.Drugs from the compound library were added on the following day.After SKOV3 cells were treated with compounds(10 μmol/L)and Niraparib(2.5 μmol/L)for 96 hours, the cell viability was analyzed by a CCK-8 kit.Combined with Niraparib, eight compounds(STF-118804(B), Disulfiram(C), GW441756(D), SPHINX31(E), GGTI 298 TFA salt(F), TH302(G), Demethylnobiletin(H), Diosmetin(I))with lethal synthetic effect were screened among 379 small molecule compounds.These results were repeated at least three times.*P<0.05，** P<0.01

為了進(jìn)一步明確這8種小分子化合物與Niraparib是否具有協(xié)同作用，本文通過設(shè)計濃度梯度實驗，檢測不同藥物濃度處理后細(xì)胞的存活能力，并計算CI值。結(jié)果顯示，在一定藥物濃度范圍內(nèi)，這8種小分子化合物與Niraparib聯(lián)用能顯著降低細(xì)胞的存活能力(*P<0.05)，并且均具有協(xié)同效應(yīng)(CI<1)(Fig.2A-2P)。其中乙醛脫氫酶抑制劑(disulfiram)(Fig 2A, B)、煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶抑制劑(STF-118804)(Fig.2C, D)此前被報道過與PARP抑制劑具有聯(lián)用效果，佐證了篩選體系的有效性。香葉木素(diosmetin)(Fig.2E, F)和去甲基川陳皮素(demethylnobiletin)(Fig.2G, H)為天然產(chǎn)物，目前的作用靶點尚不明確。GGTI 298 TFA salt(Fig.2I, J)為牛兒基轉(zhuǎn)移酶I(geranylgeranyltransferase I)抑制劑，有文獻(xiàn)報道，其可以將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]。SPHINX31(Fig 2K和2L)為絲氨酸/精氨酸蛋白激酶1(serine/arginine protein kinase 1, SRPK1)的抑制劑。SRPK1磷酸化富含絲氨酸/精氨酸重復(fù)序列的剪接因子，是可變剪接的主要調(diào)控因子。SRPK1的過表達(dá)已在多種癌癥類型中被發(fā)現(xiàn)，并有助于癌癥的發(fā)展。Li等人的研究表明，SRPK1通過調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞中的小核仁RNA表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[23]。TH-302(Fig.2M, 2N)為選擇性低氧激活的前體藥物，靶向?qū)嶓w瘤的低氧區(qū)域。但是不幸的是默克制藥公司宣布抗腫瘤藥TH-302 III期臨床試驗失敗[24]。TrKA(Fig.2O, P)在不同神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞存活、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用。以往對其他類型實體瘤的研究表明，阻斷TrKA可產(chǎn)生抗腫瘤作用[25]。盡管有文獻(xiàn)報道TrKA在卵巢癌中也有過表達(dá)的情況，但是TrKA在卵巢癌的發(fā)生和進(jìn)展中的作用以及其抑制劑的使用尚未被完全揭示[26]，因此，本文選擇TrKA的抑制劑作為后續(xù)的研究重點。

Fig.2 Eight drugs enhanced the chemosensitivity of ovarian cancer cells to Niraparib SKOV3 cells were treated with Niraparib and/or the eight compounds for 96 hours.The cell viability rate was determined by CCK-8 assays.The experiments were repeated three times independently.CI was calculated using CalcuSyn software with the Chou-Talalay equation.CI values reflect the sign and magnitude of drug-drug interaction.CI<1, CI=1, and CI>1 represent synergism, additivity, and antagonism, respectively.These results were repeated at least three times.*P<0.05.The eight drugs, Disulfiram(A-B), STF-118804(C-D), Diosmetin(E-F), Demethylnobiletib(G-H), GGTI 298 TFA salt(I-J), SPHINX31(K-L), TH-302(M-N), GW441756(O-P)and Niraparib have synthetic lethal effects in ovarian cancer cells, respectively

2.2 TrKA在卵巢癌組織中高表達(dá)

為了分析NTRK1在卵巢癌病人中的遺傳變異情況，本文分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中不同機(jī)構(gòu)收集的卵巢癌病人測序數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，在所有NTRK1基因的遺傳變異類型中，擴(kuò)增為最多的遺傳變異類型(Fig.3A, B)。為了考察TrKA蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，本文通過生物數(shù)據(jù)庫分析了TrKA在正常卵巢組織和卵巢癌組織中的表達(dá)情況。腫瘤組織及正常組織的免疫組化結(jié)果顯示，TrKA蛋白在卵巢癌組織中表達(dá)增高(Fig.3C, D)。這個結(jié)果和前人的免疫組化結(jié)果一致[26,27]，這就表明TrKA在卵巢癌病人中的過表達(dá)是一個潛在的藥物靶點。

