HPLC法測定海南產(chǎn)白胡椒中胡椒堿的含量

馮真英,李嘉敏,吳春玲,葉少玲,陳文興,劉芳芳

(1.廣東醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院,廣東 湛江 524001;2.嶺南師范學院,廣東 湛江 524048)

市場上買賣的胡椒主要有黑胡椒和白胡椒,未成熟的胡椒果實經(jīng)過水煮、干燥、發(fā)酵、烘干后,果皮酶變后呈黑色,稱為黑胡椒;把胡椒成熟的果實在水中浸泡一個星期后,除種子外果皮、果肉等全部腐爛后脫落,洗凈后僅剩下種子,將種子干燥后可得到白胡椒[1]。白胡椒中含有多種生物堿,主要包括:胡椒堿A、胡椒油堿B及C、胡椒林堿、胡椒新堿等[2]。胡椒堿在白胡椒所含生物堿中占比最大,是胡椒的主要活性成分,胡椒的辛辣味也大部分源于胡椒堿[3],白胡椒果實中胡椒堿含量最高,根次之,再到莖,葉中沒有胡椒堿[4]。胡椒堿的分子式為C17H19NO3,相對分子質(zhì)量為285.33[5],其結構式如圖1所示。

圖1 胡椒堿結構式

白胡椒可以用于治療多種疾病,胡椒堿是白胡椒的主要有效成分,目前已知胡椒堿有抗氧化活性、抗腫瘤活性、抗抑郁活性,并且具有免疫調(diào)節(jié)、促進藥物代謝、減少炎癥的發(fā)生[6]及抗增殖[7]等作用。白胡椒中胡椒堿定量分析測定的主要方法有比色法、薄層紫外掃描法、紫外分光光度法[8-10],薄層紫外掃描法受到實驗室現(xiàn)有的儀器的限制,比色法操作相對復雜,而紫外分光光度法操作簡潔、快速,但是不夠精準,《中華人民共和國藥典》2020版規(guī)定可采用高效液相色譜法的方法測定胡椒堿中的含量,現(xiàn)在HPLC法越來越廣泛地應用于藥物分析中,在中藥定量分析檢測中具有簡便、快速、高效、靈敏等優(yōu)點,可為胡椒中胡椒堿含量測定提供有效的分析方法,現(xiàn)報道如下。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

實驗中所需儀器型號及廠家見表1。

表1 主要儀器

1.2 試劑和藥物

實驗中所需試劑和藥品見表2。

表2 主要試劑和藥物

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液

用分析天平稱取5.45mg胡椒堿對照品,置于棕褐色量瓶中,用體積分數(shù)為100%的乙醇溶解稀釋,定容至25mL,搖勻即得對照品母液。用1 mL移液管精密量取對照品母液1 mL,置于10 mL棕褐色量瓶中,用無水乙醇定容,搖勻,即得濃度為21.8 μg/ mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液

取過60目篩的胡椒粉0.25 g 置于25 mL棕色容量瓶,加入4 mL 85%乙醇,輕微晃動置乙醇全部潤濕胡椒粉,置于升溫至85℃水浴鍋中加熱回流1 h,提取1次,抽濾旋干定容于25 mL棕色容量瓶中,用濃度為100%的乙醇溶解稀釋,定容至刻度線處,搖勻,用1 mL移液管從25 mL棕色容量瓶中移取1 mL溶液加入到10 mL棕色容量瓶中,搖勻后,過0.45 μm微孔濾膜,即得。

2.2 色譜條件

色譜柱為KromasilC18色譜柱(4.6 mm × 250 mm× 5 μm);流動相是甲醇∶水(74∶26);流速是1 mL/min;紫外檢測波長是343 nm;柱溫箱溫度為30℃;進樣體積是20 μL。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

吸取對照品溶液20 μL及供試品溶液20 μL,按2.2項下色譜條件進行測定。結果胡椒堿的理論板數(shù)大于5000,與相鄰雜峰的分離度大于2.0,峰寬比較窄且為單一成分峰(見圖2),保留時間在10 min以內(nèi),適合快速分析。

圖2 HPLC色譜圖A-對照品溶液,B-供試品溶液,1-胡椒堿

2.4 線性關系考察

精密吸取胡椒堿對照品溶液0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6 mL至容量為10 mL的棕色量瓶中,用無水乙醇稀釋、定容并搖勻。吸取6份不同濃度的溶液各20 μL注入HPLC中,每一濃度測定三次。按照以上色譜條件測定峰面積,以峰面積作為Y軸(縱坐標),對照品濃度作為X軸(橫坐標),繪制標準曲線,計算相關系數(shù)和回歸方程。由表3可知,胡椒堿在13.08 ～78.48 μg/mL的濃范圍內(nèi)線性關系良好,線性方程為Y=156362X-67957。結果表明其相關程度高,能夠反映峰面積與濃度的關系(見表3)。

