鉤藤對肉雞源多重耐藥大腸埃希氏菌臨床分離株生物被膜的抑制作用

侯思夢，左景茹，吳 強，劉 俐，彭海飛，劉曉強*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.陜西省富平縣畜牧發(fā)展中心，陜西富平 711700)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)是臨床上分離率最高的革蘭氏陰性菌之一，屬于人類和動物腸道內(nèi)的正常菌群，也是一種條件性致病菌，一旦產(chǎn)生致病性，可導致腸道內(nèi)或腸道外感染，甚至引起死亡[1-3]。由于畜牧生產(chǎn)和獸醫(yī)臨床實踐中抗菌藥物的不規(guī)范使用，導致細菌耐藥性增加[4]。細菌生物被膜的形成是細菌耐藥機制之一[5]。生物被膜是指細菌在物體表面黏附并增殖，并將自身嵌入在由其所分泌的物質(zhì)形成的胞外聚合物所形成的一種高度水合的開放結構[6]。生物被膜具有獨特的三維結構，其耐藥性和環(huán)境適應性大大提升。生物被膜一旦形成，不僅難以去除，膜內(nèi)的細菌在停藥后仍可繼續(xù)生長繁殖，增加了治療難度[7]。鉤藤是一種傳統(tǒng)中藥，具有降壓、抗心律失常、鎮(zhèn)靜、抗血栓、抗癌等作用[8]。鉤藤堿具有抗菌活性，對多種腸道致病菌有抑制作用[9]。但目前有關鉤藤對動物源病原菌的抗菌作用及其生物被膜的作用鮮見報道，本研究以肉雞源耐藥性大腸埃希氏菌為研究對象，探討鉤藤對大腸埃希氏菌的抗菌效果及對其生物被膜的作用，為抗菌中藥的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 12株受試大腸埃希氏菌(1～12)，2018年5月～9月分離自陜西渭南地區(qū)3個不同規(guī)模的肉雞養(yǎng)殖場，經(jīng)前期鑒別培養(yǎng)基、革蘭氏染色鏡檢、細菌微量生化管分離鑒定及16S rRNA方法鑒定，且體外藥敏試驗證實12株受試菌均為對包含頭孢噻呋在內(nèi)的多種藥物耐藥的多重耐藥菌株。大腸埃希氏菌ATCC 25922，由獸醫(yī)藥理學研究室保存。

1.1.2 主要藥品及試劑 鉤藤，西藏自治區(qū)拉薩市雪域大藥房產(chǎn)品；酵母粉、胰蛋白胨，英國Oxoid公司產(chǎn)品；MH培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術有限公司產(chǎn)品；瓊脂粉，北京索來寶科技有限公司產(chǎn)品；結晶紫(分析純)，廣東光華科技股份有限公司產(chǎn)品；頭孢噻呋，大連美侖生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 液體加熱器，廣東潮安金石鎮(zhèn)柏源五金制品廠產(chǎn)品；臺式低速離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品；電子天平，上海天美天平儀器有限公司產(chǎn)品；多功能酶標儀，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；微生物培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥液的制備 采用水煎法制備。稱取粉碎后的鉤藤20 g，加入10倍量純化水，室溫浸泡過夜，煎煮1 h，用八層折疊的紗布過濾，收集濾液。再加入適量純化水，按上述方法煎煮過濾。重復3次。將3次的濾液合并，加熱濃縮至50 mL，分裝入10 mL離心管，4 000 r/min離心5 min，取上清液加熱濃縮至10 mL，得到濃度為1 g/mL的藥液，4℃保存?zhèn)溆?。頭孢噻呋配制為1 280 μg/mL的溶液，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測定 參照美國臨床檢驗標準委員會(CLSI)推薦的微量稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)，將MIC和高于MIC濃度的各個梯度的培養(yǎng)物0.1 mL，接種于MH瓊脂培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)18 h后觀察有無菌落形成，無菌落形成的相應孔中的最低藥物濃度即為鉤藤對大腸埃希氏菌的最小殺菌濃度(MBC)。以大腸埃希氏菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株，每個樣品重復3次。