Fig.3 High expression of TrKA in ovarian cancer tissues (A)Analysis of NTRK1 genetic variation in tumor patients by cBioportal database;(B)Sequencing data from various institutional sources indicate that amplification is the most common type of alteration.Representative immunohistochemistry(IHC)images of TrKA proteins for normal ovarian(patient id: 2 344, C)and ovarian cancer(patient id: 2 568, D)samples from the Human Protein Atlas database(https://www.proteinatlas.org/)

2.3 進(jìn)一步證實TrKA抑制劑與多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑具有合成致死效應(yīng)

為了進(jìn)一步證實TrKA抑制劑與PARP抑制劑具有合成致死效應(yīng)，首先通過克隆存活實驗觀察聯(lián)合用藥的長期效果。結(jié)果表明，TrKA抑制劑在1～4 μmol/L的濃度范圍內(nèi)單獨用藥并不能有效的減少細(xì)胞存活，而PARP抑制劑Niraparib對細(xì)胞存活的影響具有劑量依賴性。GW441756的藥物濃度在1 μmol/L和4 μmol/L時，只要Niraparib的藥物濃度大于等于2 μmol/L，2種藥物聯(lián)合使用后，細(xì)胞的克隆存活率均顯著下降(*P<0.05，**P<0.01，F(xiàn)ig.4A, B)。

Fig.4 TrKA inhibitor and PARP inhibitor had synergistic lethal effects (A)Cells were plated and treated continuously with different concentrations of TrKA inhibitor in combination with Niraparib.After 10-21 days, colonies were stained and clonogenicity was determined.(B)Statistical analysis of colony formation experiments.Data are means ± SD.These results were repeated at least three times.*P<0.05，** P<0.01; Clony formation rates are presented as percentage relative to the control.(C)Inhibition effects of different treatments on cell proliferation was detected by Coomassie bright blue staining

本文也用考馬斯亮藍(lán)染色法檢測了細(xì)胞增殖抑制的情況。將細(xì)胞分為4組：即DMSO處理組，單獨2.25 μmol/L Niraparib處理組，單獨6.3 μmol/L TrKA抑制劑處理組和TrKA抑制劑與Niraparib聯(lián)合用藥組，每隔24 h染色觀察細(xì)胞的生長情況。相比于DMSO處理組，Niraparib和TrKA抑制劑單獨處理可以減慢細(xì)胞的增殖能力，而二者聯(lián)用能夠更加顯著地抑制細(xì)胞的增殖能力(Fig.4C)。綜上結(jié)果，TrKA抑制劑與PARP抑制劑聯(lián)合用藥具有合成致死效應(yīng)。

2.4 TrKA抑制劑與多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑在其他腫瘤細(xì)胞中具有合成致死效應(yīng)

為了排除由于細(xì)胞特異性導(dǎo)致GW441756與Niraparib具有合成致死效應(yīng)，本文在另外一株卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-8中進(jìn)行了驗證。結(jié)果表明，GW441756與Niraparib在卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-8中同樣具有合成致死效應(yīng)(**P<0.01，F(xiàn)ig.5A和5B)，此結(jié)果排除了細(xì)胞特異性影響。另外，為了驗證是否在其他類型的腫瘤細(xì)胞中也有合成致死效應(yīng)，本文也在人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS中進(jìn)行了驗證。結(jié)果表明，GW441756與Niraparib聯(lián)合用藥在這些腫瘤細(xì)胞中也具有較好的合成致死效應(yīng)(*P<0.05，F(xiàn)ig.5C-5H)。這就說明，GW441756與Niraparib的聯(lián)用在腫瘤細(xì)胞中可能存在廣譜的合成致死效應(yīng)。

Fig.5 Synergistic effects of PARP and TrKA inhibition are lineage-independent Representative drug response curves of combination therapy with Niraparib and GW441756 for 96 hours in OVCAR-8 cell(A-B), HCT116 cell(C-D), HeLa cell(E-F), and U2OS cell(G-H).CI was calculated using CalcuSyn software with the Chou-Talalay equation.CI values reflect the sign and magnitude of drug-drug interaction.These results were repeated at least three times.*P<0.05,**P<0.01

