阿拉爾市部分即食食品中單增李斯特氏菌分離鑒定和藥敏試驗

鄭雅雯，韓 慧，米熱依·奴爾沙熱普，巴合達吾列提·達吾列提汗，吳 靜

(塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾 843300)

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，LM)簡稱單增李斯特氏菌，是革蘭氏陽性短桿菌，可引起人獸共患病。單增李斯特氏菌對生存環(huán)境要求較低，可在低溫、高滲透壓環(huán)境存活，能夠在食品加工、運輸、冷藏等多個環(huán)節(jié)中繁殖。誤食被單增李斯特氏菌污染的食品后可引起敗血癥和腦膜炎，孕婦可引起流產(chǎn)[1-2]。世界衛(wèi)生組織(WHO) 將其列為僅次于大腸埃希氏菌、沙門氏菌和志賀氏菌的第四大重要食源性致病菌。近年來，由單增李斯特氏菌引發(fā)的食物中毒時有報道[3]，單增李斯特氏菌感染病死率較高[4-5]。低溫冷藏即食食品是單增李斯特氏菌主要傳染來源[6]。為了解阿拉爾市即食食品中單增李斯特氏菌的污染情況，2020年-2021年用隨機抽樣法采集阿拉爾市超市、農(nóng)貿(mào)市場及餐飲店等場所未食用的熟肉制品、生食蔬菜、沙拉和甜點等即食食品360份，用GB/T4789.30-2016定性檢測方法進行單增李斯特氏菌的分離培養(yǎng)、鑒定及小鼠致病性試驗，用圓紙片擴散法(K-B法)對分離菌株進行藥敏試驗，為本市即食食品單增李斯特氏菌風險評估及防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 單增李斯特氏菌增菌肉湯(LB1:每225 mL LB中加入 丫啶黃素3 mg/支 ，萘啶酮酸5 mg/支，LB2：每200 mL LB中加入 丫啶黃素5 mg/支，萘啶酮酸4 mg/支)， 杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；PALCAM瓊脂，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；單增李斯特氏菌生化鑒定管，青島日水生物技術有限公司產(chǎn)品；胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司產(chǎn)品；革蘭氏染液由塔里木大學獸醫(yī)微生物實驗室提供。

1.1.2 主要儀器 實時微生物生長分析系統(tǒng)，杰靈儀器制造有限公司生產(chǎn)；數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司生產(chǎn)；潔凈工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司生產(chǎn)；光學顯微鏡，Olympus公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 2020年5月至2021年2月從超市、農(nóng)貿(mào)市場和餐飲店分別采集即食食品各120份，共計360份,按樣品種類分熟肉制品、生食蔬菜(水蘿卜、黃瓜、西紅柿)和甜點各90份。采集時間為2020年5月、8月、11月和2021年2月，共開展4次，每次90份，每個采樣地點30份。樣品采集按照無菌操作要求采集，每份樣品重量不少于250 g，置于無菌袋，4 h內(nèi)送至實驗室檢測。熟肉制品、生食蔬菜(水蘿卜、黃瓜、西紅柿)和甜點心采用深層采樣法，檢樣為25 g，沙拉樣品攪拌均勻后，取25 g作為檢樣。

1.2.2 樣品中單增李斯特氏菌的分離與鑒定 按照文獻[7]定性檢測方法進行單增李斯特氏菌的分離培養(yǎng)與鑒定。以無菌操作取樣品25 g(mL)加入到含有225 mL LB1增菌液中,于30℃±1℃培養(yǎng)24 h±2 h,移取0.1 mL,轉(zhuǎn)種于10 mL LB2增菌液內(nèi),于30℃±1℃培養(yǎng)24 h±2 h。取LB2二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板,于36℃±1℃培養(yǎng)24 h～48 h,觀察各個平板上生長的菌落。把可疑菌落進行染色鏡檢并移植得到純培養(yǎng)，對純培養(yǎng)進行生化鑒定。

1.2.3 小鼠致病性試驗 用實時微生物生長分析系統(tǒng)進行單增李斯特氏菌生長曲線測定及濃度測定，制備1.0×1010CFU/mL對數(shù)期的菌懸液進行毒力檢測。取此菌懸液進行小鼠腹腔注射，每株菌注射2只，每只注射0.5 mL，觀察小鼠發(fā)病及死亡情況，并設置對照組，對照組小鼠注射0.5 mL滅菌生理鹽水。

