防御素的結(jié)構(gòu)與功能及其抗菌機制

楊江流，宋青山，喬軍偉，賈 芳*

(1.河套學(xué)院醫(yī)學(xué)系，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川 750021)

防御素是一類小的(約4 ku～6 ku)陽離子抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)，是多細(xì)胞生物先天免疫系統(tǒng)的一種進化保守成分，廣泛存在于真菌、植物以及無脊椎動物和脊椎動物中[1]。這些富含半胱氨酸的陽離子肽對大量的微生物具有直接或間接抗菌活性，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌等多重耐藥細(xì)菌。另外，防御素還在免疫調(diào)節(jié)、生殖發(fā)育、傷口愈合和癌癥發(fā)生調(diào)節(jié)中具有廣泛的作用[2]。

在過去的幾十年中，抗生素耐藥性的迅速和持續(xù)傳播對全球公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[3]。同時，抗生素耐藥性的迅速增長和全球擴張加速了開發(fā)新型抗菌劑的需求。防御素作為一大類抗菌肽，除了廣譜抗菌活性外，與傳統(tǒng)抗生素相比，防御素具有耐藥性出現(xiàn)較慢、對傳統(tǒng)抗生素耐藥的細(xì)菌具有活性以及調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的能力等優(yōu)勢，防御素被認(rèn)為是新型抗感染藥物的一個有希望的先導(dǎo)化合物[4-5]。本文綜述了不同來源防御素的結(jié)構(gòu)特征及其抗菌機制，以期為解決臨床耐藥問題提供參考。

1 防御素的結(jié)構(gòu)特征

1.1 脊椎動物防御素

脊椎動物防御素根據(jù)其分子內(nèi)二硫鍵的排列方式分為α、β和θ 3個亞家族，α-和β-防御素均由3個保守的分子內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定的3股反平行β-折疊片組成(即“防御素樣”拓?fù)湔郫B)[6]。α-防御素在中性粒細(xì)胞和小腸潘氏細(xì)胞的顆粒中以高濃度(毫摩爾)存在。成熟的α-防御素包含由2935個氨基酸殘基，形成X12CysXCysArgX23CysX3GluX3GlyXCysX3X5CysCysX14(X代表任一氨基酸)的一致序列，該序列具有9個高度保守的殘基(包括6個半胱氨酸、1個精氨酸、1個谷氨酸和1個甘氨酸)，半胱氨酸的二硫鍵連接方式位于Cys1-Cys6、Cys2-Cys4和Cys3-Cys5，高含量的陽離子殘基(賴氨酸，精氨酸)主要聚集在防御素的C-端附近，保守的精氨酸和谷氨酸之間形成的鹽鍵可抵抗中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的降解。迄今為止，已鑒定出6種人α-防御素，根據(jù)其表達(dá)模式和基因結(jié)構(gòu)不同，人α-防御素可進一步細(xì)分為髓樣肽或人中性粒細(xì)胞多肽(human neutrophil peptide，HNP)1～4和腸肽(human (enteric) defensins，HD)5和HD6[7]。HNP-1是研究最多的人α-防御素之一，二硫鍵對其活性至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，不含半胱氨酸的HNP-1類似物的抗菌活性比HNP-1低10倍～20倍。

成熟的人β-防御素(human β defensin，HBD)亞家族成員含有36個以上的氨基酸殘基，形成X210CysX56(G/A)XCysX34CysX913CysX47CysCysXn(X代表任一氨基酸)的一致序列，二硫鍵連接方式為Cys1-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6。β-防御素中的“防御素樣”拓?fù)湔郫B由N-端尾部形成的可變長度的α-螺旋段修飾[8]，該額外的α-螺旋相對于β-折疊片的方向由二硫鍵Cys1-Cys5維持，N-末端α-螺旋序列和長度的變異性與β-防御素的抗菌特異性相關(guān)[9]。β-防御素主要在上皮組織中表達(dá)，HBD-1被認(rèn)為是在上皮防御感染中更重要的AMP。HBD-1主要對革蘭氏陰性桿菌有效。與HNP-1相反，HBD-1在其二硫鍵減少后對厭氧革蘭氏共生細(xì)菌(雙歧桿菌和乳酸桿菌)更具活性[10]。

