鴨疫里默氏菌貴州分離株OmpA基因的克隆及生物信息學(xué)分析

馬光強，劉麗娟，陳國權(quán)，吳良濤，楊 均，劉軍澤，李瀟蒙，潘成文，周碧君*

(1.黔南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州都勻 558000；2.都勻市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州都勻 558000；3.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025)

鴨疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer，RA)為里氏桿菌科黃桿菌屬，革蘭氏陰性菌，能引發(fā)家鴨、野鴨、雛鵝、火雞等多種禽類發(fā)生以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎和腦膜炎為主要特征病變的急性或慢性、接觸性、敗血性傳染病[1-4]。該病是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)最主要的細菌性傳染病之一，患病鴨感染率及病死率高，生長緩慢，品質(zhì)下降，飼料報酬率低，治療難度增大，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[5]。用抗菌藥物是治療該病的主要措施，而濫用抗菌藥物致使RA易產(chǎn)生多重耐藥性，用疫苗免疫預(yù)防是比較安全有效的途徑[6]。

外膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜的重要成分，在維持細菌形態(tài)、調(diào)節(jié)物質(zhì)合成、跨膜轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答等方面具有重要作用[7-8]。外膜蛋白A(OmpA)是細菌外膜蛋白的主要成分，在維持細菌結(jié)構(gòu)的完整性、參與黏附侵襲宿主和逃逸宿主防御機制中發(fā)揮重要作用[9]。RA的OmpA包含6個EF-hand鈣結(jié)構(gòu)域和2個PEST結(jié)構(gòu)域，OmpA可能是潛在致病因子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[10]。Th4ΔOmpA對Vero細胞的黏附能力、血液載菌量和對雛鴨的致病力較親本株顯著下降，表明OmpA可能是RA的重要毒力因子[11]。OmpA有4個胞外環(huán)狀分子暴露在細胞表面且該蛋白基因序列高度同源，可能具備良好保守性與免疫原性，適合作為新型疫苗研制的候選蛋白[12]。為明確RA貴州分離株OmpA基因特性和遺傳特征，本試驗克隆OmpA基因并對其進行原核表達，分析其生物信息學(xué)功能，以期為進一步研究RA OmpA蛋白的功能和基因工程亞單位疫苗的候選蛋白篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 13株RA貴州分離株包括RA-SS-1-12于2018年-2019年分離于貴州省三穗縣，RA-AS-1于2019年分離于貴州省安順市，由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室分離保存；大腸埃希氏菌DH5α購自北京擎科生物科技有限公司；pMD19-T載體，購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑 無菌脫纖維綿羊血，南京便診生物科技有限公司產(chǎn)品；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；新生牛血清，浙江天杭生物科技有限公司產(chǎn)品；酵母粉和胰蛋白胨，OXOID公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA提取試劑盒和2×TaqPCR MasterMix，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；DL 2 000 DNA Marker、DL 5 000 DNA Marker、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase、連接酶Solution Ⅰ、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ，均為TaKaRa公司產(chǎn)品；Gel Extraction Kit膠回收試劑盒和 Plasmid Kit質(zhì)粒提取試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；氨芐青霉素，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海實驗儀器廠有限公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機，丹麥LABOGENE公司產(chǎn)品；雙人單面超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱和電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；全溫培養(yǎng)搖床，上海新苗醫(yī)療器械制備有限公司產(chǎn)品；多功能梯度PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品；Implen微量核酸測定儀，德國Implen公司產(chǎn)品；電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；顆粒制冰機，美國Grant公司產(chǎn)品；迷你離心機，丹麥Scanspeed公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中公布的RA Yb2株OmpA基因序列(登錄號：CP007204)，用Primer Premier 5.0設(shè)計1對特異性引物，上游引物為OmpA-F：5′-CGCGGATCCATGGACAAGGAGTTTATGTTG-3′(下劃線處為BamHⅠ酶切位點)，下游引物為OmpA-R：CCCAAGCTTTTATTTTCTTTTCTTTTTTACT ACT(下劃線處為Hind Ⅲ酶切位點)，預(yù)擴增片段大小為1 164 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2OmpA基因的克隆 應(yīng)用OmpA基因特異性引物，以13株RA貴州分離株基因組DNA為模板，PCR擴增OmpA基因。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 70 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物進行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3 載體構(gòu)建及測序 PCR產(chǎn)物用12 g/L瓊脂糖凝膠檢測分離，將目的DNA片段進行膠回收純化。pMD19-T載體用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，將回收的OmpA基因片段按pMD19-T載體說明書操作方法進行連接，連接反應(yīng)體系10 μL：Solution Ⅰ 5 μL，目的基因純化產(chǎn)物4 μL，pMD19-T載體1 μL，16℃連接過夜。取10 μL連接產(chǎn)物與100 μL大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細胞混合，冰上孵育30 min后42℃熱激45 s，迅速置于冰上作用3 min，加入890 μL LB液體培養(yǎng)基，37℃、160 r/min培養(yǎng)1 h進行復(fù)蘇。復(fù)蘇結(jié)束后取100 μL菌液涂布于含有Amp(終濃度為100 μg/mL)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑平板中的單菌落接種于5 mL含有Amp(終濃度為100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。以菌液DNA為PCR模板，按1.2.2中的PCR反應(yīng)體系進行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 用Blast(NCBI)和DNAStar軟件對13株RA貴州分離株OmpA基因序列與參考序列進行核苷酸同源性和遺傳進化分析(表1)；分別用在線軟件Protparam和Protscale分析預(yù)測RA OmpA蛋白的理化性質(zhì)及氨基酸組成和親水性；分別用在線軟件TMHMM server v.2.0和SignalP-5.0分析預(yù)測RA OmpA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽；分別用DNAStar軟件包Protean提供的Kyte-doolittle法、Karplus-schulz法、Emini法和Jameson-wolf預(yù)測RA OmpA蛋白B細胞抗原表位的親水性、柔韌性、表面可及性和抗原指數(shù)；分別用在線軟件SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測RA OmpA蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。