1.2.3 鉤藤和頭孢噻呋聯(lián)合用藥時部分抑菌濃度的測定 取無菌96孔細胞培養(yǎng)板，采用棋盤法，在96孔細胞培養(yǎng)板的每孔中加入100 μL稀釋好的106CFU/mL的大腸埃希氏菌菌懸液。根據(jù)2.2中MIC值的測定結果，分別取2×MIC濃度的鉤藤和頭孢噻呋溶液50 μL，在96孔細胞培養(yǎng)板的橫列和縱列中倍比稀釋6～8個稀釋度，形成不同濃度組合的2種藥物混合液?；靹蚝笾糜?7℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18 h后觀察結果。部分抑菌濃度(Fractional inhibitory concentration,FIC)=聯(lián)合用藥時甲藥的MIC/單獨應用時甲藥的MIC+聯(lián)合用藥時乙藥的MIC/單獨應用時乙藥的MIC，F(xiàn)IC指數(shù)≤0.5時表示協(xié)同、>0.5～≤1表示相加、>1～≤2表示無關、>2時表示拮抗作用。

1.2.4 鉤藤對大腸埃希氏菌生長曲線的影響 取若干支試管，每管加10 mL LB液體培養(yǎng)基，每組設1/4×MIC、1/2×MIC、MIC、2×MIC等4個鉤藤濃度梯度組和未加藥對照組(鉤藤濃度為0)，再向每支試管加入對應菌液0.1 mL并混勻。立刻測定OD600nm值，之后每隔2 h 測定OD600nm值1次，以培養(yǎng)時間為橫坐標，以OD值為縱坐標繪制大腸埃希氏菌生長曲線。

1.2.5 大腸埃希氏菌生物被膜形成能力的測定 大腸埃希氏菌生物被膜的培養(yǎng)和測定參照文獻[10]。在無菌96孔細胞培養(yǎng)板中加入200 μL經(jīng)1∶100稀釋的菌液，每菌做6個復孔，以無菌LB培養(yǎng)液為空白對照，37℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束后，棄去培養(yǎng)液并用滅菌生理鹽水輕柔漂洗3次，洗去雜質(zhì)和浮游菌。然后在每孔加入200 μL甲醇，固定15 min后棄去甲醇，晾干。加入200 μL 1%結晶紫溶液染色5 min，用生理鹽水洗滌3次。洗去未結合的染液，晾干。每孔加入200 μL濃度為33%的冰醋酸，30 min后測定OD570nm值，試驗重復3次。依據(jù)ODc值(ODc等于空白孔的平均OD值+3倍的標準差)對生物被膜分類：OD≤ODc，無成膜能力(-)；ODc

1.2.6 鉤藤對大腸埃希氏菌生物被膜的影響 將鉤藤用LB培養(yǎng)液稀釋為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8 mg/mL的含藥溶液，分別取上述含藥溶液100 μL于96孔細胞培養(yǎng)板中，再加入菌液100 μL，作為試驗組，陽性對照孔只加入菌懸液，陰性對照孔只加入LB培養(yǎng)基，每個濃度的藥液作6個復孔。將頭孢噻呋用滅菌的純化水稀釋為512、256、128、64、32 、16、8 μg/mL的濃度，其余步驟與鉤藤試驗組處理方式相同。37℃培養(yǎng)48 h，再按1.2.5中的方法染色處理，用酶標儀測定OD570nm值，試驗重復3次。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 用SPSS 21.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，大腸埃希氏菌生物被膜定量分析結果均用“平均值±標準差”表示。顯著性檢驗采用ANOVA分析，P<0.05時判定差異顯著。

2 結果

2.1 鉤藤對大腸埃希氏菌MIC和MBC的測定

12株臨床分離菌株對頭孢噻呋均具有耐藥性，其MIC≥8 μg/mL。鉤藤對所有受試菌的MIC范圍7.8 mg/mL～125 mg/mL，MBC范圍15.6 mg/mL～250 mg/mL(表1)。

2.2 鉤藤和頭孢噻呋聯(lián)合用藥時FIC的測定

頭孢噻呋與鉤藤聯(lián)用時對受試菌的FIC值介于0.5～2，其中對4(30.8%)株受試菌的FIC≤0.5，呈現(xiàn)協(xié)同作用，8(61.5%)株受試菌的0.5

2.3 鉤藤對大腸埃希氏菌生長曲線的影響

加入不同濃度鉤藤的受試菌，從生長曲線可看出藥物處理組對數(shù)期和穩(wěn)定期OD600nm值均小于未加藥對照組(鉤藤濃度為0)，且濃度越高，OD600nm值越小。受試菌的對數(shù)生長期起始時間隨著藥物濃度增大而有所推遲(圖1)。

