高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中喹乙醇的不確定度評(píng)定

孫棟，王愛(ài)英，劉紅彩，劉沛生，陳愛(ài)景

(山東省淡水漁業(yè)研究院，濟(jì)南 250117)

喹乙醇又稱(chēng)喹酰胺醇，商品名為倍育諾、快育靈，是抗菌促進(jìn)生長(zhǎng)劑，具有促進(jìn)蛋白同化作用，可提高飼料轉(zhuǎn)化率、加快動(dòng)物生長(zhǎng)，對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌有一定的抑制作用，同時(shí)對(duì)四環(huán)素、氯霉素等耐藥菌株仍然有效，常用于治療養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)出血性敗血癥、療瘡病等[1-3]。研究表明喹乙醇具有遺傳毒性、生殖毒性、致畸突變毒性[4-6]，對(duì)人也有潛在的三致性(即致畸形、致突變、致癌)[7]。美國(guó)、歐盟禁止喹乙醇用作飼料添加劑。中國(guó)獸藥典2005 版規(guī)定喹乙醇禁用于35 kg 以上的豬和禽、魚(yú)等其它種類(lèi)動(dòng)物。為保障動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全，喹乙醇被列為開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和安全評(píng)價(jià)的重要獸藥殘留之一。

為評(píng)估測(cè)量方法的可靠性和測(cè)量結(jié)果的可信程度，需要對(duì)測(cè)量的不確定度進(jìn)行評(píng)定。通過(guò)分析不確定度的來(lái)源、分量大小，明確測(cè)定過(guò)程中各因素對(duì)測(cè)量結(jié)果不確定度的影響程度，進(jìn)而提高測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性[8-11]。對(duì)水產(chǎn)品中的喹乙醇進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果接近限量值時(shí)，對(duì)測(cè)定過(guò)程中的不確定度評(píng)定是判定樣品合格與否的重要依據(jù)。

筆者采用SC/T 3019—2004 《水產(chǎn)品中喹乙醇?xì)埩袅康臏y(cè)定 液相色譜法》[12]對(duì)水產(chǎn)品中的喹乙醇進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)JJF 1059.1—2012 《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》，對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 型，配紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器，C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

電子天平：(1) XP205 型，感量為0.01 mg/0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器上海有限公司；(2)BSA2202S 型，感量為0.01 g，德國(guó)賽多利斯股份公司。

喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度為97.89%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），擴(kuò)展不確定度為0.73%，批號(hào)為G 141461，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司。

甲醇、正己烷：色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司。

助濾劑：硅藻土，分析純，500 g/瓶，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純。

水產(chǎn)品樣品：鯉魚(yú)，養(yǎng)殖產(chǎn)地抽檢樣品，抽樣現(xiàn)場(chǎng)去魚(yú)鱗，取背脊肌肉絞成魚(yú)糜，冷凍保存。

實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

SC/T 3019—2004 《水產(chǎn)品中喹乙醇?xì)埩袅康臏y(cè)定 液相色譜法》。

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品10.22 mg，用甲醇稀釋至100 mL，配成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；取此儲(chǔ)備液10 mL，再用甲醇稀釋至100 mL；配成質(zhì)量濃度為10 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)使用液；分別取喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)使用液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，再用15%甲醇水溶液分別稀釋至100 mL，配成質(zhì)量濃度濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品溶液的制備

稱(chēng)取鯉魚(yú)魚(yú)糜樣品10.00 g 于100 mL 均質(zhì)杯中，加入助濾劑1 g、乙腈30 mL，均質(zhì)1 min，以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，將上清液倒入錐形瓶中，再加入20 mL 乙腈，重復(fù)提取一次，合并上清液；向提取液中加入正己烷10 mL，振蕩分層，棄去正己烷相，重復(fù)一次，將乙腈層轉(zhuǎn)移到旋蒸瓶中，于45 ℃水浴旋蒸除去溶劑，用1.0 mL 15%的甲醇溶液溶解殘留物，過(guò)0.45 μm 濾膜，置于2 mL 樣品瓶中，用液相色譜法檢測(cè)。