表1 RA參考株OmpA基因序列信息

2 結(jié)果

2.1 RA貴州分離株OmpA基因PCR擴增

以13株RA貴州分離株基因組DNA為模板，用RAOmpA基因特異性引物進行PCR擴增，經(jīng)電泳檢測。結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大小約為1 164 bp，與預(yù)期擴增片段大小相符(圖1)。

2.2 RA貴州分離株OmpA基因重組質(zhì)粒PCR鑒定

將構(gòu)建的13株RA貴州分離株OmpA基因重組克隆質(zhì)粒進行PCR鑒定，經(jīng)電泳檢測。結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物大小約為1 164 bp，與預(yù)期擴增片段大小相符(圖2)。

M.DNA標準 DL 2 000；1～12.RA-SS-1-12；13.RA-AS-1；-.陰性對照；+.陽性對照M.DNA Marker DL 2 000；1-12.RA-SS-1-12；13.RA-AS-1；-.Negative control；+.Positive control

M.DNA標準DL 2 000；1～12.RA-SS-1-12；13.RA-AS-1；-.陰性對照；+.陽性對照M.DNA Marker DL 2 000；1-12.RA-SS-1-12；13.RA-AS-1；-.Negative control；+.Positive control

2.3 RA貴州分離株OmpA基因重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ對13株RA貴州分離株OmpA基因的重組克隆質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，經(jīng)電泳檢測。結(jié)果顯示，得到大小約為2 692 bp的pMD19-T載體片段和大小約為1 164 bp的RAOmpA基因片段(圖3)。表明RAOmpA基因已成功插入pMD19-T克隆載體，且測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符。

2.4 RA OmpA基因同源性及進化分析

用DNAStar的MegAlign軟件，對13株RA貴州分離株OmpA基因序列與GenBank上登錄的RA參考株相應(yīng)序列進行核苷酸同源性比對和遺傳進化樹分析。結(jié)果顯示，13株RAOmpA基因核苷酸同源性為100%，與參考株OmpA基因核苷酸同源性為93.0%～100%；13株RAOmpA基因與GZ-RA8(KY399239)、GZ-RA9(KY399240)、GZ060302(EF408264)、SD-RA2018(MK676082)、Yb2(CP007204)株的同源性高達100%(圖4)。RA分離株OmpA基因遺傳進化樹分析發(fā)現(xiàn)，13株RAOmpA基因與參考株處于同一大分支，其中13株RAOmpA基因與SD-RA2018(MK676082)、Yb2(CP007-204)、GZ060302(EF408264)、GZ-RA9(KY399240)、GZ-RA8(KY399239)株處在同一小分支，親緣關(guān)系較近；與中國臺灣分離株TRa9(AY606222)處于較遠的親緣關(guān)系(圖5)。結(jié)果表明，13株RA貴州分離株OmpA基因高度保守。

M.DNA標準DL 5 000；1～12.RA-SS-1-12；13.RA-AS-1M.DNA Marker DL 5 000；1-12.RA-SS-1-12；13.RA-AS-1圖3 RA OmpA基因重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.5 RA OmpA蛋白理化性質(zhì)分析

RAOmpA基因開放閱讀框為1 164 bp，共編碼387個氨基酸，分子質(zhì)量約為41.8 ku，理論等電點(pI)為4.89，預(yù)測其蛋白分子式為C1840H2854N502O588S12；正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)45個，負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)58個；蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為20.58，推測該蛋白為穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為68.79，親水性的平均值為-0.552，推測該蛋白為親水性蛋白。用在線軟件ProtScale預(yù)測RA OmpA氨基酸序列的親疏水性，縱軸大于0為疏水區(qū)，分值越高疏水性越強；反之，小于0則為親水區(qū)。結(jié)果顯示，RA OmpA蛋白在第9位氨基酸分值最高(1.83)，具有最強疏水性；在第351位氨基酸分值最低(-3.21)，具有最強親水性。該蛋白除局部為疏水區(qū)域外，大部分均為親水區(qū)域，表明該蛋白屬于親水性蛋白，符合成為優(yōu)勢抗原的條件(圖6)。