2.4 大腸埃希氏菌產(chǎn)生物被膜能力的測定

12株大腸埃希氏菌分離株均能生成生物被膜，其中中等產(chǎn)膜能力的4株(33.3%)，產(chǎn)膜能力較強的菌株有8株(66.7%)(表2)。

表1鉤藤和頭孢噻呋對大腸埃希氏菌的MIC、MBC和FIC值

圖1不同濃度鉤藤下耐藥性大腸埃希氏菌的生長曲線

2.5 鉤藤對大腸埃希氏菌生物被膜形成的影響

不同濃度的鉤藤對9株(69.2%，9/13)大腸埃希氏菌生物被膜的形成具有不同程度的抑制作用，對其余菌株生物被膜的抑制作用不明顯(表3)。頭孢噻呋對照組對13株大腸埃希氏菌生物被膜形成的影響結果見表4。不同濃度頭孢噻呋均可抑制分離菌株生物被膜的形成，頭孢噻呋幾乎不影響大腸埃希氏菌ATCC 25922生物被膜的形成。

3 討論

大腸埃希氏菌在環(huán)境中廣泛存在，能通過復雜的生存機制避免外部因素的影響[11]。生物被膜是是細菌為了適應周圍環(huán)境所形成的與浮游狀態(tài)相對應的存在方式，90%以上的微生物以生物被膜形式生長[12]。生物被膜形成后，細菌耐藥性比浮游菌提高10倍～1 000倍，還會緩慢向周圍環(huán)境釋放浮游菌引發(fā)慢性感染，從而導致持續(xù)性炎癥和組織損傷[13]。因此，尋找抑制細菌生物被膜形成的藥物迫在眉睫。

表2 12株大腸埃希氏菌生物被膜形成能力

表3鉤藤對多重耐藥大腸埃希氏菌生物被膜形成的影響

表4頭孢噻呋對多重耐藥大腸埃希氏菌生物被膜形成的影響

鉤藤為茜草科鉤藤屬常綠藤本植物，其主要成分包括生物堿、黃酮類、萜類、酯類等，其中鉤藤堿是鉤藤中含量較多，也是重要的活性成分[14]。目前國內(nèi)外對鉤藤的研究多涉及其活性成分研究、抗炎及對神經(jīng)系統(tǒng)的作用，缺乏對細菌生物被膜的研究。鉤藤對布魯氏菌、大腸埃希氏菌具有良好的抑菌活性[15-16]。本試驗受試分離菌株表現(xiàn)為多重耐藥性，而在本研究的藥物敏感性試驗結果顯示，鉤藤對臨床分離的耐藥大腸埃希氏菌具有良好的抗菌活性，且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度的依賴性。亞抑菌濃度的鉤藤即可抑制耐藥細菌的生長。MIC濃度的鉤藤幾乎可以完全抑制細菌的生長，與已有研究結論一致[16]。雖然MIC濃度比抗生素大，但使用抗生素容易產(chǎn)生耐藥性。本鉤藤不僅單用時對多重耐藥大腸埃希氏菌具有抗菌活性，與頭孢噻呋聯(lián)合應用時，對30.8%的受試菌株表現(xiàn)為協(xié)同作用，對61.5%的受試菌株表現(xiàn)為相加作用。

許多中藥對細菌生物被膜的形成有抑制作用[17-19]。抗生素和中藥聯(lián)合應用可以有效對抗細菌的生物被膜，并可減少抗生素用量和毒性，延緩耐藥性的產(chǎn)生[20]。本試驗中的12株受試分離菌株均具有中等強度產(chǎn)膜能力，其中強成膜能力菌株8株，在鉤藤對大腸埃希氏菌生物被膜形成的影響試驗中，鉤藤對于69.2%的受試大腸埃希氏菌生物被膜的形成具有抑制作用，并呈現(xiàn)濃度依賴性。鉤藤對于強成膜能力的大腸埃希氏菌的生物被膜具有較好的抑制作用，個別受試菌株的OD570nm值的變化會隨藥物濃度的提高而出現(xiàn)升高現(xiàn)象，其原因可能是鉤藤所含成分復雜，如生物堿類、黃酮類、萜類、酯類及多糖等，其中鉤藤堿具有抑菌作用，而其豐富的植物多糖則可能被細菌利用，進而影響其對生物被膜的抑制作用。

鉤藤對肉雞源大腸埃希氏菌臨床分離株有一定程度的抗菌活性，且能抑制大腸埃希氏菌生物被膜的形成，與頭孢噻呋聯(lián)合應用時，具有不同程度的協(xié)同抗菌作用，為解決畜禽養(yǎng)殖業(yè)大腸埃希氏菌的耐藥性提供科學依據(jù)。