在人類中，只有α和β-防御素存在，θ-防御素是在一些非人靈長類動物的白細(xì)胞和骨髓中發(fā)現(xiàn)的AMPs，由2個截短的α-防御素(半防御素，9 個氨基酸)連接而成，含有3個二硫鍵連接的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Cys1-Cys6,Cys2-Cys5和Cys3-Cys4)，構(gòu)成動物體中唯一已知的環(huán)蛋白。

1.2 無脊椎動物防御素

無脊椎動物防御素是AMPs中分布最廣的一個家族。主要有2種類型的半胱氨酸配對，Cys1-Cys4、Cys2-Cys5和Cys3-Cys6(包括節(jié)肢動物、昆蟲和軟體動物防御素(牡蠣和鮑魚))以及Cys1-Cys8、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6和Cys4-Cys7(包含軟體動物(貽貝和牡蠣)和線蟲(蠕蟲))[11]。一些無脊椎動物防御素的三維溶液結(jié)構(gòu)的核磁共振波譜解析顯示，無脊椎動物防御素的核心結(jié)構(gòu)由1個α-螺旋結(jié)構(gòu)域和2個反平行的β-鏈組成，α-螺旋通過3個或4個二硫鍵穩(wěn)定在β-鏈上，形成半胱氨酸穩(wěn)定的α-螺旋β-折疊片模體結(jié)構(gòu)(cysteine stabilized αβ motif；CSαβ)[12]，形成了一個與脊椎動物防御素完全不同的三級結(jié)構(gòu)。一些抗真菌肽，如黑腹果蠅的果糖霉素含有額外的短N-端β-鏈，呈現(xiàn)出類似于植物防御素的βαββ花式結(jié)構(gòu)。

1.3 植物防御素

不同植物防御素抗菌活性差異較大，但是結(jié)構(gòu)基本相同。已知的所有植物防御素都具有4對二硫鍵的特征，并具有相同的半胱氨酸配對模式(Cys1-Cys8、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6和Cys4-Cys7)，植物防御素的基本結(jié)構(gòu)由 3條反向平行的β折疊片和1個α-螺旋在4對二硫鍵的連接下形成的βαββ花式結(jié)構(gòu)組成。其中在α-螺旋和β-折疊片上分別有1對二硫鍵固定，形成和真菌、無脊椎動物防御素相同的CSαβ模體結(jié)構(gòu)[13]，這可能使它們的抗菌作用具有高度特異性[14]。植物防御素具有一個額外的保守序列，即γ-核心模體結(jié)構(gòu)(序列為GlyXCysX39Cys)，這是其抗菌活性所必需的。雖然植物防御素具有共同的三級結(jié)構(gòu)，但氨基酸序列和肽段長度上存在的廣泛差異引起了抗菌活性的變化[15]。

2 防御素的抗細(xì)菌機制

2.1 膜透化作用破壞膜屏障

AMPs的經(jīng)典抗菌作用機制是損傷細(xì)胞膜[16]。膜靶向AMPs可以由受體介導(dǎo)(主要是細(xì)菌產(chǎn)生的抗菌肽)或非受體介導(dǎo)(大多數(shù)脊椎動物和無脊椎動物抗菌肽)的相互作用[17]。幾乎所有的AMPs都是陽離子和兩親性的，已使用模型膜和各種脂質(zhì)成分的單層囊泡研究證實，在革蘭氏陰性菌中，帶正電的高濃度陽離子防御素被靜電作用吸引到帶負(fù)電的細(xì)菌外膜的外小葉磷脂上后不斷聚集。當(dāng)防御素濃度小于閾濃度時，防御素分子平行吸附于脂質(zhì)雙分子雙層表面；當(dāng)防御素濃度達(dá)到閾濃度時，防御素分子垂直插入磷脂雙分子層疏水核心，防御素的雙親結(jié)構(gòu)(α-螺旋和/或β折疊)的疏水區(qū)與脂雙分子層發(fā)生構(gòu)想重排，在細(xì)菌膜上完成自組裝，形成跨膜孔(跨膜孔模型)或以類似洗滌劑(非孔模型)兩種方式破壞膜屏障[17]。例如，研究最多的人類α-防御素HNP-1采用濃度依賴性的方式產(chǎn)生二聚體與細(xì)菌膜的靜電相互作用，其中β-折疊的二聚體跨膜形成直徑為2.0 nm～2.5 nm的跨膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏[18]。