2 數(shù)學(xué)模型

3 不確定度來(lái)源分析與評(píng)定

參照文獻(xiàn)[13]對(duì)本測(cè)量過(guò)程的不確定度進(jìn)行評(píng)定。

3.1 不確定度來(lái)源分析

從數(shù)學(xué)模型和檢測(cè)過(guò)程分析，高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中喹乙醇?xì)埩袅康牟淮_定度來(lái)源，主要包括：(1)樣品稱(chēng)量質(zhì)量的不確定度，主要由天平的允差、重復(fù)性、分辨力和偏載誤差引入的不確定度組成；(2)樣品溶液體積引入的不確定度，主要由容量瓶容量允差、重復(fù)性和溫度變動(dòng)導(dǎo)致的不確定度組成；(3)樣品溶液濃度校準(zhǔn)過(guò)程引入的不確定度，包括標(biāo)準(zhǔn)溶液配制濃度的不確定度，以及用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)校準(zhǔn)計(jì)算出定容溶液中喹乙醇濃度所引入的不確定度；前者由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度，稱(chēng)量和配制、稀釋操作的不確定度組成；后者包含高效液相色譜法重復(fù)測(cè)定的不確定度；(4)測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度，由檢測(cè)過(guò)程中的提取、凈化、濃縮、定容、操作人員的熟練程度以及儀器本身性能等因素的影響而產(chǎn)生的。前3 項(xiàng)中由重復(fù)性引入的不確定度均已包含在總的測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度中，在評(píng)定各項(xiàng)不確定度時(shí)，不再分析重復(fù)性分量引入不確定度的貢獻(xiàn)大小。

3.2 測(cè)量不確定度分量的評(píng)定

3.2.1 樣品稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ms)

樣品質(zhì)量ms不可能直接測(cè)量給出，是通過(guò)2 次稱(chēng)量給出的，樣品容器質(zhì)量m0，按去皮鍵示值為零，樣品和容器質(zhì)量為m1，數(shù)學(xué)模型：ms=m1-m0；m1和m0是用同一臺(tái)電子天平測(cè)量的，是相關(guān)量；但是ms是m1和m0的差值，其系統(tǒng)偏差被抵消，是負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)接近-1)，因此，采用互不相關(guān)的合成規(guī)則(方和根)進(jìn)行合成[14]，質(zhì)量m1與質(zhì)量m0的標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定方法相同，二者不確定度評(píng)定結(jié)果相同。

感量為0.01 g 的電子天平最大允許誤差為±0.05 g，區(qū)間半寬度a=0.05 g，m測(cè)量值落在該區(qū)間的概率分布為矩形分布，包含因子k= 3，電子天平最大允許誤差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.2 樣品溶液體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vs)

制造商提供的1 000 μL 移液器容量允許誤差為±0.8%，按三角分布處理，包含因子k2= 6，容量允差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

以上不確定度分量互不相關(guān)，則樣品溶液體積引入的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.3 樣品溶液質(zhì)量濃度引入的相對(duì)不確定度urel(ρs)

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(ρm)。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(ρ0)。由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制數(shù)學(xué)模型式(2)可得出：標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度P、質(zhì)量m0和定容體積V0引入的。喹乙醇的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)純度為97.89%，不確定度為±0.73%，包含因子k=2。稱(chēng)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所用天平最大允許誤差為±0.05 mg，分辨力為0.01 mg，偏載誤差為-0.1 mg。使用100 mL 的容量瓶進(jìn)行定容，環(huán)境溫度(20±5)℃，相對(duì)濕度小于85%。A 級(jí)100 mL容量瓶的最大允許誤差為±0.10 mL[15]，區(qū)間半寬度a3=0.10 mL，其服從三角分布，包含因子k= 6[16]。容量瓶在室溫20 ℃檢定，標(biāo)準(zhǔn)溶液的定容在(20±5)℃條件下進(jìn)行。因?yàn)橐后w的體積膨脹系數(shù)遠(yuǎn)大于玻璃，因此只需考慮前者，甲醇的體膨脹系數(shù)為0.001 18/℃，產(chǎn)生的體積變化：±(100×5℃×0.001 18/ ℃)=±0.59 mL，則 區(qū) 間 半 寬 度a4=0.59 mL，按均勻分布，k= 3。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度P、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量m0和定容體積V0引入的不確定度各分量結(jié)果列于表1。則100 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度引入的不確定度分量

標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制是采用10 mL 刻度吸量管和100 mL 容量瓶進(jìn)行稀釋定容的；10 mL 分度吸量管(V1)容量允差為±0.05 mL，100 mL 容量瓶(V2)容量允差為±0.1 mL。按3.2.2 不確定度評(píng)定方法進(jìn)行評(píng)定，10 mL 刻度吸量管和100 mL 容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果列于表2。配制10 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)使用液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ρ10)由10 mL 分度吸量管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel，1(V1)、100 mL 容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel，1(V2)和urel(ρ0)三個(gè)分量合成：

表2 量器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由10 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)使用液配制1.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn) 溶 液，相 對(duì) 標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 度urel(ρ1.0)由urel，2(V1)、urel，2(V2)和urel(ρ10)三個(gè)分量合成：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：uc(ρ1.0)=0.011 mg/L。