2.6 RA OmpA蛋白跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測

用在線軟件TMHMM Server v.2.0、SignalP-5.0對RA OmpA蛋白的跨膜區(qū)域和信號肽進行預(yù)測分析。RA OmpA蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域(圖7)；此蛋白無信號肽，即為非分泌蛋白(圖8)。

圖4 RA OmpA基因核苷酸同源性分析結(jié)果

圖5 RA OmpA基因核苷酸序列的遺傳進化樹

2.7 RA OmpA蛋白B細胞抗原表位預(yù)測

用Protean軟件對RA OmpA蛋白的親水性、柔韌性、表面可及性和抗原指數(shù)進行分析。結(jié)果顯示，RA OmpA蛋白具有良好的親水性；柔韌性分布較為均勻；表面可及性和抗原指數(shù)偏高，且在61-73、125-132、233-244、264-275、344-354、380-387肽段表面可及性和抗原指數(shù)較高(圖9)。

圖6 RA OmpA蛋白親/疏水性預(yù)測結(jié)果

圖7 RA OmpA蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

圖8 RA OmpA蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果

圖9 RA OmpA蛋白B細胞抗原表位預(yù)測結(jié)果

2.8 RA OmpA蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用在線軟件SOPMA對RA OmpA蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析。結(jié)果顯示，該蛋白由59.17%(229/387)的無規(guī)則卷曲、18.86%(73/387)的α-螺旋、15.50%(60/387)的延伸鏈和6.46%(25/387)的β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成(圖10)。該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲為主，有利于與其周圍的極性環(huán)境相接觸，為抗原表位的形成創(chuàng)造了有利條件。應(yīng)用SWISS-MODEL在線軟件對RA OmpA蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析，該蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要包括無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符(圖11)。

圖10 RA OmpA蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

圖11 RA OmpA蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

3 討論

外膜蛋白A(OmpA)是革蘭氏陰性菌中外膜蛋白(OMPs)的主要成分，是介導(dǎo)細菌生物膜形成、真核細胞感染、抗菌藥物抗性和免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵毒力因子[13]。相關(guān)文獻表明，OmpA在參與RA黏附和侵襲宿主細胞以及誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答過程中起關(guān)鍵作用[11]。近年來，鑒于OmpA具有良好的免疫原性，將OmpA用于亞單位疫苗開發(fā)已成為當前研究的熱點。本試驗應(yīng)用分子克隆技術(shù)對13株RA貴州分離株OmpA基因進行克隆分析，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)13株RAOmpA基因片段大小均為1 164 bp，其同源性達100%；與參考株GZ-RA8、GZ-RA9、GZ060302、SD-RA2018和Yb2株的同源性高達100%，與文獻[14-15]研究結(jié)果一致。表明眾多RA血清型菌株均含有OmpA基因序列，且具有高度的同源性和保守性。

抗原表位也稱抗原決定簇，是指外源抗原分子激發(fā)免疫機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的最基本結(jié)構(gòu)，廣泛用于新型疫苗研制、單克隆抗體制備、診斷試劑和藥物開發(fā)等[16]。B細胞抗原表位是指抗原分子表面可被B細胞表面受體或抗體特異性識別并結(jié)合的化學(xué)基團[17]。隨著生物信息學(xué)與免疫信息學(xué)等交叉學(xué)科的快速發(fā)展和不斷成熟，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測和篩選蛋白的B細胞抗原表位已成為主要研究方法。應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測B細胞抗原表位一般包括3個參數(shù)，即親水性、柔韌性和表面可及性。親水性大小與B細胞抗原表位數(shù)量正相關(guān)，柔韌性強弱與B細胞受體結(jié)合能力正相關(guān)，表面可及性大小與B細胞受體識別并結(jié)合的難易程度正相關(guān)。本試驗應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對RA OmpA蛋白B細胞抗原表位進行預(yù)測，根據(jù)多參數(shù)綜合分析OmpA可能存在的優(yōu)勢抗原位點。預(yù)測結(jié)果顯示，OmpA蛋白在61-73、125-132、233-244、264-275、344-354、380-387肽段具有良好的B細胞抗原表位。表明RA OmpA蛋白具有較多的優(yōu)勢抗原表位結(jié)構(gòu)，可初步應(yīng)用于免疫學(xué)相關(guān)研究。本試驗結(jié)果為基于RA OmpA蛋白的亞單位疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。