1.2.4 單增李斯特氏菌藥敏試驗 用圓紙片擴散法(K-B法)測定單增李斯特氏菌對抗菌藥物的敏感性。

2 結果

2.1 不同類型食品中單增李斯特氏菌的帶菌情況

360份樣品中共分離出23株單增李斯特氏菌，總污染率為6.39%。每種食品均受到不同程度污染，其中熟肉制品污染情況最嚴重，為8.89%，生食蔬菜檢出率為7.78%，沙拉和甜點心檢出率相同，為4.44%(表1)。

表1不同類別即食食品中單增李斯特氏菌帶菌情況

2.2 不同采集地點單增李斯特氏菌的污染情況

在餐飲店中檢出李斯特菌數(shù)量最多為10株，陽性率最高為8.33%；農(nóng)貿(mào)市場檢出8株，陽性率6.67%；超市檢出5株，陽性率為4.17%，檢出率僅為餐飲店的一半(表2)。

2.3 不同采集時間單增李斯特氏菌的污染情況

2020年-2021年4個月進行樣品采集，對食品中單增李斯特氏菌檢出率進行統(tǒng)計(表3)。4個月中8月檢出率最高，為10.00%，5月檢出率次之，為6.67%)；11月和2月檢出率分別為5.56%和3.33%，各季度單增李斯特氏菌檢出率有明顯差別(表3)。

表2不同采集地點即食食品中單增李斯特氏菌污染情況

表3不同采集時間即食食品中單增李斯特氏菌污染情況

2.4 單增李斯特氏菌致病性

對小鼠腹腔注射菌懸液5×109CFU/只，每組2只共24組，其中1組是對照試驗。結果感染組小鼠1 d～3 d表現(xiàn)精神沉郁、行動緩慢、食欲低下，死亡7只,在3 d～6 d集中死亡了27只，總死亡率為83.3%,對照組均正常。

2.5 單增李斯特氏菌的耐藥性

對分離的23株單增李斯特氏菌進行11種抗菌藥物的藥敏試驗，結果顯示食品中分離株總的耐藥率為21.7%；主要對氯霉素、四環(huán)素、復方新諾明有耐藥作用，耐藥率分別為8.7%、8.7%、4.3%；對諾氟沙星、慶大霉素和氯霉素各有1株不敏感，對其他抗生素沒有耐藥性(表4)。

3 討論

采集360份食品樣本，檢測出單增李斯特氏菌陽性樣品23份，總檢出率為6.39%。不同食品種類檢出率差異較大，其中熟肉制品檢出率最高，為8.89%；其次為生食蔬菜，檢出率為7.78%；沙拉和甜點心檢出率較低，均為4.44%。不恰當?shù)睦洳匾矔鹄钏固鼐廴?，生食蔬菜檢出率也較高，為減少單增李斯特氏菌污染，熟肉盡量不要放冰箱太久，同時要注意冰箱定期消毒，刀具等規(guī)范使用，在食用動物性食品時盡量徹底加熱，生食的蔬菜也要清洗干凈[8]。不同采樣地點單增李斯特氏菌的污染狀況各不相同，餐飲店李斯特菌檢出率為8.33%，農(nóng)貿(mào)市場和超市分別為6.67%和4.17%。餐飲店檢出率為超市2倍。

表4即食食品中單增李斯特氏菌對11種抗菌藥物耐藥結果

本文對分離的23株單增李斯特氏菌進行藥敏試驗，結果顯示食品中的李斯特菌對四環(huán)素、氯霉素和復方新諾明有耐藥作用，對諾氟沙星、慶大霉素和氯霉素均有1株不敏感，其余藥物均為敏感，耐藥率最高的是四環(huán)素和氯霉素為8.7%，不同地區(qū)單增李斯特氏菌的耐藥情況不同。通過本次調(diào)查研究初步掌握了單增李斯特氏菌在阿拉爾市居民消費品中的污染狀況、分布特點、耐藥狀況、可能引起食源性李斯特菌病的重點食物種類及食品污染較高的場所，對本地區(qū)預防控制單增李斯特氏菌所引起的食源性疾病和指導食源性李斯特菌病的治療和控制具有重要參考價值。