在所有的模型膜系統(tǒng)中，膜通透性取決于脂質(zhì)成分(磷脂的鏈長和電荷)。兩性磷脂或膽固醇是真核細(xì)胞膜的兩種主要成分，它們可減少宿主與防御素之間的相互作用，降低防御素對宿主細(xì)胞的毒性[12]。有研究表明，在足以殺死細(xì)菌的低微摩爾濃度范圍內(nèi)，許多人防御素幾乎不會損害體內(nèi)細(xì)菌膜的完整性，而是進入細(xì)胞質(zhì)干擾核酸和/或蛋白質(zhì)的合成[12]。細(xì)菌表面的一些保守分子是介導(dǎo)各種防御素特定殺傷機制的的明確靶點。例如，在革蘭氏陰性細(xì)菌中，防御素必須穿過外膜才能與細(xì)胞質(zhì)膜相互作用。該過程中，防御素與帶負(fù)電荷的脂多糖相互作用，導(dǎo)致連接相鄰脂多糖分子的二價陽離子(Mg2+,Ca2+)被置換，形成不穩(wěn)定的外膜區(qū)域，肽可通過該區(qū)域穿透外膜(“自我促進攝取”)[19]。這在脊椎動物防御素對抗革蘭氏陰性細(xì)菌中起著重要作用。

2.2 直接靶向脂質(zhì)Ⅱ抑制細(xì)胞壁生物合成

細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的合成途徑是多種抗菌化合物(如β-內(nèi)酰胺類、糖肽類抗生素)的作用靶點，其中一個突出的靶點是脂質(zhì)Ⅱ(肽聚糖組裝的基本亞單位)。與這些經(jīng)典抗生素相似，各種防御素也能通過直接靶向脂質(zhì)Ⅱ抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成[20]。真菌防御素菌絲霉素對一些革蘭氏陽性細(xì)菌(包括耐藥性的臨床分離株)具有強大的活性，研究發(fā)現(xiàn)，菌絲霉素在體外以1∶1的摩爾濃度比不可逆地結(jié)合到脂質(zhì)Ⅱ上，使脂質(zhì)Ⅱ無法與細(xì)胞壁生物合成酶相互作用，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞壁前體UDP-MurNAc五肽的積累，從而有效阻斷細(xì)菌細(xì)胞壁的合成?；贜MR的菌絲霉素脂質(zhì)Ⅱ復(fù)合物建模表明，菌絲霉素與脂質(zhì)Ⅱ的高親和性由脂質(zhì)Ⅱ焦磷酸基團和菌絲霉素的Phe2、Gly3、Cys4和Cys27之間形成的四個氫鍵，以及脂質(zhì)Ⅱ的谷氨酸側(cè)鏈與菌絲霉素的N-端和His18之間的鹽橋決定。這種結(jié)合可進一步促進細(xì)菌細(xì)胞膜上孔的形成和膜的破壞[21]。已有的報道中，HNP1和HBD3等抗菌肽也依賴于選擇性結(jié)合到脂質(zhì)Ⅱ上發(fā)揮抗革蘭氏陽性菌的活性。HBD3作用金黃色葡糖球菌后，導(dǎo)致細(xì)胞壁合成前體UDP-MurNAc五肽在細(xì)胞內(nèi)積累，15個細(xì)胞壁應(yīng)激刺激子基因中的13個基因表達(dá)上調(diào)。當(dāng)hBD3與脂質(zhì)Ⅱ的摩爾濃度比為2∶1時，防御素在體外可以完全阻斷金黃色葡萄球菌青霉素結(jié)合蛋白2的活性。hBD3還通過降低膜電位影響細(xì)菌的能量生成和膜轉(zhuǎn)運過程。

在體外，對真菌防御素米曲霉(來自米曲霉)、歐霉素(來自阿姆斯特丹曲霉)、無脊椎動物防御素(如來自綠蠅蛆的熒光素和牡蠣防御素家族cg-def)的研究也證明，這些肽能與脂質(zhì)Ⅱ直接靶向結(jié)合抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。