2.5 TrKA抑制劑不會直接對細(xì)胞造成DNA損傷

γH2AX焦點(foci)的多少可以反映DNA損傷斷裂程度及修復(fù)情況。為明確TrKA抑制劑是否會直接對細(xì)胞造成DNA損傷，使用4 μmol/L 的TrKA抑制劑處理SKOV3細(xì)胞24 h，免疫熒光染色觀察細(xì)胞核內(nèi)γH2AX foci的數(shù)目(Fig.6A)。結(jié)果表明，DMSO處理組和4 μmol/L的TrKA抑制劑處理組之間的γH2AX foci數(shù)目未見顯著差異(P>0.05, Fig.6B)。結(jié)果表明，TrKA抑制劑本身并不能直接對細(xì)胞的DNA造成損傷。

Fig.6 The TrKA inhibitor does not cause DNA damage(A)Immunofluorescence staining analysis of SKOV3 cells for γH2AX(green).DAPI(blue)was used to stain the nuclei.SKOV3 cells were treated with DMSO or GW441756(4 μmol/L)and immunostained with the indicated antibodies at 24 hour post treatment.Scale bar represents 10 μm in all images.(B)The quantified data of γH2AX foci are presented as mean ± SD.These results were repeated at least three times

2.6 TrKA抑制劑阻礙損傷后細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)

為了進(jìn)一步探究TrKA抑制劑和PARP抑制劑合成致死的機(jī)制，首先檢測了不同處理后細(xì)胞內(nèi)γH2AX foci的數(shù)目變化(Fig.7A)。第1組，單獨使用1 μmol/L 的Niraparib處理細(xì)胞24 h；第2組，1 μmol/L Niraparib聯(lián)合4 μmol/L TrKA抑制劑共同處理細(xì)胞24 h；第3組，單獨使用1 μmol/L Niraparib處理細(xì)胞24 h后，換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；第四組，1 μmol/L Niraparib聯(lián)合4 μmol/L TrKA抑制劑共同處理細(xì)胞24 h后，換含有TrKA抑制劑的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)果顯示，第2組與第1組相比，細(xì)胞內(nèi)γH2AX foci的數(shù)目未見顯著差異(P>0.05)，說明TrKA抑制劑未增加PARP抑制劑造成的DNA損傷。第3組與第1組相比，細(xì)胞內(nèi)γH2AX foci的數(shù)目顯著減少(**P<0.01)，說明細(xì)胞可以正常修復(fù)PARP抑制劑造成的DNA損傷。第4組與第3組相比，細(xì)胞內(nèi)γH2AX foci的數(shù)目顯著增多(*P<0.05，F(xiàn)ig.7B)，說明TrKA抑制劑阻礙了細(xì)胞對于PARP抑制劑造成的DNA損傷的修復(fù)。

Fig.7 The TrKA inhibitor weakens the DNA damage repair ability of cells after injury (A)SKOV3 cells were treated with 1 μmol/L Niraparib, 3 Gy or 10 Gy of IR, and immunostained with the indicated antibodies at 3 or 24 hours post exposure.(B-C)The quantified data of γH2AX foci are presented as mean ± SD.These results were repeated at least three times.*P<0.05

之后本文分4組進(jìn)行了電離輻射(ionizing radiation，IR)照射實驗：第1組，10 Gy X射線照射細(xì)胞，之后釋放3 h；第2組，4 μmol/L TrKA抑制劑預(yù)處理12 h，再用10 Gy X射線照射細(xì)胞，之后釋放3 h；第3組，3 Gy X射線照射細(xì)胞，之后釋放24 h；第4組，4 μmol/L TrKA抑制劑預(yù)處理12 h，再用3 Gy X射線照射細(xì)胞，之后釋放24 h。結(jié)果顯示，第2組與第1組相比，細(xì)胞內(nèi)γH2AX foci的數(shù)目未見顯著差異(P>0.05)，說明TrKA抑制劑未增加IR造成的DNA損傷。第3組與第1組相比，細(xì)胞內(nèi)γH2AX foci的數(shù)目顯著減少(**P<0.01)，表明細(xì)胞可以正常修復(fù)3 Gy X射線造成的DNA損傷。第4組與第3組相比，細(xì)胞內(nèi)γH2AX foci的數(shù)目顯著增多(*P<0.05, Fig.7C)，表明TrKA抑制劑阻礙了細(xì)胞對于X射線造成的DNA損傷的修復(fù)。