表3 胡椒堿對照品溶液濃度與峰面積

2.5 精密度試驗

精密吸取制作標準曲線中濃度為78.48 μg/mL對照品溶液20 μL,在相同的色譜條件下重復進樣5次,分別測定其峰面積,計算得相對標準偏差為0.22%,小于0.3%,說明儀器的精密性良好(見表4)。

表4 精密度試驗

2.6 重復性試驗

按供試品溶液制備的方法,共平行制備5份,進樣20 μL,依法測定峰面積值,結果RSD=3.35%,表明此法重現(xiàn)性較好(見表5)。

表5 重復性試驗

2.7 穩(wěn)定性試驗

取一供試品溶液,分別于0、2、4、6、8小時進樣測定,結果RSD=4.95%。小于5%,說明該樣品的穩(wěn)定性良好(見表6)。

表6 穩(wěn)定性試驗

2.8 加樣回收試驗

取5個10 mL棕色容量瓶,精確移取己知含量的重復性試驗第5份供試品溶液1 mL,然后從濃度為78.48 μg/mL對照品溶液中移取2.7 mL、2.7 mL溶液,分別置于第一、二號瓶中,從濃度為65.4 μg/mL對照品溶液中移取3.0 mL、2.55 mL溶液,分別置于第三、四號瓶中,從濃度為52.32 μg/mL對照品溶液中移取3.1 mL、3.2 mL溶液,分別置于第五、六號瓶中,按供試品制備測定加樣回收率,結果顯示用胡椒堿做外標測量胡椒堿含量時,RSD為2.46%,說明胡椒堿穩(wěn)定,胡椒堿少與其他物質(zhì)反應(見表7)。

表7 胡椒中胡椒堿加樣回收率

2.9 樣品含量測定

取白胡椒約1 g,精密稱定,按“2.1.2”項下方法進行處理,按“2.2”項下色譜條件測定,記錄胡椒堿的峰面積并按以下公式計算其含量:胡椒堿含量=(峰面積+67957)×稀釋倍數(shù)÷(156372×106×稱量質(zhì)量)×100%,最后得出白胡椒中胡椒堿的含量為3.4%。

3 討論

3.1 指標成分選擇

胡椒堿具有十分豐富的藥理活性,本文選用胡椒堿含量為指標,測定白胡椒中的含量,有利于科學評價白胡椒的藥用價值及質(zhì)量,為白胡椒的進一步研究分析提供技術支撐。本文采用的色譜條件,分離效果好,方法簡捷可靠,可用于胡椒堿的含量測定及控制白胡椒的質(zhì)量。穩(wěn)定性試驗中RSD為4.95%,數(shù)值較大,說明胡椒堿的穩(wěn)定性較差,要現(xiàn)提現(xiàn)測,縮短提取及檢測時間,提高試驗數(shù)據(jù)的可靠性。

3.2 流動相條件選擇

分析比較實驗所得數(shù)據(jù)可知,流動相比例為甲醇∶超純水=66∶34時,保留時間過長;綜合比較其余三組,最終確定色譜條件如下:KromasilC18色譜柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流動相∶甲醇-水(74∶26);流速:1 mL/min;檢測波長343 nm,柱溫:30℃;在上述色譜條件下,胡椒堿的保留時間為8.87 min,適合快速分析。

3.3 提取工藝的選擇

白胡椒中提取胡椒堿試驗影響最顯著的幾個因素是料液比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù),確定影響因素后,先后進行單因素考察,以胡椒堿提取率為指標,考察每一因素對胡椒堿提取率影響大小,通過實驗得出,白胡椒醇提胡椒堿實驗中,對胡椒堿提取率影響最顯著的幾個因素及影響因素顯著大小順序為:提取溫度>乙醇體積分數(shù)>料液比>提取時間,后經(jīng)過正交試驗、驗證試驗得出白胡椒中提取胡椒堿的最優(yōu)提取工藝為提取溫度85℃、料液比1∶16、乙醇體積分數(shù)85%、提取時間1 h。

3.4 建立含量測定的意義

現(xiàn)代藥理學研究表明,胡椒堿具備抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎、降糖、抗抑郁等廣泛的生物活性[11]。本試驗建立了白胡椒中胡椒堿的高效液相色譜的含量測定方法,以此進一步科學、系統(tǒng)開發(fā)白胡椒中胡椒堿的成分的提取純化,為其合理利用和臨床應用提供科學依據(jù)。

本實驗利用外標的HPLC測定海南產(chǎn)白胡椒中胡椒堿的含量,經(jīng)過穩(wěn)定性等方法學考察,證實該方法是可行的,在該條件下所測得的白胡椒中胡椒堿的含量為3.2%。