2.3 中和細(xì)菌分泌的毒素

防御素的另一抗菌機制是通過破壞細(xì)菌毒素的三級結(jié)構(gòu)和促進構(gòu)象轉(zhuǎn)變來滅活細(xì)菌。防御素是唯一公認(rèn)的能中和多種細(xì)菌毒素的快速反應(yīng)分子[22]。防御素能在體外和動物模型中有效地中和炭疽毒素，防御素是中和許多毒素(成孔毒素、酶毒素和其他毒素)通用的效應(yīng)分子，而許多毒素的進化和結(jié)構(gòu)彼此無關(guān)。這些細(xì)菌毒素大多數(shù)并不具有共同的結(jié)構(gòu)，具有高度多樣性和易變性，但許多細(xì)菌毒素共有的特性是其熱力學(xué)不穩(wěn)定。毒素對防御素失活的敏感性取決于其熱不穩(wěn)定性和構(gòu)象可塑性[22]，這與毒素形成宿主膜孔或穿過宿主膜所必需的構(gòu)象可塑性密切相關(guān)。已知被防御素抑制的最大毒素家族是成孔膽固醇依賴性細(xì)胞溶解素(cholesterol-dependent cytolysin，CDC)，它是許多革蘭氏陽性病原體產(chǎn)生的主要毒力因子[23]。HNP1-3和HD5通過多拷貝與單個CDC分子結(jié)合可以防止李斯特菌溶血素O、炭疽桿菌溶素O和肺炎鏈球菌溶解紅細(xì)胞，抑制活性需要3個二硫鍵穩(wěn)定的HNPs，而HNP4、HD6和β-防御素hBD1-3對同一毒素沒有抑制能力。研究發(fā)現(xiàn)，α-和θ-防御素通過增強CDC的去折疊狀態(tài)抵消其毒性[24]。在人α-防御素HNP1對霍亂弧菌MARTX(multifunctional autoprocessing repeats-in-toxin，MARTXvc)毒素的滅活過程中，作者評估了HNP1對MARTXvc半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(CPDvc)的自動加工活性和肌動蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu)域(ACDvc)的催化活性的影響。在有HNP1存在的情況下，ACDvc催化的肌動蛋白交聯(lián)的初始反應(yīng)速率被抑制。另外，HNP1還抑制了MARTXvc的自加工，CPDvc的催化活性也受到了抑制，MARTX二級和三級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)熱不穩(wěn)定以及局部去折疊狀態(tài)，導(dǎo)致毒素疏水殘基的溶劑暴露增加，從而使其易于聚集和水解[25]。

目前，只有少數(shù)防御素被證明具有滅活毒素的能力，而且大多數(shù)研究中只使用了少量或只有一種毒素。另外，毒素對防御素滅活敏感性的共同特征尚未完全確定，它們在毒素滅活機制中的作用尚待闡明。

2.4 在細(xì)菌周圍形成捕獲“納米網(wǎng)”

人腸道潘氏細(xì)胞α-防御素HD5和HD6在防御腸道內(nèi)經(jīng)食物和水傳播的病原體方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。與HD5和其他α-防御素相比，HD6缺乏直接的抗菌活性(即使?jié)舛雀哌_(dá)1 mg/mL)[21]。用HD6轉(zhuǎn)基因小鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)生理水平上表達(dá)的HD6轉(zhuǎn)基因小鼠在體內(nèi)可免受經(jīng)口服傷寒沙門氏菌(Salmonellaentericaserovartyphimurium，STM)的攻擊[26]。但和STM感染的HD5轉(zhuǎn)基因小鼠中不同的是，在STM感染的HD5轉(zhuǎn)基因小鼠中，從腸腔中恢復(fù)的存活的STM數(shù)量大大減少，但在HD6轉(zhuǎn)基因小鼠中，腸腔STM的存活率與感染的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙嗤?。研究發(fā)現(xiàn)，在HD6轉(zhuǎn)基因小鼠中，從腸腔到派爾斑(或聚集性淋巴結(jié)節(jié))和脾臟的STM轉(zhuǎn)移明顯受到抑制。這種保護作用依賴于HD6在小鼠腸道內(nèi)寡聚成被稱為“納米網(wǎng)”的延伸結(jié)構(gòu)。HD6最初與細(xì)菌表面蛋白附屬物(如沙門氏菌鞭毛和I型菌毛)結(jié)合形成作為觸發(fā)HD6納米網(wǎng)的錨定點，該錨定點觸發(fā)了一個動態(tài)有序的HD6自組裝過程，HD6二聚體通過二聚體-二聚體結(jié)合形成穩(wěn)定的四聚體(細(xì)長的HD6結(jié)構(gòu)重復(fù)單元)，從而形成圍繞和纏繞腸道沙門氏菌的原纖維和納米網(wǎng)(“成網(wǎng)”活性)誘捕腸道沙門氏菌，細(xì)菌隨后被免疫系統(tǒng)的中性粒細(xì)胞等成分殺死、清除或排出體外。這種發(fā)生在體內(nèi)的自組裝需要組氨酸-27的存在。X射線晶體學(xué)顯示組氨酸-27通過形成HD6單體多聚所需的必要鹽橋。Phe2和Phe29對于HD6的自組裝和生物功能都是必不可少的[27]。小腸潘氏細(xì)胞將HD6作為非活性的前肽儲存在顆粒中，在HD6釋放到腔內(nèi)的過程中以及在腸腔內(nèi)，HD6前肽(81-HD6)被胰蛋白酶水解生成成熟的32-HD6，從而發(fā)揮先天免疫功能。HD6具有廣譜的預(yù)防細(xì)菌入侵的能力，對革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì)菌沒有明顯的選擇性，也不偏好特定的細(xì)菌入侵機制[27]。這種獨特的機制表明，HD6在保護人類小腸免受多種腸道病原體入侵方面起著關(guān)鍵作用。

