蛋雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和傳染性法氏囊病病毒混合感染的診斷

李汶蔓，韋 潼，吳文靜，姜鴻睿，王雪柯，郭格言，李德龍,2*

(1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460；2.西南大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院免疫學(xué)研究中心，重慶 402460)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染引起的急性傳染病，目前全國(guó)各地都有報(bào)道，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展[1-6]。禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)所引起的禽類傳染病[7]，根據(jù)致病性可分為高致病性和低致病性兩大類[8-9]。H9亞型為低致病性AIV，廣泛分布于全國(guó)各地[10]。禽傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是一種急性、高度接觸性傳染病，由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，ND、AIV和IBDV均有相應(yīng)的商品化疫苗，而且許多養(yǎng)殖場(chǎng)也將這3種病毒疫苗作為強(qiáng)制疫苗進(jìn)行免疫，但是近年來3種疫病仍在我國(guó)部分地區(qū)時(shí)有暴發(fā)，而且多呈混合感染[2,4-6,8]，因此仍有必要對(duì)3種疫病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和綜合診斷分析，以尋找防治疫病更好的措施。

2020年7月四川省內(nèi)江市某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)疫情，經(jīng)駐場(chǎng)獸醫(yī)診斷為IBD，緊急使用IBDV抗體治療，效果不佳，該養(yǎng)殖場(chǎng)將病雞送至西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院進(jìn)行診斷，通過臨床診斷及實(shí)驗(yàn)室檢查，最終確診為ND、H9亞型AI和IBD混合感染。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物與菌株 病雞由四川省內(nèi)江市某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)送至西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院進(jìn)行綜合診斷。大腸埃希氏菌DH5α由西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)公共衛(wèi)生與疾病控制實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、rTaq酶以及連接酶Ligation Mix等均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；膠回收及質(zhì)粒DNA純化試劑盒，生工生物工程有限公司產(chǎn)品；NDV和AIV抗原檢測(cè)卡(膠體金法)，深圳芬德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；高速臺(tái)式離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀，BIO-RAD公司產(chǎn)品；凝膠分析成像系統(tǒng)，上海天呈科技有限公司產(chǎn)品；恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋，國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；切片機(jī)，德國(guó)Leica公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 臨床診斷和膠體金法檢測(cè) 對(duì)雞場(chǎng)疾病流行情況及病死雞剖檢病變進(jìn)行詢問、觀察。按照深圳芬德生物技術(shù)有限公司的NDV和AIV抗原檢測(cè)卡(膠體金法)說明書，對(duì)病雞咽拭子樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 病理組織學(xué)診斷 尸體剖檢后采集心臟、肝臟、脾臟等各主要器官，100 mL/L福爾馬林溶液進(jìn)行固定，制作石蠟切片及HE染色，顯微鏡下觀察。

1.2.3 PCR檢測(cè) 采集病雞咽拭子、肝臟、法氏囊、脾臟，按常規(guī)方法勻漿，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液備用。根據(jù)NCBI NDV、AIV和IBDV的全基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)。提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 45 s,30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行膠回收。目的基因分別與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5α，37℃過夜培養(yǎng)，挑菌，搖菌，提取質(zhì)粒，送公司測(cè)序。

表1各病毒檢測(cè)引物序列

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)

2020年7月，四川內(nèi)江某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)4萬余只白來航蛋雞陸續(xù)發(fā)病。27日齡時(shí)，偶見零星死亡，無可見癥狀，抗生素治療無效。28日齡時(shí)死亡400余只，經(jīng)駐場(chǎng)獸醫(yī)診斷為IBD感染，使用IBDV抗體進(jìn)行緊急免疫，效果不佳，29日齡死亡500余只，2 d共死亡1000余只。

2.2 臨床檢查

送檢病雞精神沉郁，被毛粗亂，體型消瘦，伏地不起，少數(shù)站立但不愿走動(dòng)，叫聲低沉，肛周羽毛被糞便污染，拉黃綠色稀糞。

2.3 膠體金試紙條對(duì)新城疫和禽流感檢測(cè)結(jié)果

利用NDV和AIV膠體金進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，NDV和AIV均為陽性(圖1)。

圖1膠體金試紙條對(duì)新城疫和禽流感的檢測(cè)結(jié)果

2.4 剖檢病變

心臟血管怒張(圖2A)。肝臟體積輕微腫大，顏色呈暗紅(圖2B)。腎臟呈暗紅色(圖2C)。腿肌出血(圖2D)。腺胃乳頭輕度腫脹，刀刮有刮不凈的感覺(圖2E)。法氏囊體積腫大(圖2F)?？漳c淋巴濾泡和盲腸扁桃體腫脹，胰腺有針尖大白色壞死點(diǎn)。

2.5 組織病理學(xué)病變

心臟心肌纖維間有部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3A)。肝臟中央靜脈及部分肝竇內(nèi)充滿紅細(xì)胞(圖3B)。脾臟動(dòng)脈周圍淋巴鞘散在分布有紅細(xì)胞(圖3C)。肺臟三級(jí)支氣管內(nèi)充滿大量纖維素及炎性細(xì)胞(圖3D)。腎臟腎小管上皮細(xì)胞變性，壞死，間質(zhì)內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3E)。法氏囊囊小結(jié)內(nèi)細(xì)胞核濃縮，著色較深，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，部分囊小結(jié)周圍有異嗜性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3F)。空腸絨毛部分?jǐn)嗔?，固有層淋巴?xì)胞增多；盲腸部分絨毛斷裂，盲腸扁桃體內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量增多(圖3G，3H)。腦出現(xiàn)血管套現(xiàn)象，部分神經(jīng)元發(fā)生壞死，形成衛(wèi)星現(xiàn)象和噬神經(jīng)現(xiàn)象(圖3I)。腺胃固有層內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量增多(圖3J)。