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確 定 度 近 似 值[17]為u1(ρm)≈u(ρ1.0)/n≈0.002 1 mg/L(n為標(biāo)準(zhǔn)系列個(gè)數(shù)，n=5)

(2)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(ρz)。將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別上機(jī)測(cè)定3 次，結(jié)果列于表3。

表3 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜峰面積

假設(shè)由標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收值(以色譜峰面積表示)與濃度擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=bx+a，用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：y=44.033 16x+0.135 52，r=0.999 8，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度x，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得色譜峰面積的理論值ys，計(jì)算實(shí)際峰面積yi與理論值的殘差(yi-ys)，按貝塞爾公式計(jì)算求得殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

3.2.4 測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(X1)

喹乙醇樣品需經(jīng)過(guò)絞碎、稱(chēng)量、提取、凈化、濃縮、復(fù)溶等步驟后用液相色譜法檢測(cè)，由于受光照、溫度、人員操作、儀器誤差等因素的影響，每一步都會(huì)引入不確定度，包括樣品的均勻性和代表性、天平的重復(fù)性、定容體積的重復(fù)性等因素引入的不確定度，要依次確定每一步操作對(duì)測(cè)量結(jié)果不確定度的貢獻(xiàn)是相當(dāng)困難的，結(jié)合實(shí)際工作可采用檢測(cè)方法驗(yàn)證的重復(fù)性結(jié)果進(jìn)行評(píng)定。

3.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(X)和擴(kuò)展不確定度

3.4 測(cè)量不確定度報(bào)告

取95%置信概率，包含因子k=2，則水產(chǎn)品中喹乙醇測(cè)定結(jié)果：X=(0.080±0.002) mg/kg。

4 結(jié)論

對(duì)高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中喹乙醇?xì)埩袅康牟淮_定度來(lái)源進(jìn)行全面分析，將各不確定度的分量進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

(1)樣品溶液質(zhì)量濃度引入的不確定度為該方法不確定度的主要來(lái)源，其中，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)擬合引入的不確定度對(duì)測(cè)定結(jié)果不確定度的影響較大。其不確定度的大小，除了與標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)量重復(fù)性有關(guān)，還與測(cè)試樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度平均值的接近程度有關(guān)，二者越接近，產(chǎn)生的不確定度就越小，因此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍，測(cè)試樣品的定量結(jié)果盡可能在落在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的中間，應(yīng)適當(dāng)增加樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液平行測(cè)定次數(shù)(3～5 次為宜)；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)個(gè)數(shù)影響樣品的不確定度，適當(dāng)增加實(shí)驗(yàn)點(diǎn)將降低分析結(jié)果的測(cè)量不確定度。

(2)測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度的影響次之，在測(cè)定過(guò)程中，儀器設(shè)備的重復(fù)性引入的不確定度貢獻(xiàn)較大，為獲得較小的不確定度，在測(cè)量過(guò)程中選用符合檢測(cè)要求的儀器設(shè)備，同時(shí)增加平行檢測(cè)次數(shù)，尤其是高效液相色譜，通過(guò)增加樣品的重復(fù)測(cè)量次數(shù)達(dá)到減小不確定度的目的；除此之外必須嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，保持樣品在提取、濃縮、凈化等過(guò)程中的一致性，減少因環(huán)境和人員操作引入的偏差，并規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作。

(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程中，溫度誤差和容量允差對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)較大，尤其是使用體膨脹系數(shù)較大的有機(jī)溶劑稀釋時(shí)，溫度誤差引入的不確定度較容量允差顯著；因此在標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程中，控制室溫20 ℃，減小溫差，同時(shí)選用允差較小的量器。

(4)天平稱(chēng)量引入的不確定度：從天平的校準(zhǔn)、重復(fù)性、分辨力和偏載誤差四個(gè)方面評(píng)定天平稱(chēng)量引入的不確定度，對(duì)于分度值為0.01 g 的天平，允差對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)最大，對(duì)于分度值為0.01 mg 的天平偏載誤差貢獻(xiàn)最大；稱(chēng)量時(shí)，盡可能選用允差小的天平，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱(chēng)量應(yīng)考慮偏載誤差。

(5)用1 000 μL 的流動(dòng)相復(fù)溶殘留物，1 000 μL 量器的允差大小對(duì)該分項(xiàng)不確定度影響最大，故選用校準(zhǔn)的量器能減少該項(xiàng)不確定度。其它因素雖然影響較小，但仍需選取純度較高的標(biāo)準(zhǔn)品，使用A 級(jí)玻璃量具，定期對(duì)天平及液相色譜儀等儀器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)與校準(zhǔn)，進(jìn)一步提高試驗(yàn)操作的規(guī)范性與測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。