2.5 抑制細(xì)菌產(chǎn)生生物膜

微生物為了適應(yīng)周圍環(huán)境，會包裹在其自身分泌的胞外基質(zhì)中，在非生物和生物表面形成一種穩(wěn)定的三維網(wǎng)狀的生物膜結(jié)構(gòu)。生物膜是細(xì)菌產(chǎn)生的一個關(guān)鍵的毒力因子，它可以促進細(xì)菌在宿主表面定植，導(dǎo)致臨床感染和抗生素耐藥性，生物膜通過調(diào)控群體感應(yīng)系統(tǒng)、阻止宿主免疫因子和抗生素的擴散增加細(xì)菌對抗生素的耐受性。與其他AMPs一樣，防御素也表現(xiàn)出抑制細(xì)菌產(chǎn)生生物膜的功能。有人研究了HBD3在小鼠脛骨種植體耐藥菌生物膜感染模型中的作用機制，發(fā)現(xiàn)HBD3處理該模型后可顯著減少鈦表面完整菌落數(shù)量，抑制生物膜的形成和成熟[28]，而且通過在基因轉(zhuǎn)錄水平上抑制多糖的合成，降低了已存在的植入物表面的生物膜。在納摩爾濃度下，HBD2介導(dǎo)的生物膜抑制可能是由于HBD2嵌入細(xì)菌膜后，干擾GacS/GacA雙組份系統(tǒng)中的GacS后誘導(dǎo)小分子RNA，拮抗RsmA蛋白(一種干擾psl基因表達(dá)的翻譯抑制因子)表達(dá)，阻斷銅綠假單胞菌胞外多糖的產(chǎn)生[29]。HBD2還可能與信使分子環(huán)鳥苷二磷酸(c-diGMP)結(jié)合，導(dǎo)致外膜蛋白種類的改變，細(xì)菌膜表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變，干擾生物膜前體分子進入細(xì)胞外間隙的運輸，該過程不影響生物膜生成的調(diào)節(jié)。另外，HBD2還可能使蛋白轉(zhuǎn)移酶SecA和分揀酶的空間結(jié)構(gòu)離域，導(dǎo)致細(xì)菌菌毛的生物合成受阻，抑制生物膜的形成。蘿卜防御素RsAFP1和RsAFP2與卡泊芬凈對抗白色念珠菌生物膜具有協(xié)同作用，NMR研究發(fā)現(xiàn)RsAFP2也采用了植物防御素中典型的半胱氨酸穩(wěn)定的CSαβ模體結(jié)構(gòu)[30]。這一保守結(jié)構(gòu)使得RsAFP1和rRsAFP2具有與抗真菌藥物協(xié)同對抗白色念珠菌生物膜的潛力。近年研究發(fā)現(xiàn)，HD6也具有抑制白色念珠菌生物膜的形成，治療念珠菌病并發(fā)癥的作用[27]。

3 展望

盡管目前對防御素的研究仍存在許多未解決的問題，如防御素結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，防御素的促炎和抗炎活性之間的平衡，防御素的體外活性如何轉(zhuǎn)化并影響體內(nèi)細(xì)菌感染以及防御素實際應(yīng)用的可能性等，但防御素強大的抗菌活性和低分子質(zhì)量、低免疫原性、廣譜活性以及抗蛋白水解等特性，使得防御素非常適合作為一類具有廣泛活性的新型抗感染藥物用于治療[31]?？紤]到新的天然抗菌素的缺乏，合成AMPs將是一種非常有希望的治療候選制劑，而各種研究模型為評估防御素在細(xì)菌感染中的作用提供了有益的借鑒和參考。