本文也使用了堿性彗星電泳實驗來觀察TrKA抑制劑和PARP抑制劑聯(lián)用后對細(xì)胞DNA損傷修復(fù)過程的影響。在SKOV3細(xì)胞中，單獨使用Niraparib處理24 h或者10 Gy X射線照射后3 h，細(xì)胞會產(chǎn)生明顯的拖尾現(xiàn)象(Fig.8A)，說明Niraparib和X射線對細(xì)胞造成了DNA損傷。單獨使用Niraparib處理后24 h或者3 Gy X射線照射后24 h，彗星尾部DNA的百分比顯著減少(*P<0.01，F(xiàn)ig.8B-8C)，表明細(xì)胞可以正常進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。而在聯(lián)合處理組，彗星尾部DNA的百分比相比單處理組顯著增加(*P<0.05，F(xiàn)ig.8B-8C)，證實了TrKA抑制劑會阻礙細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的過程。

Fig.8 The combination of TrKA inhibitors and PARP inhibitors retards the DNA damage repair ability of damaged cells(A)The levels of DNA damage were examined by comet assays using fluorescence microscopy.(B-C)Box-and-whisker plots of the percentage of DNA in the comet tail from comet assays of SKOV3 cells treated with Niraparib(1 μmol/L), GW441756(4 μmol/L)or IR(3 Gy or 10 Gy).At least 40 cells were analyzed in each sample.These results were repeated at least three times.*P<0.05，**P<0.01

2.7 TrKA抑制劑阻礙細(xì)胞的同源重組修復(fù)過程

RAD51及53BP1焦點(foci)數(shù)目的變化分別是細(xì)胞HRR和非同源末端連接(non-homologous DNA end joining，NHEJ)修復(fù)效率的評價指標(biāo)。為了探究TrKA抑制劑是否影響了HRR通路，本文通過免疫熒光檢測了不同處理組細(xì)胞核內(nèi)RAD51 foci數(shù)目的變化(Fig.9A)。第1組，DMSO處理，細(xì)胞核內(nèi)RAD51 foci的數(shù)目較少。第2組，4 μmol/L TrKA抑制劑處理細(xì)胞12 h，細(xì)胞核內(nèi)RAD51 foci的數(shù)目相比第一組未見顯著增多(P>0.05，F(xiàn)ig.9A-B)。第3組，10 Gy X射線照射細(xì)胞后釋放5 h，細(xì)胞核內(nèi)RAD51 foci的數(shù)目顯著增加(**P<0.01，F(xiàn)ig.9A-B)。第4組，4 μmol/L TrKA抑制劑預(yù)處理12 h，再用10 Gy X射線照射處理細(xì)胞后釋放5 h，細(xì)胞核內(nèi)RAD51 foci數(shù)目相比第2組顯著減少(*P<0.05，F(xiàn)ig.9B)，表明TrKA抑制劑阻礙了細(xì)胞的HR修復(fù)。

為了探究TrKA抑制劑是否影響了非同源末端連接修復(fù)通路，本文也檢測了細(xì)胞核內(nèi)53BP1 foci數(shù)目的變化。第一組，DMSO處理，細(xì)胞核內(nèi)53BP1 foci的數(shù)目較少。第二組，4 μmol/L TrKA抑制劑處理細(xì)胞12 h，細(xì)胞核內(nèi)53BP1 foci的數(shù)目相比第一組未見顯著增多(Fig.9A-C，P>0.05)。第三組，10 Gy X射線照射細(xì)胞后釋放2 h，細(xì)胞核內(nèi)53BP1 foci的數(shù)目顯著增加(**P<0.01，F(xiàn)ig.9A-C)。第四組，4 μmol/L TrKA抑制劑預(yù)處理12 h，再用10 Gy X射線照射處理細(xì)胞后釋放2 h，細(xì)胞核內(nèi)53BP1 foci數(shù)目相比第二組無顯著差異(Fig.9A-C，P>0.05)，表明TrKA抑制劑對細(xì)胞的NHEJ修復(fù)通路無顯著影響。

Fig.9 The TrKA inhibitor impairs the homologous recombination repair process in SKOV3 cells (A)SKOV3 cells were treated with 3 Gy or 10 Gy of IR, and immunostained with the indicated antibodies.RAD51(B)and 53BP1(C)foci were quantified as above.These results were repeated at least three times.*P<0.05，** P<0.01