A.心臟；B.肝臟；C.腎臟；D.腿肌；E.腺胃；F.法氏囊A.Heart; B.Liver; C.Kidney; D.Crureus; E.Glandular stomach; F.Bursa of Fabricius

2.6 PCR鑒定

提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，分別用NDV、AIV(2對(duì))和IBDV特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到4個(gè)片段，與預(yù)期目的基因大小一致(圖4)。將3個(gè)目的基因(535 bp、488 bp和720 bp)分別與pMD19-T載體連接后，轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌DH5α，挑取陽性克隆經(jīng)PCR鑒定后送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI Blast比對(duì)分析后顯示，3個(gè)片段分別與NDV(GenBank登錄號(hào)KF306265.1)、H9亞型AIV(GenBank登錄號(hào)MN759635.1)和IBDV(GenBank登錄號(hào)MT179721.1)相似性最高。

3 討論

根據(jù)流行病學(xué)特征、臨床檢查、剖檢診斷、病理組織學(xué)檢查和病原學(xué)檢查等綜合診斷，最終確定這是一起蛋雞ND、H9亞型AI和IBD混合感染病例。該養(yǎng)殖場(chǎng)病例發(fā)病急，發(fā)病率高，初期死亡率高，后期死亡率趨于穩(wěn)定，給養(yǎng)殖戶帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

在本病例中，養(yǎng)殖場(chǎng)已按照嚴(yán)格的蛋雞免疫程序進(jìn)行免疫，但依舊暴發(fā)疫情，分析其可能原因如下：其一，該場(chǎng)免疫程序陳舊，長(zhǎng)期以來未對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)周邊疫情進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，且按照舊程序進(jìn)行免疫后，未及時(shí)對(duì)雞群抗體水平進(jìn)行檢測(cè)；其二，該場(chǎng)基層獸醫(yī)診斷技術(shù)落后。在疫情暴發(fā)初期，由于養(yǎng)殖場(chǎng)基層獸醫(yī)診斷技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)不足，未能在第一時(shí)間對(duì)疫情進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷，只是單純用了一些常規(guī)抗生素進(jìn)行治療，雖然緊急使用了IBDV抗體，但是由于未進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，因此效果不佳，延誤了治病最佳時(shí)間，導(dǎo)致疫情在雞群中蔓延，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

A.心臟；B.肝臟；C.脾臟；D.肺臟；E.腎臟；F.法氏囊；G.空腸；H.盲腸扁桃體；I.腦；J.腺胃A.Heart; B.Liver; C.Spleen; D.Lung; E.Kidney; F.Bursa of Fabricius; G.Jejunum; H.Cecal tonsil; I.Brain; J.Glandular stomach

A.NDV PCR鑒定結(jié)果；B～C.AIV PCR鑒定結(jié)果；D.IBDV PCR鑒定結(jié)果；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.新城疫病毒；2.陰性對(duì)照；3.A型流感病毒；4.陰性對(duì)照；5.陰性對(duì)照；6.H9亞型AIV；7.H7亞型AIV；8.H5亞型AIV；9.法氏囊病毒；10.陰性對(duì)照

目前ND主要疫苗株為L(zhǎng)aSota弱毒株，基因型為Ⅱ型，而我國(guó)流行毒株主要是Ⅶ型[15]，流行株與疫苗株基因型不匹配，是造成臨床非典型癥狀多發(fā)的主要原因之一，而此次檢測(cè)到的NDV也是Ⅶ型，同樣說明存在這種情況。H9亞型AIV是一種低致病力AIV，家禽感染后通常情況下不會(huì)造成死亡，會(huì)有相應(yīng)的輕度流感癥狀產(chǎn)生。但是低致病性AI易伴隨ND、大腸埃希氏菌等發(fā)生繼發(fā)感染[16]。IBD是一種急性、高度接觸性傳染病，同時(shí)該病也是一種免疫抑制病，雞感染后會(huì)損傷法氏囊，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)降低，使疫苗免疫的效果降低，本研究檢測(cè)到的病例為ND、H9亞型AI和IBD混合感染，病原復(fù)雜，疫情緊急，又因養(yǎng)殖場(chǎng)疫苗免疫和臨床診斷等工作存在漏洞，導(dǎo)致病死雞數(shù)量較多，經(jīng)濟(jì)損失較大。

總之，養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)盡快盡早進(jìn)行周邊疫病的流行病學(xué)調(diào)查分析，按照本地實(shí)際情況制定適合本場(chǎng)的免疫程序，同時(shí)在免疫后，及時(shí)監(jiān)測(cè)雞群血清中的抗體水平；加強(qiáng)對(duì)基層駐場(chǎng)獸醫(yī)技術(shù)培訓(xùn)，以便在疫病發(fā)生初期進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確地診斷，對(duì)因?qū)ΠY治療，以免造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。