3 討論

毫無疑問，PARP抑制劑的出現(xiàn)徹底改變了高級別漿液性卵巢癌的治療選擇，在 BRCA 突變或者HR缺陷的癌癥患者中看到了最大的臨床益處。盡管PARP抑制劑可以很好地治療具有HRR缺陷的腫瘤患者，但是越來越多的臨床結(jié)果表明，耐藥性的出現(xiàn)是一個急需解決的科學(xué)問題[28]。聯(lián)合用藥是克服耐藥性的一個有效途徑，目前也已經(jīng)報道了許多與PARP抑制劑聯(lián)合用藥的成功案例[29]。Lallo等人[30]將PARP抑制劑與Wee1激酶抑制劑結(jié)合起來治療非小細(xì)胞肺癌。Niraparib是一種口服選擇性PARP抑制劑，也是第一個被批準(zhǔn)用于BRCA基因無種系或體細(xì)胞突變卵巢癌患者的 PARP 抑制劑[31]。將Niraparib用于一線鉑類化療后的維持治療以及復(fù)發(fā)性高級別漿液性卵巢癌的治療，已經(jīng)是一個活躍的研究領(lǐng)域。

本文首先從379個小分子化合物中篩選得到了8個潛在的與PARP抑制劑具有合成致死效應(yīng)的小分子化合物。其中，煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶抑制劑(STF-118804)、乙醛脫氫酶抑制劑(disulfiram)與PARP抑制劑的聯(lián)用已被文獻(xiàn)報道。煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶可以通過調(diào)節(jié)組蛋白去乙?；负蚉ARP的活性，從而使腫瘤細(xì)胞對藥物治療產(chǎn)生抵抗[32]。PARP抑制劑Olaparib可以誘導(dǎo)溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(bromodomain-containing protein 4, BRD4)表達(dá)上升，增加乙醛脫氫酶的表達(dá)，從而促進(jìn)NHEJ修復(fù)，使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，因此，乙醛脫氫酶抑制劑與Olaparib可以產(chǎn)生較好的聯(lián)用效果[33]。

NTRK1擴(kuò)增作為一種發(fā)生在惡性黑色素瘤的致癌事件，與原發(fā)腫瘤的侵襲性相關(guān)[34]。NTRK是一種非常罕見的靶點，涉及NTRK基因的融合是已知的腫瘤發(fā)生驅(qū)動因素。針對這些極其罕見的、組成型激活的NTRK 融合的療法非常有效。盡管 NTRK 融合極為罕見，但是NTRK的其他改變，例如突變、拷貝數(shù)改變和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)增加影響約14%的癌癥患者[35]。在NTRK1基因的所有改變中，轉(zhuǎn)錄本融合是目前最具特征和最易于藥物處理的。DAVIDSON 等人對77例漿液性卵巢癌患者的組織進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)TrKA在晚期卵巢癌中高表達(dá)[27]。LAGADEC 等人通過細(xì)胞和小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，NTRK1的過表達(dá)增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生特性，表明NTRK1可能是乳腺癌治療的一個潛在靶點[36]。OKAMURA 等人[35]在對11 621例腫瘤病人分析后發(fā)現(xiàn)，NTRK1的變異主要包括擴(kuò)增和mRNA的過表達(dá)。Yu等人[37]通過對523例食管鱗狀細(xì)胞癌病人樣本進(jìn)行熒光原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)，NTRK1基因拷貝數(shù)的增加可能是食管鱗狀細(xì)胞癌患者無病生存期和總體存活的預(yù)后指標(biāo)。我們的研究結(jié)果同樣表明，TrKA抑制劑與PARP抑制劑的聯(lián)合使用會產(chǎn)生很好的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。TrKA抑制劑雖然不會對細(xì)胞造成DNA損傷，但是其會抑制損傷處理后細(xì)胞的修復(fù)能力。我們在后續(xù)的研究中可以通過敲低NTRK1基因或者建立NTRK1的基因敲除細(xì)胞系，檢測這些細(xì)胞是否對Niraparib具有更高的敏感性。此外，也可以利用裸鼠成瘤實驗，進(jìn)一步在小鼠體內(nèi)研究TrKA抑制劑和Niraparib的聯(lián)用對腫瘤的殺傷作用，為TrKA抑制劑由基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化提供更多依據(jù)。